Name: 海马神经元活动的可视化免疫组化空间后学习神经发育障碍的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学习免疫组化技术检测小鼠海马神经元磷酸化变化，用于研究神经发育障碍模型中的空间学习依赖性神经激活模式。该方法适用于基因敲除和药理学模型。

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我们感谢特伦托大学CIBIO研究所和国家研究委员会神经科学研究所行政人员提供的协助。Giovanni Provenzano 的研究由维罗内西基金会（意大利米兰）提供的博士后奖学金资助。本工作由意大利大学与研究部（PRIN 2008 项目编号 #200894SYW2_002 和 PRIN 2010-2011 项目编号 #2010N8PBAA_002，授予 Y.B.）、特伦托大学（CIBIO 启动基金，授予 Y.B.）以及特莱顿基金会（项目编号 #GGP13034，授予 Y.B.）提供经费支持。

所有实验均符合欧洲共同体指令 2010/63/EU，并经意大利卫生部批准。
1. 动物护理、饲养与处理
<ol>
	<li>按照各机构动物护理指南的规定，使用小鼠进行所有实验操作。</li>
	<li>将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，自由摄取食物和水 随意摄取.</li>
	<li>将小鼠以每笼2-4只的方式群养于标准尺寸的聚碳酸酯鼠笼中，垫料为木屑，每周更换一次。</li>
	<li>使用年龄和性别相匹配的小鼠，因为在不同神经发育障碍小鼠模型中，疾病易感性可能随年龄和性别而变化。</li>
	<li>选择适当数量的动物以达到统计学显著性（行为学研究每种基因型至少10只小鼠，免疫组织化学实验每种基因型至少4只小鼠）。</li>
</ol>
2. 莫里斯水迷宫（MWM）
<ol>
	<li>使用圆形水箱（直径 100 cm，高度 50 cm）。
	<ol>
		<li>在水箱周围的房间隔板上放置一些视觉线索。</li>
		<li>将一个直径为 10 cm 的平台固定放置于水箱中四个假想象限之一的中心位置。在整个训练阶段的所有试验中，隐藏平台应始终保持在同一象限。</li>
		<li>用自来水注满水池，使平台高出水面 1 cm。水温应平衡至接近 22 °C；此步骤可能需要数小时。可加入热水以缩短水温平衡所需时间。</li>
		<li>加入约 1.5–2 L 白色无毒油漆，使水呈不透明状。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轨迹采集程序
	<ol>
		<li>使用标准 CCD 摄像头和视频采集卡设置 MWM 轨迹追踪系统。选择一种视频追踪系统，用于监测和分析路径长度、逃逸潜伏期以及在每个象限停留时间等多种变量。</li>
		<li>将实验区域划分为四个象限，并调整检测设置，以确保动物与背景之间在实时追踪时具有最佳对比度。</li>
		<li>设定平台所在区域。</li>
		<li>将单次试验最长时间设为 60 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MWM 测试
	<ol>
		<li>在行为测试开始前，让小鼠在无法看到水池或空间线索的区域适应 20–25 分钟。</li>
		<li>对每只小鼠进行为期 9 天的训练（每天连续进行两次试验，间隔 20–30 分钟）。</li>
		<li>打开计算机和摄像头，启动视频追踪系统软件。</li>
		<li>抓住小鼠尾巴将其放入水中，使其头部朝向水池边缘，起始位置从四个起点（北、南、东、西）之一开始。对每只小鼠而言，每次试验的起始位置应不同，并在试验间进行伪随机化。</li>
		<li>让小鼠游泳并寻找平台，最长持续 60 秒。一旦动物到达平台，允许其在平台上停留 20 秒。</li>
		<li>若小鼠未能在规定时间内找到平台，则轻轻抓住其尾巴，将其引导至平台，并让其在平台上停留 20 秒。每只小鼠完成全部两次试验后，用毛巾将其擦干并放回笼中。</li>
		<li>在训练期的每一天，重复相同的操作程序（步骤 2.3.4–2.3.6）。</li>
		<li>在第 9 天最后一次训练试验结束后，进行探测试验。</li>
		<li>将平台从水池中移除。</li>
		<li>让小鼠游泳并寻找平台位置，最长持续 60 秒。</li>
		<li>定期检查水温，确保其保持一致（22 °C），并清洁水池。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 灌注动物组织切片的制备
<ol>
	<li>在MWM实验结束时处死小鼠。根据当地和国际指南，每种基因型需取四只小鼠，在安乐死前进行麻醉。</li>
	<li>对动物进行经心脏灌注（用剪刀剪开右心耳以利放血，并将蝴蝶导管插入左心室进行灌注），先用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注4-5分钟，随后用含4%多聚甲醛的PBS灌注10-15分钟22。</li>
	<li>取出脑组织并在4%多聚甲醛中于4 °C下后固定至少12小时。</li>
	<li>将脑组织置于含有15 ml含0.02%叠氮化钠的0.1 M PBS的50 ml聚苯乙烯锥形管中，4 °C保存，待切片时使用。</li>
	<li>在振动切片前切除小脑。</li>
	<li>使用速干胶将脑组织直立粘附于振动切片机的持样板上，切面朝下。</li>
	<li>在适当的振动切片机上，沿背侧海马全程按顺序连续切割脑组织为20-40 µm厚的冠状切片。</li>
	<li>用毛笔收集振动切片，并转移至24孔板中，每孔含1 ml 0.1 M PBS。</li>
	<li>切片可短期保存于PBS中，或长期保存于含0.02%叠氮化钠的PBS中，4 ºC（组织最长可使用一年）。</li>
</ol>
4. 免疫组织化学
<ol>
	<li>将每只小鼠的3-5个背侧海马切片转移至24孔板中，每孔加入500 µl的0.1 M PBS。</li>
	<li>用500 µl的0.1 M PBS洗涤各孔中的切片（每次5分钟，&#160; 轻柔振荡，共3次）。</li>
	<li>通过将切片在含1% H2O2 的PBS中孵育20分钟（轻柔振荡），以淬灭内源性过氧化物酶活性。</li>
	<li>在0.1 M PBS中轻柔振荡洗涤切片（每次5分钟，共3次）。</li>
	<li>组织通透处理：将切片在含0.2% Triton X-100的PBS中孵育5分钟。</li>
	<li>在上述步骤（4.4；4.5）期间，配制足够的封闭缓冲液（含10%山羊血清和0.1% Triton-X100的PBS），用于整个实验（切片数量 × 100 µl × 3步）。</li>
	<li>注意：使用与二抗（生物素标记）同源的物种血清。</li>
	<li>将切片在封闭缓冲液（每切片100 µl）中室温（RT）孵育1小时（轻柔振荡），以阻断抗体的非特异性结合。</li>
	<li>将切片在封闭缓冲液稀释的一抗（pERK）中4 °C过夜孵育，轻柔振荡。</li>
	<li>在0.1 M PBS中轻柔振荡洗涤切片（每次5分钟，共3次）。</li>
	<li>将切片在生物素标记的二抗（1:250稀释）封闭缓冲液（与步骤4.6中相同）中室温孵育1小时，轻柔振荡。</li>
	<li>同时配制ABC试剂，因为亲和素与生物素在室温下至少需要30分钟才能形成复合物。</li>
	<li>根据试剂生产商的说明书配制所需体积的ABC试剂。</li>
	<li>在0.1 M PBS中轻柔振荡洗涤切片（每次5分钟，共3次）。</li>
	<li>将切片在ABC试剂中室温孵育45分钟。</li>
	<li>在0.1 M PBS中轻柔振荡洗涤切片（每次5分钟，共3次）。</li>
	<li>配制DAB工作液；所有涉及DAB的操作均须在通风橱中进行，因为DAB具有致癌性和致畸性。</li>
	<li>用塑料移液管将DAB溶液转移至新板中。</li>
	<li>将切片放入含有DAB工作液的板中，手动缓慢摇动板，使切片充分接触溶液。</li>
	<li>在显微镜下监测DAB反应，直至出现足够信号（2-5分钟）。</li>
	<li>当颜色强度达到理想程度时，用0.1 M PBS洗涤组织（每次5分钟，共3次）以终止反应。</li>
	<li>使用漂白剂在通风橱中过夜灭活残留的DAB底物溶液，并按照实验室规定进行处理。</li>
	<li>将切片在PBS中漂浮后贴附于明胶包被的载玻片上，然后在室温下干燥至少3-4小时。</li>
	<li>依次在50%、70%、95%和100%乙醇中各脱水2分钟，并在100%二甲苯中透明5分钟。</li>
	<li>用封片介质封片后置于通风橱中过夜干燥。</li>
</ol>
5. 细胞计数
<ol>
	<li>计数 pERK 阳性细胞，每只动物应分析背侧海马水平的三至五个脑切片。</li>
	<li>使用合适的显微镜以 200 倍明场放大倍数采集每张切片的多张图像，然后使用图像处理软件将其拼接成全景图像。</li>
	<li>使用 ImageJ 免费软件对转换为 tiff 格式的拼接图像进行细胞计数。</li>
	<li>在齿状回门区和颗粒细胞层内，使用两到三个大小为 100 × 100 µm 的计数框进行 pERK 染色细胞计数。</li>
	<li>细胞密度将以每个计数窗口（100 × 100 µm）中标记细胞的数量表示。</li>
	<li>进行统计学分析以评估不同基因型之间的显著差异。可使用商业软件进行 Student t 检验或 ANOVA 分析，随后进行适当的事后检验。统计学显著性水平设定为 p &#60;0.05。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

本文提供了一种pERK免疫组织化学实验方案，用于检测神经发育障碍小鼠模型En2-/-在莫里斯水迷宫（MWM）实验后神经元的激活情况。与野生型（WT）小鼠相比，En2-/-突变体在CA3亚区中pERK水平降低。与CA3亚区的结果不同，与野生型小鼠相比，En2-/-小鼠的门区（hilus）和颗粒细胞层（GCL）中pERK阳性神经元数量总体增加。这种ERK磷酸化水平相反趋势的可能解释在于，MWM后pERK的诱导机制具有亚区特异性。
该实验方案包含多个关键步骤，例如MWM数据的评估、脑组织固定、抗体的选择与校准、洗涤步骤、信号检测以及细胞计数过程。所有这些关键步骤都必须仔细操作，以确保获得高质量且可重复的结果。例如，若脑组织未充分固定（步骤3.2和3.3），在染色过程中切片容易撕裂。此外，在洗涤过程中切片任何阶段均不得干燥，以避免染色信号减弱。最后，如果使用与本文所述不同（见材料列表）的pERK抗体，则必须对抗体浓度和孵育时间进行优化，以确定最可靠且合适的实验条件。此外，为确保免疫组织化学实验结果的准确性和无偏倚性，MWM测...

神经发育障碍包括一组广泛且异质性的疾病，例如唐氏综合征、脆性X综合征（FXS）、雷特综合征、神经纤维瘤病、结节性硬化症以及自闭症谱系障碍（ASD），这些疾病的中枢神经系统（CNS）在产前早期即出现发育和成熟异常1。这类脑发育功能障碍可对运动功能、语言、学习和记忆过程造成深远且终身的影响。近年来，大量遗传和环境因素已被证实与神经发育障碍的发病机制相关2,3。尽管这些疾病临床表型背后的分子机制仍不明确，但上述发现已促使多种此类疾病的转基因小鼠模型被成功构建。在多个小鼠模型中已观察到学习与记忆缺陷，例如 Tsc1+/-、Tsc2+/-、Nf1+/- 和 En2-/- 小鼠2,4-7。神经发育障碍研究领域的一个重要挑战是明确导致学习与记忆功能障碍的细胞与分子过程。学习或记忆过程中激活的特定信号通路可诱导特定基因的转录，最终导致从头蛋白质合成。即刻早期基因（IEGs）的激活以及依赖蛋白质的突触修饰可在神经元活动和行为训练后迅速在脑内神经元中被诱导产生8,9。
神经纤维蛋白参与的信号通路缺陷已与神经发育障碍中的学习功能受损相关。神经纤维蛋白由NF1基因编码，该基因的突变可导致1型神经纤维瘤病，这是一种复杂的遗传综合征，其特征包括神经系统肿瘤、行为与运动发育迟缓以及认知障碍10。在仅于抑制性神经元中特异性敲除Nf1基因的杂合小鼠中，长期增强作用（LTP）的早期阶段存在缺陷，同时在MWM实验中表现出空间学习能力受损5,11,12。有趣的是，在该小鼠模型中，Nf1基因的缺失导致学习过程中抑制性中间神经元内的Ras信号通路过度激活，进而引起ERK磷酸化增加，最终导致这些神经元GABA释放异常增强5。
基于这些发现，行为任务后神经元活动的可视化为重建与神经发育障碍相关的特定神经环路提供了一种方法。本文所述的免疫组织化学方案旨在评估并定量分析具有认知缺陷的自闭症谱系障碍（ASD）小鼠模型在莫里斯水迷宫（MWM）实验后海马区ERK的磷酸化水平。MWM被广泛用于研究啮齿类动物依赖海马的空间学习与记忆能力13,14。我们选择ERK磷酸化作为任务依赖性海马学习的分子读出指标，因为已有研究表明ERK在学习与记忆形成中具有关键作用15。此外，ERK信号通路对发育中视觉皮层的经验依赖性可塑性至关重要16。最后，中枢神经系统中缺失两种ERK亚型之一（ERK2）的小鼠在认知、情绪和社会行为方面表现出显著异常17，提示ERK信号可能在诸如ASD等神经发育障碍的发病机制中发挥关键作用。
我们采用Engrailed 2基因敲除（En2-/-）小鼠作为神经发育障碍的模型。En2-/-小鼠表现出解剖学和行为学上的“自闭症谱系障碍（ASD）样”特征，包括前脑中间神经元的丢失18、ASD相关基因表达降低19、社交能力下降以及认知灵活性受损6,7,20。在En2-/-小鼠中，空间学习与记忆缺陷（如在莫里斯水迷宫（MWM）中检测到的缺陷）尤为显著6,7，可能与ASD患者中观察到的认知功能障碍相关21。此外，我们已证明，在En2-/-成年小鼠齿状回中，MWM中空间学习受损与神经纤维瘤蛋白表达减少以及pERK水平升高相关7。本文中，我们提供了在此ASD小鼠模型中，MWM实验后对pERK进行免疫组织化学表征的详细实验方案。

<table><tbody><tr><td>EthoVision XT 8</td><td>Noldus Information Technology</td><td></td><td>该软件平台并非必需 &amp;ndash; 市场上还有许多其他的行为分析软件。</td></tr><tr><td>蛋彩画颜料</td><td>Giotto - Fila集团子公司</td><td></td><td>白色液体，无毒，用于制备Morris水迷宫中的不透明水。</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>其他公司的等效型号也可使用。</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Sigma</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>用于载片封片前脱水过程中的乙醇梯度制备。</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR</td><td>66004-950</td><td>有毒——需在通风橱中使用。根据使用情况每月更换二甲苯。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;S2002</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma</td><td>H1009-100ML</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Abcam</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ABC试剂盒Vectastain&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>加入5 ml PBS，再加入2滴试剂A，混匀，然后加入2滴试剂B，再次混匀。</td></tr><tr><td>DAB过氧化物酶底物</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>加入 5 ml ddH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O：加入2滴缓冲液储备液并混匀；4滴DAB并混匀；2滴H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 并混匀。</td></tr><tr><td colspan="4">[页眉]</td></tr><tr><td>pERK 抗体</td><td>细胞信号转导技术&amp;nbsp;</td><td>4370</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔IgG抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&amp;nbsp;</td><td>稀释比例 1:250</td></tr><tr><td>SuperFrost 载玻片&amp;nbsp;</td><td>卡尔·罗斯</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma</td><td>317616</td><td>载玻片封片剂。可使用等效的封片剂。</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>&amp;nbsp;Zeiss&amp;nbsp;</td><td>Axio Imager.M2</td><td>可使用同等显微镜。</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe 系统公司，美国加利福尼亚州圣何塞</td><td></td><td>用于图像拼接。</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>免费软件可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 下载</td></tr><tr><td>SigmaPlot 11.0</td><td>Systat Software Inc. (USA)</td><td></td><td>可用于统计分析的等效软件。</td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software, Inc.（美国加利福尼亚州拉霍亚）</td><td></td><td>可用于统计分析的等效软件。</td></tr></tbody></table>

神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

磷酸化细胞外调节激酶（pERK）的诱导是反映学习依赖性神经元激活的可靠分子指标。本文中，我们描述了一种pERK免疫组织化学实验方案，用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中，经历空间学习任务后海马神经元激活的模式。具体而言，我们采用pERK免疫染色法，在Engrailed-2基因敲除（En2-/-）小鼠（一种自闭症谱系障碍（ASD）模型）中，研究其在莫里斯水迷宫（MWM，一种经典的海马依赖性学习任务）后的神经元激活情况。与野生型（WT）对照组相比，En2-/-小鼠在MWM中表现出显著的空间学习缺陷。MWM实验后，与WT动物相比，En2-/-小鼠特定海马亚区中pERK阳性神经元的数量出现显著差异。因此，本方案能够稳健地检测ASD小鼠模型中与海马依赖性学习障碍相关的pERK阳性神经元的变化。更广泛而言，该方案可用于研究各类具有认知缺陷特征的遗传性或药理学小鼠模型中海马神经元激活的模式。

本方案旨在通过免疫组织化学方法，在神经发育障碍小鼠模型中可视化莫里斯水迷宫实验（MWM）后海马神经元活动特异性标志物的表达。本文展示的所有实验数据均来自我们近期的研究工作7。实验使用由杂合子交配获得的野生型（WT）和 En2-/-成年同窝仔鼠（雌雄均有），年龄相匹配（3–5 个月龄；体重 = 25–35 g）。共使用 22 只小鼠（每种基因型 11 只）进行莫里斯水迷宫实验。其中 8 只小鼠（每种基因型 4 只）在莫里斯水迷宫探针试验结束后被处死，用于免疫组织化学实验。
En2 基因缺陷小鼠空间学习能力的评估-/- 小鼠 
为特异性检测 En2 中空间学习缺陷的存在情况-/- 小鼠，我们采用了莫里斯水迷宫（MWM）测试，一种经典的依赖海马的空间学习任务13,14在训练试验的第1天，En2组之间在游泳潜伏期和游泳速度上均未检测到差异。-/- 以及WT小鼠，表明两种基...

我们描述了一种免疫组织化学实验方案，用于研究在具有神经发育源性认知缺陷特征的小鼠模型中，经历空间学习任务后海马神经元激活的情况。该方案可应用于具有认知缺陷的遗传性或药理学小鼠模型。

诱导磷酸化细胞外调节激酶（pERK）是反映学习依赖性神经元激活的可靠分子指标。在此，我们……

以下实验的总体目标是利用格雷尔2基因敲除小鼠作为神经发育障碍的模型，检测空间学习后海马区irk磷酸化水平的变化。首先，通过莫里斯水迷宫实验对野生型小鼠和格雷尔2基因敲除小鼠进行行为测试；随后，取出小鼠脑组织，利用切片机对野生型和敲除型小鼠的脑组织进行切片制备。接下来，对野生型和基因敲除小鼠的脑切片进行免疫组织化学处理，用于检测海马体中磷酸化水平的变化。结果显示，基于免疫组织化学染色的光学显微镜观察，野生型小鼠与grail two基因敲除小鼠在海马体RC磷酸化水平上存在差异。该方法可用于鉴定在依赖海马体的特殊学习任务（如莫里斯水迷宫）后被激活的特定海马神经元亚群。在决定研究自闭症谱系障碍小鼠模型——即二级基因敲除小鼠中潜在分子缺陷的分子级联反应时，我们首次提出了本方法的设想。首先，对来自不同遗传背景的小鼠进行空间学习任务训练，例如 Morris 水迷宫实验。按照文末附带的文字版实验方案所述的训练程序进行操作，在训练期结束后对小鼠实施安乐死，随后固定并取出其脑组织。当准备继续操作时，使用解剖刀切除小脑。然后将剩余脑组织直立地用超级胶水固定在振动切片机的持样板上。在整个背侧海马区域，将脑组织切成20至40微米厚的连续切片。将每个切片转移至一个24孔板的孔中，每孔含有1毫升0.1摩尔的PBS；每只小鼠转移3至5个背侧海马切片至24孔板的孔中，每孔含有500微升0.1摩尔的PBS。用500微升0.1摩尔的PBS洗涤每个孔中的切片，所有洗涤和孵育步骤均在室温下进行，并轻轻振荡，除非另有说明。在通风橱内，将切片置于含40%甲醇和1%过氧化氢的0.1摩尔PBS溶液中孵育20分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。在 0.1 摩尔 PBS 中再清洗三次后，将切片置于 500 微升 0.2% Triton X-100 中孵育 5 分钟以进行透化。在切片孵育的同时，准备足量的封闭缓冲液用于整个实验。随后吸除透化液，向每个样本中加入 100 微升封闭缓冲液，孵育 1 小时。接着，移除封闭缓冲液，并用磷酸化细胞外调节激酶覆盖切片。将一抗用封闭缓冲液按1:500比例稀释后加入。在四度 Celsius 下轻轻振荡孵育过夜，次日用0.1摩尔PBS洗涤切片三次，每次五分钟。在室温下孵育1小时，期间将各切片与以封闭缓冲液按1:250稀释的生物素标记的二抗共同孵育。使用前至少30分钟配制ABC试剂，以确保有足够的时间形成抗生物素蛋白与生物素的复合物。用0.1摩尔PBS再洗涤切片3次后，加入ABC试剂，使其与样本在室温下孵育45分钟。在接下来的三轮 PBS 洗涤过程中，在通风橱中根据制造商的说明配制 DAB 工作液，并将 DAB 工作液分装至孔板中。然后将切片转移至含有 DAB 工作液的孔中，缓慢摇动孔板，使切片充分接触溶液。在显微镜下监测 DAB 反应，直至出现足够的信号。大约两到五分钟内，当组织显色达到理想强度时，用 0.1 摩尔 PBS 洗涤以终止反应。再用 PBS 洗涤三次后，将切片置于明胶包被的载玻片上，并在室温下干燥至少三到四个小时。干燥后，将载玻片转移至通风橱中，依次将切片浸入乙醇溶液中各两分钟以进行脱水，然后在 100% 二甲苯中透明处理五分钟。用封片剂封片，并将载玻片置于通风橱中过夜干燥。将载玻片转移至配备相机和20倍物镜的明场显微镜。在200倍放大条件下，对每个脑切片的背侧海马区域采集多张明场图像。每只动物选取3至5个脑切片进行成像。图中显示的是野生型小鼠和Grin2b基因敲除小鼠海马背侧区域的切片，经磷酸化染色处理。细胞外调节的可靠分子信号可作为依赖学习的神经元激活的有效读出指标。这两只小鼠在被处死前均接受过经典的依赖海马的空间学习任务训练，即莫里斯水迷宫实验。在测试的最后一天，与野生型小鼠相比，Grailed双敲除小鼠表现出显著的空间学习缺陷。为分析小鼠的脑切片，统计了海马体各个区域中阳性细胞的总数。在CA3参数层中，每单位面积内野生型小鼠的磷酸化RK阳性细胞数量显著多于敲除小鼠。在齿状回和颗粒细胞层（GCL）中发现了相反的结果。观看本视频后，您应能充分理解如何在以认知缺陷为特征的神经发育障碍的遗传性和药理学小鼠模型的海马脑切片中研究磷酸化蛋白的表达模式。该技术也可用于研究其他脑区的IRK通道表达变化，以及在莫里斯水迷宫以外的认知行为任务后的相关变化。请注意，使用DIA苯时可能存在极大的危险性，进行此操作时必须采取预防措施，例如始终佩戴适当的防护装备。

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海马神经元活动的可视化免疫组化空间后学习神经发育障碍的小鼠模型

我们提供一种无需使用饲养层胶质细胞的从小鼠胚胎脑中培养高纯度海马神经元的方案。...

从小鼠胚胎中分离与培养海马神经元

该视频展示了一种免疫荧光染色方法，用于检测成年海马体中的神经发生。首先，对小鼠脑切片进行处理，使用针对神经前体细胞中与神经发生相关的标志蛋白的一抗孵育。接着，用带有荧光染料标记的二抗进行标记。然后在共聚焦显微镜下观察脑切片，根据不同的标志蛋白组合表达模式，区分各种前体细胞亚型。...

一种用于检测成年海马神经发生的免疫荧光染色技术

本视频演示了在微流控芯片内培养的大鼠海马神经元的免疫荧光染色，用于分析神经元的成熟与连接性。...

微流控芯片内大鼠海马神经元的荧光免疫染色

关键词：微流控芯片，大鼠海马神经元，荧光免疫染色，神经元培养，细胞分隔，轴突，树突，免疫荧光，神经生物学

本视频演示了利用EdU掺入法对脑组织切片中新生增殖的神经干细胞进行染色，随后通过免疫荧光技术可视化特定蛋白，以增强对细胞动态及增殖过程的理解。...

小鼠脑切片中增殖神经干细胞的免疫荧光染色可视化

来源：McLeod, F., 等. 海马啮齿类脑切片中突触密度的评估. J. Vis. Exp.

使用免疫荧光法对小鼠海马脑片中突触进行显微分析

来源：Provenzano, G.，等. 神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化。J. Vis. Exp.

小鼠脑切片中海马神经元激活的成像

来源： Ulivi, A. F., et. al. 活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像. J. Vis. Exp. (2019)...

活体小鼠海马中荧光标记神经元的纵向双光子成像

本方法描述了一种慢性制备技术，可实现对活体小鼠海马体的光学观察。该技术可用于在数周时间内对神经元结构可塑性以及活动诱导的细胞可塑性进行纵向光学成像。...

活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

本文演示了定制成像窗口的制备方法，该窗口配有灌注套管，并展示了其在小鼠海马CA1区的植入过程。...

行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

本文介绍了一种通过精确控制的手术和双光子显微镜技术，对小鼠海马CA1区静息态小胶质细胞进行慢性体内观察的方法。...

体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

通过神经元编程方法获得的人多能干细胞来源的GABA能神经元移植，可能成为治疗神经发育障碍的一种潜在治疗策略。本方案描述了将人干细胞来源的GABA能神经前体细胞生成并移植至新生小鼠脑内的方法，可用于对移植物神经元进行长期研究，并评估其治疗潜力。...

将人干细胞来源的GABA能神经元移植至出生后早期小鼠海马以缓解神经发育障碍

学习免疫组化技术检测小鼠海马神经元磷酸化变化，用于研究神经发育障碍模型中的空间学习依赖性神经激活模式。该方法适用于基因敲除和药理学模型。

神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化

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