新鲜分离肾小球中足细胞的单通道分析与钙离子成像

本实验的总体目标是测量细胞内钙离子浓度在药物作用下的变化。通过该方法可估算足细胞中钙离子的基础水平，并评估新鲜分离肾小球整体中单个离子通道的活性。该过程首先通过腹主动脉灌流清除大鼠肾脏中的血液来实现。

接下来，取出肾脏并分离肾皮质，用刀片切碎。第三步，通过差速离心分离皮质中的肾小球。随后，分离得到的去核肾小球可直接用于电生理实验，或加载荧光染料后进行共聚焦钙浓度测定。

最终，这些方法使研究人员能够解析在施加各种试剂后细胞内钙处理的急性变化，并在单个离子通道水平上评估和操控钙电导。该技术相较于现有方法的主要优势在于，它使我们能够将足细胞作为完整分离的肾小球的一部分进行研究。我们的制备方法保留了足细胞的功能潜力。

它们保持附着在毛细血管上，并参与维持微环境的稳态，从而实际保存了肾小球滤过装置的主要结构。该技术的应用拓展了我们在正常与病理状态下的药理学筛选。在糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化或高血压等疾病中，足细胞对钙离子的调控机制在肾脏并发症的发生与发展过程中发挥着关键的调节作用。观察这些细胞对药物诱导的钙离子内流的反应性具有重要意义，且此类反应可被便捷地进行筛选。

在此操作中，VLA Hunka 将演示如何为以下实验步骤灌注肾脏。我将展示肾小球的分离和V型钳制电生理实验，GaN 博士将指导您完成共聚焦钙成像。开始该操作时，将麻醉后的大鼠置于温度可控的手术台上，在显微镜下沿腹部正中线做切口，暴露肾静脉（CVA）和主动脉。

接下来，将结扎线环绕腹腔干、肠系膜上动脉及其上方的腹主动脉。在肾动脉下方钝性分离腹主动脉，然后在其周围放置两道结扎线，但暂不结扎。

在结扎线之上夹住主动脉并结扎下方的线。随后，在夹子下方将连接至装有PBS的注射泵的聚乙烯导管插入主动脉，并用第二根结扎线固定导管。然后移除夹子并将它们结扎。

注入肠系膜动脉和腹腔动脉。以每分钟6毫升的速度，用预冷的磷酸盐缓冲液灌注主动脉3分钟。同时，在靠近肾静脉的下腔静脉处做一切口以减压。

三分钟后，停止灌注，切除并包埋肾脏，将其置于冰上的 PBS 溶液中。现在配制 30 毫升新鲜的含 5% BSA 的 RPMI 1640 培养基。

使用剃刀刀片和剪刀分离双侧肾脏的皮质，然后将其切碎至均匀。接着，将切碎的组织通过已预先浸泡在5%P-S-A-R-P-M-I溶液中的100目不锈钢筛网过滤。收集滤过液，并使其通过140目筛网过滤。

随后，使用预先浸泡过的200目筛网过滤从140目筛网收集的流穿液。弃去滤液，并用10至15毫升配制好的BSA-RPMI溶液洗涤上层筛网，收集筛网上方的肾小球。接着，将含有肾小球的BSA-RPMI溶液置于15毫升离心管中，放入冰上，静置最多20分钟，使肾小球沉降至管底。

在此步骤中，将5毫米×5毫米的盖玻片用分子量为70,000至150,000的多聚赖氨酸包被，并在加热板上干燥。接着，将实验溶液升温至室温，灌注膜片钳记录浴槽并填充移液管。轻柔混匀含有肾小球的溶液，然后将约50微升该溶液滴加至每个多聚赖氨酸包被的盖玻片上。

随后，将带有肾小球的玻璃碎片转移至膜片钳记录室，记录室预先充满Beth溶液。以每分钟3毫升的速度灌流1分钟，以清除未附着的肾小球，然后在细胞贴附模式下进行常规膜片钳记录。

现在将500微升肾小球组分分别加入每个0.5毫升的锥形管中，并加入纯红AM和Fluo-4 AM钙离子染料。接着，将试管置于旋转摇床上，在室温下孵育最多一小时。然后，用多聚赖氨酸处理玻璃盖玻片，并将其放置在70摄氏度的加热板上使其干燥。钙离子染料负载完成后，取100微升含有肾小球的溶液滴加至经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，使其在表面附着约五分钟。

然后将带有肾小球的盖玻片安装到成像室中，并以每分钟3毫升的流速灌注浴液，以去除未贴附的肾小球及残留染料。随后，将共聚焦激光扫描显微镜设置为488纳米激发波长，再将成像软件设置为所需的采集频率和分辨率。

接下来，在明场下找到肾小球。随后开启荧光信号的检测。之后，选择一个合适焦平面，并检查 flu oh four 和 firo red 通道上的荧光强度。

确保在明场下清晰可见肾小球。然后记录荧光素四和夫罗红信号的荧光强度变化。导入图像序列时，需将通道拆分，并使用超栈灰度模式。

在 Image J 软件中，通过分析工具路径打开 ROI 管理器窗口（Analyze → Tools → ROI Manager）。使用椭圆选区工具在 ROI 管理器中选择一个或多个感兴趣区域，并点击“Add”（T）按钮添加。然后选择背景区域，保存已选中的 ROI。

接下来，在对话框中每张切片框标记一行，然后在菜单选项结果中点击“确定”。设置测量参数，选择平均灰度值，并计算每个感兴趣区域（ROI）的像素强度值，这些值将分别以不同列的形式显示在结果窗口中。

对于每个 ROI，将各通道测得的 ROI 强度值复制到首选的数据分析软件中，并从每个时间点的每个数据点中减去背景强度值。随后计算 flu oh four 与 URA red 通道的强度比值，绘制每个 ROI 钙瞬变的点时间变化曲线。该图像显示了膜片钳移液管附着在大鼠肾小球表面的足细胞体上。

在电生理记录过程中，图像右下角可见部分被包裹的肾小球。此处展示的是在足细胞上进行细胞贴附式记录所获得的三磷酸类通道电流的代表性电流轨迹，用于测量细胞内钙离子浓度。肾小球被加载Fluo-4 AM以标记细胞内钙离子。

本视频展示了CIN和氯化锰对肾小球钙离子内流的影响。该图量化了单个足细胞在响应CIN和氯化锰时记录到的Fluo-4信号强度的变化。如预期所示，CIN引起荧光强度达到峰值，而氯化锰则淬灭荧光染料，导致荧光强度降至最低。

应用这些药物可使研究人员后续确定细胞内确切的钙离子浓度。本视频展示了10 µmol ATP对肾小球内钙离子浓度的影响。请注意，绿色Fluo-4荧光增强，同时红色Fu-Red荧光减弱，这表明细胞内钙离子浓度升高。

该技术为监测单个离子通道和单个细胞水平上药理学处理或其他操作后钙离子内流的变化提供了独特的机会。因此，考虑到目前存在多种可用的基因修饰啮齿类动物模型，该方法是一种非常强大的工具。观看本视频后，您应能充分理解如何在足细胞中进行钙离子浓度测定，以及如何开展电生理学实验，包括膜片钳实验，这些实验可联合使用，也可单独进行。

这些技术为深入了解足细胞在正常和病理条件下钙处理调控的机制提供了重要依据。