单通道分析和钙成像在新鲜分离的肾小球足细胞

足细胞内钙水平的变化是控制肾小球滤过功能的最重要手段之一。在这里，我们解释了一种高通量方法，该方法允许检测新鲜分离的肾小球足细胞中的实时钙处理和单离子通道活性。

该程序的总体目标是测量响应药物的细胞内钙浓度变化。估计钙的基础水平并评估足细胞中的单个通道活动，作为整个新鲜分离的肾小球的一部分。这是通过首先通过腹主动脉冲洗来清除大鼠肾脏中的血液来实现的。

接下来，收获肾脏，分离肾皮层并用剃须刀片切碎。在第三步中，通过差异 cing 分离皮质肾小球。之后，分离的斩首肾小球可以进行电生理实验或加载荧光染料并用于共聚焦钙浓度测量。

最终，这些程序使研究人员能够解决响应各种药物应用而引起的细胞内钙处理的急性变化，并在单离子通道水平上评估和纵钙电导。与现有方法相比，这种技术的主要优点是它允许我们研究足细胞作为整个离体肾小球的一部分。我们的制剂保留了足细胞的功能潜力。

它们保持附着在毛细血管上并参与环境中的体内平衡，这实际上可以保护肾小球滤过装置的主要部分。这项技术的意义扩展了我们的药理学筛选在正常和病理状态下，足细胞处理钙的机制在糖尿病肾病、局灶节段卵巢硬化症或高血压等疾病的肾脏并发症的发展和预防中起着重要的调节作用。观察这些细胞中钙内流对药物的反应性非常重要，这很容易筛选。

在这项准备工作中，VLA Hunka 将演示如何为以下程序冲洗肾脏。我将展示肾小球分离和 V 型钳电生理学，GaN 博士将指导您完成共聚焦钙成像。要开始此程序，请将麻醉大鼠放在温控手术台上 在显微镜下，在腹部做一个中线切口，以露出静脉 CVA 和主动脉。

接下来，将结扎线插入腹腔和肠系膜上动脉及其上方的腹主动脉周围。钝，解剖肾动脉下方的腹主动脉。然后在它周围放置两个连字，但不要连字。

夹住结扎线上方的主动脉并系上下线。之后，用聚乙烯管插入主动脉，该管道连接到夹子下方装满 PBS 的注射泵，并用第二根结扎线固定导管。然后取下夹子并结扎它们。

ME 肠动脉和腹腔动脉。以每分钟 6 毫升的速率将预冷的 PBS 注入主动脉 3 分钟。同时，在肾静脉附近的卡瓦静脉切开以缓解压力。

三分钟后，停止灌注，切除并包埋肾脏。将它们置于冰上的 PBS 溶液中。现在在 RPMI 1640 培养基中制备 30 毫升新鲜的 5% BSA。

使用剃须刀片和剪刀，分离两个肾脏的皮层，然后对它们进行 MIT 直到均匀。接下来，将切碎的组织推入预先浸泡在 5%P-S-A-R-P-M-I 溶液中的 100 目不锈钢筛子。收集流过并使其通过 140 mesh siv。

随后，使用预浸泡的 200 目 siv 过滤从 140 目筛子中收集的流出物。弃去滤液，用 10 至 15 毫升准备好的 B-S-A-R-P-M-I 溶液洗涤顶部筛子，并从筛子顶部收集肾小球。接下来，将含有肾小球 G 的 B-S-A-R-P-M-I 溶液放入 15 毫升两桶冰中，让肾小球沉淀物在管底部停留长达 20 分钟。

在此过程中，用分子量为 70， 000 至 150， 000 的聚赖氨酸涂覆 5 x 5 毫米的盖玻片，并在加热板上干燥。接下来，将实验溶液加热至室温，并填充膜片钳室和移液管轻轻混合含有肾小球的溶液。然后将大约 50 微升的 Mit 涂抹在每个聚赖氨酸涂层的盖玻片上。

之后，将带有肾小球的玻璃碎片移至膜片钳室。预装 Beth 溶液。以每分钟 3 毫升的速度灌注腔室 1 分钟以去除任何未附着的肾小球，然后在细胞附着模式下进行常规膜片钳记录。

现在将 500 微升肾小球组分放入每个 0.5 毫升锥形管中，并在上午 4：00 加入纯红 am 和 flu oh 钙染料。接下来，将试管放在旋转摇床上，在室温下放置长达 1 小时。然后用聚赖氨酸准备玻璃盖玻片，让它们在 70 摄氏度的加热板上干燥。钙模具加载完成后，将 100 微升含肾小球的溶液涂抹在涂有聚赖氨酸的盖玻片上，让它们粘在表面上约 5 分钟。

然后将附着的肾小球盖玻片安装到成像室上，并以每分钟 3 毫升的速度用浴液灌注它们，以去除未附着的肾小球和剩余的染料。然后，将共聚焦激光扫描显微镜设置为 488 纳米激发波长。然后将成像软件设置为所需的频率和分辨率。

接下来，在明场中找到肾小球。随后打开荧光信号的检测。之后，选择所需的焦平面并检查 flu oh four 和 firo red 通道上的荧光强度。

确保在明场中清楚地看到肾小球。然后记录 flu oh four 和 furor red 信号的荧光强度变化。要导入图像序列，请拆分通道并使用 hyper stack 灰度模式。

在 Image J 软件中，按照分析工具 ROI Manager 路径打开一个 ROI 管理器窗口。使用椭圆选择工具和 ROI 管理器中的 add T 函数选择一个或多个感兴趣的区域。然后选择背景中的区域并保存选定的 ROI。

接下来，在对话框中标记 One row per slice 框，然后单击菜单选项结果中的 ok。设置度量值。选择平均灰度值，并计算每个 ROI 的像素强度值，该值将在结果窗口中的单独列中显示。

然后对于每个 ROI，将每个通道的测得 ROI 强度值复制到首选的数据分析软件中，并从每个时间点的每个数据点中减去背景强度值。计算流感 oh 4 与 URA 红色通道的强度之比，之后绘制每个 ROI 的钙瞬变点时间变化。该图像显示了连接到大鼠肾小球表面氧化物体的膜片钳移液器。

在电生理记录过程中，可以在图像的右下角看到一部分封装的肾小球。这是来自足细胞上制造的细胞附着贴片的三重样通道活性的代表性电流轨迹，用于测量细胞内钙浓度。肾小球在凌晨 4：00 加载流感 oh 以标记细胞内钙。

该视频说明了 CIN 和氯化锰对肾小球钙内流的影响。该图量化了单个足细胞响应 CIN 和氯化锰而记录的 flu oh four 信号强度的变化。正如预期的那样，CIN 产生最大的荧光，氯化锰淬灭染料并产生最低的荧光强度。

这些药物的应用使研究人员能够稍后确定细胞内的确切钙浓度。该视频演示了 10 μmole a TP 对肾小球中钙浓度的影响。请注意，绿色 Flu O 4 荧光增加，红色 fu 红色荧光下降，这是细胞内钙浓度增加的原因。

该技术提供了一个独特的机会来监测药物治疗或其他作后单离子通道和单个细胞水平的钙内流变化。因此，考虑到多种可用的转基因啮齿动物模型，这种方法代表了一个非常强大的工具。观看此视频后，您应该对如何在足细胞中进行钙化测量以及电生理学有一个很好的了解，这些钳形实验单独使用在一起。

这些技术为正常和病理条件下足细胞钙处理的调节提供了深入和机械的见解。