神经发育障碍小鼠模型中空间学习后海马神经元活动的免疫组织化学可视化

以下实验的总体目标是利用Grin2b基因敲除小鼠作为神经发育障碍的模型，检测空间学习后海马区irk磷酸化水平的变化。首先，通过Morris水迷宫实验对野生型小鼠和Grin2b基因敲除小鼠进行行为学测试；随后，取出小鼠脑组织，利用振动切片机对野生型和基因敲除小鼠的脑组织进行切片制备。

接下来，对野生型和基因敲除小鼠的脑切片进行免疫组织化学处理，用于检测海马体中磷酸化水平的变化。结果表明，在光学显微镜下通过免疫组织化学染色观察，野生型小鼠与grail two基因敲除小鼠的海马体RC磷酸化水平存在差异。该方法可用于鉴定在依赖海马体的空间学习任务（如莫里斯水迷宫）后被激活的特定海马体神经元亚群。

当我们决定研究自闭症谱系障碍小鼠模型——二级基因敲除小鼠中潜在的分子缺陷所涉及的分子级联反应时，首次提出了该方法的设想。首先，对来自不同遗传背景的实验小鼠进行空间学习任务训练，例如莫里斯水迷宫实验。按照文末随附的文字版实验方案中的描述完成训练程序后，对小鼠实施安乐死，随后固定并取出其脑组织。

当准备继续操作时，使用解剖刀切除小脑。然后将剩余的脑组织直立地用万能胶固定在振动切片机的持样板上。在整个背侧海马区域，将脑组织切成20至40微米厚的连续切片。

将每一片组织转移至一个24孔板的孔中，每个孔内预先加入1毫升0.1摩尔的PBS；每只小鼠取3至5个背侧海马切片，分别放入含有500微升0.1摩尔PBS的24孔板各孔中。用500微升0.1摩尔PBS清洗各孔中的切片，所有清洗和孵育步骤均在室温下进行，并轻轻震荡，除非另有说明。在通风橱内，将切片置于含40%甲醇和1%过氧化氢的0.1摩尔PBS溶液中孵育20分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。

在0.1摩尔PBS中再清洗三次后，将切片置于500微升0.2%Triton X-100中孵育5分钟以进行通透处理。在切片孵育的同时，准备足量的封闭缓冲液用于整个实验。随后吸除通透液，每孔加入100微升封闭缓冲液，室温孵育1小时。

接下来，移除封闭缓冲液，并将切片覆盖上磷酸化细胞外调节激酶。用封闭缓冲液按1:500稀释一抗。将切片在4摄氏度下轻轻振荡孵育过夜，次日用0.1摩尔PBS洗涤切片三次，每次五分钟。

在室温下孵育时，将切片与用封闭缓冲液按1:250稀释的生物素标记的二抗共同孵育一小时。使用前至少30分钟配制ABC试剂，以确保有足够的时间形成抗生物素蛋白与生物素的复合物。用0.1 mol PBS再洗涤切片三次后，加入ABC试剂，使其与样本在室温下孵育45分钟。

在接下来的三轮 PBS 洗涤过程中，在通风橱中根据制造商的说明配制 DAB 工作液，并将 DAB 工作液分装至孔板中。然后将切片转移至含有 DAB 工作液的孔中，缓慢摇动孔板，使切片充分接触溶液。在显微镜下监测 DAB 反应，直至出现足够的信号。

在大约两到五分钟内，通过用0.1摩尔PBS洗涤组织，使反应在理想的颜色强度时停止。在PBS中再洗涤三次后，将切片置于明胶包被的载玻片上，并在室温下干燥至少三到四个小时。干燥后，将载玻片转移至通风橱中，依次将切片浸入乙醇溶液中各两分钟进行脱水，然后在100%二甲苯中透明处理五分钟。

封片，使用封片剂封固载玻片，并置于通风橱中过夜干燥。将载玻片转移至配备相机和20倍物镜的明场显微镜。在200倍放大条件下，对每张切片背侧海马区域获取多张明场图像。每只动物选取3至5张切片。

图中显示的是野生型小鼠和Grailed基因双敲除小鼠海马背侧区域的切片，经磷酸化细胞外调节激酶染色。磷酸化细胞外调节激酶是学习依赖性神经元激活的可靠分子指标。这两只小鼠在被处死前均接受了经典的海马依赖性空间学习任务训练，即莫里斯水迷宫实验。

在测试的最后一天，与野生型小鼠相比，Grailed双敲除小鼠表现出显著的空间学习缺陷。为分析小鼠的脑切片，统计了海马体各个区域中阳性细胞的总数。在CA3参数层中，每单位面积内野生型小鼠的磷酸化RK阳性细胞数量显著多于敲除小鼠。

在齿状回的 hilar 区和颗粒细胞层（GCL）中则发现了相反的结果。观看本视频后，您应能充分理解如何利用遗传性和药理性神经发育障碍小鼠模型（其特征为认知缺陷）的海马脑切片，研究磷酸化蛋白的表达情况。该技术还可用于研究其他脑区的离子通道受体（irk）表达变化，以及在莫里斯水迷宫以外的认知行为任务后的相关改变。

请注意，使用DIA苯时可能存在极高风险，操作过程中必须采取适当的预防措施，例如佩戴合适的防护装备。