海马神经元活动的可视化免疫组化空间后学习神经发育障碍的小鼠模型

以下实验的总体目标是检测 Grailed 两只敲除小鼠作为神经发育障碍模型的空间学习后海马 irk 磷酸化的变化。这是通过首先在 Morris 水迷宫中测试野生型和圣杯中的两只敲除小鼠来实现的。作为第二步，取出小鼠的大脑，并通过 viome 切割制备野生型和敲除小鼠的切片。

接下来，将野生型和敲除小鼠的脑切片进行免疫组织化学处理，并用于检测海马体中的磷酸化变化。结果显示，基于免疫组织化学染色的光学显微镜观察，野生型和圣杯两种敲除小鼠之间海马 RC 磷酸化的差异。这种方法允许识别在海马依赖性特殊学习任务（例如莫里斯水迷宫）后被激活的海马神经元的特定亚群。

当我们决定研究强调二级敲除小鼠（一种自闭症谱系障碍小鼠模型）分子缺陷的分子级联时，我们首先添加了这种方法的想法。首先，训练来自不同感兴趣背景的小鼠完成空间学习任务，例如 Morris Water Mae。在训练期结束时，按照随附文本协议中描述的训练方案，对小鼠实施安乐死，然后修复并取出它们的大脑。

准备好继续手术时，使用手术刀切除小脑。然后将大脑的其余部分直立地粘在颤音的支架板上。将大脑切成 20 至 40 微米厚的连续切片，贯穿整个背侧海马体。

将每个切片转移到装有 1 毫升 0.1 摩尔 PBS 的 24 孔板的一个孔中，将每只小鼠的 3 到 5 个背侧海马切片转移到 24 多孔板的孔中，每个板含有 500 微升 0.1 摩尔 PBS。用 500 微升 0.1 摩尔 PBS 充分洗涤每个孔中包含的切片，在室温下进行所有洗涤和孵育，轻轻搅拌，除非另有说明。在通风橱下，将切片在 40% 甲醇、1% 过氧化氢和 0.1 摩尔 PBS 中孵育 20 分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。

在 0.1 摩尔 PBS 中再洗涤 3 次后，将切片在 500 微升 0.2% Triton X 100 中孵育 5 分钟，同时在切片孵育期间，为整个实验准备足够的封闭缓冲液。然后去除可渗透溶液，并向每个溶液中加入 100 微升封闭缓冲液。将切片孵育一小时。

接下来，去除封闭缓冲液，并用磷酸化的细胞外调节激酶覆盖切片。一抗在封闭缓冲液中稀释 1 至 500。在 0.1 摩尔 PBS 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，第二天在 4 摄氏度下轻轻搅拌

在孵育过程中，每个切片与生物素偶联的二抗（在封闭缓冲液中稀释 1 至 250）在室温下孵育 1 小时。使用前至少 30 分钟准备 A BC 试剂，以便有足够的时间形成 Aden 和生物素复合物。用 0.1 摩尔 PBS 再洗涤切片 3 次后，加入 A、b、C 试剂，使其与样品一起孵育 45 分钟。

在下一组 PBS 中三次洗涤期间，根据制造商的规格在通风橱中制备 DAB 工作溶液，将 DAB 工作溶液分装在板中。然后将切片转移到含有 DAB 工作溶液的孔中，并缓慢旋转板，以使切片最大限度地暴露在溶液中。在显微镜上监测 DAB 反应，直到产生足够的信号。

在大约 2 到 5 分钟内，通过在 0.1 摩尔 PBS 中洗涤组织，以所需的颜色强度终止反应。在 PBS 中再洗涤 3 次后，将切片安装在明胶包被的载玻片上，并在室温下干燥至少 3 到 4 小时。风干后，转移载玻片放入通风橱中，依次将切片放入综合乙醇溶液中脱水 2 分钟，然后在 100% 二甲苯中清除载玻片 5 分钟。

盖上，使用安装介质滑入载玻片，然后将它们在通风橱中放置过夜，以便将载玻片干转移至配备有相机和 20 倍物镜的明场显微镜中。以 200 倍放大倍率从每个切片获取多个明场图像，覆盖背侧海马图像。每只动物 3 到 5 个切片。

此处显示的是野生型小鼠和磷酸化染色的 Grailed 双基因敲除小鼠的背侧河马 campi 区域的切片。细胞外调节学习依赖性神经元激活的可靠分子读数。这两只小鼠在处死前都经历了经典的海马依赖性空间学习任务方案，即莫里斯水迷宫。

在测试的最后一天，与野生型小鼠相比，Grailed 两只基因敲除小鼠表现出明显的空间学习缺陷。为了分析小鼠的脑切片，对海马体各个区域的阳性细胞总数进行了计数。在 CA 三参数层中，野生型小鼠的单位面积磷酸化 RK 阳性细胞明显多于敲除小鼠。

在 hili 和颗粒细胞层或 GCL 中发现了相反的结果。观看本视频后，您应该对如何研究以认知缺陷为特征的神经发育障碍的遗传和药理小鼠模型的海马脑切片上的磷制剂有很好的了解。该技术还可用于研究其他大脑区域的 irk 力公式变化，以及遵循与莫里斯水迷宫不同的认知行为任务。

不要忘记，使用 DIA 汽油可能会非常容易逃避，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的保护装置。