使用丙烯酰胺水凝胶的细胞功能的研究矩阵刚度的影响
August 10th, 2010
可以仿照下层刚度对细胞功能的影响在体外使用不同的符合标准的聚丙烯酰胺凝胶。
使用丙烯酰胺水凝胶模拟体内组织顺应性。这是通过首先生成反应性底盖衬片和硅化顶盖衬套来实现的。该程序的第二步是浇注并制备丙烯酰胺水凝胶。
该程序的第三步是将所选的细胞外基质蛋白交联到水凝胶上。该程序的最后一步是细胞的孵育和分析。最终，通过使用免疫荧光显微镜、实时定量 PCR 和蛋白质印迹进行分析，可以获得显示体外不同的细胞外基质依从性如何调节细胞行为的结果。
今天，我们将向您展示丙烯酰胺水凝胶的生成和使用程序。我们在实验室中使用该程序来研究我们的细胞外基质刚度调节细胞形态、细胞信号传导和增殖。那么让我们开始吧。
通过生成反应性盖玻片开始此过程。首先在 150 毫米培养皿的下半部分放置一层 Paraform。然后将最多 9 个高压灭菌器 25 毫米盖玻片转移到封口膜上，并用 1 毫升 0.1 摩尔氢氧化钠覆盖。
孵育盖玻片 3 分钟孵育后，用真空管路吸出氢氧化钠，在每个盖玻片上移液 0.5 毫升三种氨基分布的三甲基或三种 A-P-T-M-S。将盖玻片孵育 3 分钟，然后吸出三个 A-P-T-M-S。注意不要孵育太久，以免在盖子上形成泡沫。
治疗后滑倒。在同一盘子中用 20 毫升去离子水冲洗盖玻片一次。使用弯曲的镊子从培养皿中取出盖玻片，并将其处理过的一面朝向新的 150 毫米培养皿。
然后再次用去离子水清洗盖玻片，并将其放在摇杆上 10 分钟。孵育后，除去水并再洗涤两次。去除所有三种 A-P-T-M-S 非常重要，这样它就不会与戊二醛发生反应，并在用于戊二醛前 10 分钟留下浑浊的白色沉淀。
使用弯曲的镊子，将盖玻片转移到一个铺有 param 的干净培养皿中，并使用真空管吸出任何剩余的液体，然后用无菌去离子水中的 0.5 毫升 0.5% 戊二醛完全覆盖每个盖玻片，以交联三个 A-P-T-M-S 和聚丙烯酰胺凝胶。将盖玻片在化学罩中孵育 30 分钟。然后吸出戊二醛冲洗并再次用去离子水清洗盖玻片。
然后完全擦干盖玻片。将新的盖玻片添加到含有 10% 表面密封溶液的 50 mLFalcon 管中，溶于氯仿和岩石中至少 10 分钟。倒出表面密封溶液并风干。
盖玻片盖在生物安全柜中的 Kim 湿巾上，在那里准备水凝胶以开始水凝胶制备。使用弯曲的镊子将盖玻片反应面向上转移到已贴在生物安全柜表面的多联体上。确保盖玻片在多开成型表面上平整。
然后通过将少量 NHS 溶解在足够的甲苯中，在甲苯中制备饱和和羟基 CIN 助剂或 NHS 溶液。对于特定的实验，加入少量 NHS，直到 NHS 不再溶解。饱和溶液通常为浑浊和粉红色。
接下来，准备丙烯酰胺 BIS 丙烯酰胺水和 PS，以达到所需的丙烯酰胺百分比。按照书面方案中的说明将试剂添加到微量使用管中。然后一次 1 份。
添加 NHS 和 TM me。短暂并立即涡旋试管 将 3 到 5 块凝胶倒入生物安全柜中，每个盖玻片使用 140 微升。在凝胶开始聚合之前，快速将 SILICONIZED 25 mm 盖玻片放在每个凝胶的顶部。
添加顶盖衬片将使丙烯酰胺完全覆盖底盖衬片。在室温下孵育该三明治，直到丙烯酰胺聚合，以确定何时发生聚合。检查微量离心管中残留的丙烯酰胺溶液。
硬凝胶的聚合需要几分钟，软凝胶的聚合需要更长的时间。聚合发生后，戴上无菌手套小心地拿起三明治。然后从顶盖玻片上滑下，直到它悬垂在聚合凝胶上。
然后撬开盖子。滑下凝胶，丢弃顶盖玻片。将每个底部凝胶盖玻片（以下简称水凝胶）放入六孔板中。
接下来，在六孔板的每孔中加入 2 毫升磷酸盐缓冲盐水或 PBS。然后用 PBS 洗涤水凝胶，并在摇床上孵育 5 分钟。重复此洗涤两次。
开始实验时，用两毫升纤连蛋白溶液或其他细胞外基质蛋白覆盖每个水凝胶。将蛋白质在 4 摄氏度下在水凝胶上孵育过夜，使其与水凝胶共价结合，孵育过夜后吸出 ECM 溶液。然后在无血清培养基中用每毫升 1 毫克加热活化无脂肪酸牛血清白蛋白封闭未反应的 NHS，并在 37 摄氏度下孵育至少 30 分钟。
孵育后，用无菌 PBS 洗涤水凝胶一次。接下来，将细胞接种在含有胎牛血清的适当培养基中。到这里的水凝胶。
使用小鼠胚胎成纤维细胞。根据实验所需的细胞扩散和汇合程度，确定要接种在水凝胶上的细胞数。大约 10 到 5 个细胞，用于 western blot 和定量 PCR 分析。
然后在适合特定细胞类型的条件下孵育细胞。潜伏期之后。根据需要提取细胞蛋白或 mRNA。
将 100 微升裂解缓冲液液滴移到实验室工作台上的一张封损物上，每个液滴之间留出大约 2 到 3 厘米的距离。接下来，从孔中提起底盖玻片，小心地去除每个水凝胶。使用弯曲的镊子并将其细胞面朝下放在液滴的顶部。
将细胞与裂解缓冲液孵育整整 1 分钟。最后，取下盖玻片，将裂解缓冲液转移到微量离心管中。或者，在提取 RNA 时，将每块水凝胶转移到新的六孔板中，并在每孔中加入 1 毫升三唑。
孵育后，将凝胶孵育 3 分钟。取出三唑溶液以储存在微量离心管中。添加 A-P-T-M-S 后彻底清洗盖玻片是生产反应性盖玻片的重要步骤。
正确清洗和干燥的盖玻片没有任何沉淀残留物。A-P-T-M-S 会与戊二醛反应，产生白色浑浊沉淀。如果沉淀，则必须重复整个过程，因为盖玻片不再可用。
在水凝胶形成并用 ECM 蛋白包被后，接种过夜细胞。在硬质水凝胶上扩散的细胞与在软质水凝胶上扩散的细胞之间存在明显差异，这可以从染色中的无缺陷中看出，与软水凝胶相比，小鼠胚胎成纤维细胞在硬质水凝胶上的扩散程度更大。事实上，大多数附着在软水凝胶上的细胞会保持紧凑并且附着效率较低。
小鼠胚胎成纤维细胞中循环 D one mRNA 水平的代表性定量 PCR 结果表明，循环 D one 在刚性基质上显著上调，但在软基质上则不上调。这表明基质刚度在体外调节细胞周期进程。我们刚刚向您展示了如何产生水凝胶切断刚度，模拟体内生理条件 执行此程序时，重要的是要记住制作额外的反应性盖玻片，因为会发生事故和错误。
就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本研究使用聚丙烯酰胺水凝胶来调查基底刚度对细胞功能的影响。该方法包括创建具有不同顺应性的水凝胶以模拟体内组织条件。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生物材料
- 组织工程
背景
- 细胞行为受细胞外基质的机械性质影响。
- 聚丙烯酰胺水凝胶可以模拟生物组织的刚度。
- 理解这些相互作用对组织工程应用至关重要。
- 使用免疫荧光显微镜和PCR技术进行分析。
研究目的
- 在体外模拟体内组织顺应性。
- 评估不同细胞外基质顺应性如何影响细胞行为。
- 提供对细胞对机械刺激的响应的见解。
使用的方法
- 准备反应底部和硅化顶部盖玻片。
- 创建具有不同刚度级别的丙烯酰胺水凝胶。
- 将细胞外基质蛋白交联到水凝胶上。
- 使用免疫荧光显微镜、实时定量PCR和western blotting孵育和分析细胞。
主要结果
- 结果展示了细胞外基质顺应性如何调节细胞行为。
- 免疫荧光显微镜显示细胞形态的变化。
- 实时定量PCR显示与刚度相关的基因表达的变化。
- Western blotting确认了蛋白表达对基底顺应性的变化响应。
结论
- 基底刚度显著影响细胞功能。
- 聚丙烯酰胺水凝胶对于模拟组织顺应性是有效的。
- 研究结果对组织工程和再生医学有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Modeling tissue stiffness in vitro enables mechanistic de-risking of therapeutic targets by linking extracellular matrix compliance to cellular phenotypes. This approach supports target validation in fibrosis, oncology, and cardiovascular disease by providing disease-relevant systems that predict cellular responses to biomechanical cues. Integrating hydrogel-based platforms early in discovery improves predictive confidence and informs portfolio triage based on pathophysiological relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by assessing how matrix stiffness regulates cell signaling pathways involved in proliferation and fibrosis.
- Operational Value: Enable functional target validation using disease-relevant stiffness conditions that mimic in vivo microenvironments.
- Predictive Value: Support preclinical decision-making by identifying targets whose activity is modulated by extracellular matrix compliance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare standardized hydrogels coated with ECM proteins to create reproducible substrates for compound screening.
- Quantitative Outputs: Generate measurable endpoints such as gene expression (via qPCR) and protein levels (via Western blot) that correlate with stiffness-dependent phenotypes.
- Screening Scalability: Enable evaluation of pharmacological agents across a range of tissue-mimetic compliances to identify context-specific efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Model fibrosis, tumor stroma, and vascular stiffening conditions by tuning hydrogel elasticity to pathophysiological ranges.
- Translational Continuity: Bridge discovery and preclinical workflows by using consistent stiffness-defined systems across target validation and lead optimization stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Inform go/no-go decisions based on whether compound effects are preserved under physiologically relevant mechanical cues.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for mechanosensitive pathways in fibrosis and cancer.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking matrix stiffness to changes in cyclin D1 expression and cell cycle progression.
- Screening: Enables assay standardization through tunable hydrogel stiffness and consistent ECM protein coating for reliable compound response assessment.
- Analytics: Provides quantitative readouts via immunofluorescence, qPCR, and Western blotting to compare cellular responses across stiffness conditions.
- Translational Research: Connects early findings to preclinical models by using stiffness ranges that reflect diseased tissues such as fibrotic liver or tumors.
- Enterprise Reuse: Establishes a tunable, reusable platform for evaluating targets across multiple disease areas where ECM remodeling is a hallmark.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating matrix stiffness as a variable influencing cell behavior and target engagement.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hydrogel fabrication and protein crosslinking protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by de-risking targets early based on their responsiveness to biomechanical context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that maintain activity across physiological and pathological stiffness ranges.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterials preparation and surface chemistry for reactive cover slip generation.
- Depends on access to rheometry or AFM for stiffness validation and batch-to-batch consistency.
- Necessitates standardization of ECM protein coating and blocking steps to ensure uniform ligand presentation.
- Involves adaptation considerations when transferring the system to different cell types or 3D culture formats.
- Includes practical limitations such as hydrogel delamination if washing steps are insufficient or if glutaraldehyde crosslinking is incomplete.
