Name: 非对称走道:一种新的行为检测方法的研究不对称步态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学习一种低成本评估大鼠步态不对称性的新方法，通过精确运动肢体定位任务量化步态行为。该技术利用皮层和脊髓中枢模式发生器信号，为研究运动控制机制和神经损伤模型提供可靠的行为学评估框架。

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Kriss Franklin、Amanda Pollard 和 Justine Shaffer 协助了动物训练和数据收集。Sarah Freeman 和 Alisa Ivanova 参与了数据分析。本研究由西弗吉尼亚大学医学院启动资金、NIH/NIGMS U54GM104942 及 NIH CoBRE P20GM109098 项目资助。

以下训练范式采用对成年 Sprague-Dawley 大鼠平均相位调节的分析。请确保本文所述方案符合您所在机构的动物护理指导原则。本研究中的所有操作均依照西弗吉尼亚大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）和实验动物福利办公室（OLAW）的规定，并遵守美国国立卫生研究院关于实验动物使用的指导原则。
1. 仪器设置
<ol>
	<li>构建一个不对称步道，其结构为顶部开放的塑料箱，四个角由铝制支架支撑，尺寸为 155 cm × 104 cm（图1）。在箱子的顶边使用两侧带凹槽的铝条进行加固，沿箱子周缘设置可交替安装插销的位置，使同一侧上相邻插销之间的距离定义步幅长度。</li>
	<li>在每个角落放置一个 20 cm × 20 cm 的平台（共四个），以分隔各侧所代表的不同条件。该距离应足以包含单只大鼠一个步态周期所经过的距离。
	<ol>
		<li>使用铝材制成的插销，尺寸为 20 cm × 1 cm × 0.5 cm。将每个插销顶端距尖端 2.5 cm 处弯曲，形成足部放置平台。</li>
		<li>通过精密加工的孔洞，使用滑动内嵌支架将插销固定在带凹槽的铝条上，确保所有插销处于相同高度并水平对齐。使用螺丝刀和直尺调整位置。插销宽度采用 1 cm，约等于大鼠足掌的平均尺寸；过窄或过宽的插销均会导致不适或增加足部放置的变异性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过调节两侧插销的位置，产生三种精确的行走挑战条件。
	<ol>
		<li>通过将左侧步间长度（lISL）和右侧步间长度（rISL）均设为步幅长度的一半（7.5 cm），构建对称运动任务，步幅长度为 15 cm（SL15）。</li>
		<li>通过将 lISL 和 rISL 均调整为 6.0 cm，施加另一种对称条件（SL12）。</li>
		<li>通过改变左右两侧插销之间的距离（称为步间长度）来构建不对称任务。为不对称地挑战运动系统，将 lISL 和 rISL 分别改变 20%，在左侧施加较短步间长度（L6R9 条件）或在右侧施加较短步间长度（L9R6 条件）。1.5 cm 的扰动使 L6R9 条件下的 lISL 为 6 cm、rISL 为 9 cm，而 L9R6 条件下的 lISL 为 9 cm、rISL 为 6 cm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于大鼠实验，除 SL12 条件外，其余所有条件的步幅长度均保持在偏好的 15 cm。</li>
	<li>为方便操作，可将步道的两条长边分别设定为偏向受试动物左侧或右侧的不对称条件，而两条短边则保留用于对称对照条件。</li>
	<li>设置一台采样率至少为 60 Hz 的高清摄像机，确保摄像机镜头垂直于步道，无遮挡地记录肢体在插销上的放置情况，视野范围覆盖约 7 步。靠近平台的起始步和最后一步不予分析。</li>
</ol>
2. 仪器训练
<ol>
	<li>请使用标准培训资源， 例如，美国国立卫生研究院（NIH）实验室大鼠基础生物方法学培训，旨在熟悉啮齿类动物的一般行为训练。</li>
	<li>训练初期，先将受试动物置于20 × 20 cm的平台上，停留至少5分钟并给予奖励，以使其适应环境。随后，通过提供食物奖励引导动物跨越间距为1 cm的桩阵，到达下一个平台。动物抵达平台后，应给予口头表扬及抚摸作为奖励。</li>
	<li>完成5次训练后，将插脚之间的距离额外增加1 - 2厘米，然后进行接下来的5次训练。此处列出的重复次数足以产生具有统计学意义的样本量（20 - 35步）。
	<ol>
		<li>如果动物在完成任务时进展较慢，表现为步态连续性差（出现停顿）和姿势不良（背部弯曲），则应在较短步长（S12）条件下加强训练，重点强化这些技能，之后再恢复较长步长（S15）的训练，逐步接近目标步长。</li>
		<li>如果新的间距引发受试者对该任务的焦虑或不适感，应将 peg 调整回先前设置，并重复训练范式。</li>
		<li>继续进行此项训练，直至四种条件下的步间长度达到适当标准，并满足运动功能的基准要求。根据我们的经验，大鼠对以口头鼓励作为启动试验提示的反应良好。若受试动物有足够动机完成任务，测试可在训练当天进行。 
		注：运动行为的标准如下：行走应保持稳定，不包含停顿或失步；头部摆动最小；运动过程中背部呈拱形，尾部抬起；从行走通道的正交视角观察，在支撑相起始和结束时，每只肢体均应清晰可见。该筛选过程至关重要，因为本研究仅关注行走行为，而非其他步态行为。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测试与数据分析
<ol>
	<li>使用随机化会话设计，在 S12、S15、L9R6 和 L6R9 任务上测试实验动物（见第 1.3 节描述）。在任务之间安排休息，以避免适应性效应。</li>
	<li>使用高清摄像机以至少 60 Hz 的采样率记录会话。将视频记录以不重采样的方式导入视频编辑软件，并仅选取行走片段用于进一步分析。</li>
	<li>在每个受试动物的视频记录中标注运动学相位的起始和终止时间点。</li>
	<li>此处使用基于 Matlab 编写的自定义软件 videoa，逐帧手动识别每个肢体支撑相的起始和终止时间：支撑相起始以肢体落在横杆上时运动模糊消失为标志，支撑相终止则以肢体开始抬离横杆时首次出现运动模糊为标志。</li>
	<li>将摆动相的持续时间计算为连续两个支撑相起始时间之间的剩余时间。排除任何不符合地面四足行走模式的行为（例如步态中出现双摆动相（即双前肢或双后肢同时离地））进入后续分析。</li>
	<li>将各相位持续时间绘制为对应步态周期持续时间的函数。对每条肢体分别建立线性回归模型（Tphase = B1 + B2×Tc）以描述该关系，其中 Tc 为周期持续时间，Tphase 为与伸肌相关的支撑相（Te）或与屈肌相关的摆动相（Tf），B1 和 B2 为回归模型的经验常数（截距和斜率）。 
	注意：B2（斜率）表示运动速度变化时相位持续时间的变化程度。</li>
	<li>对每条肢体使用公式 1 和公式 2（图 2C）计算不对称指数（AI）。两个公式均为标准化差值的简单比值形式，即将两个数值的差除以其和。
	<ol>
		<li>使用公式 1 计算水平方向差异（AIh），该指数基于左侧（l）和右侧（r）肢体支撑相调制斜率的差值。类似地，使用前侧/前肢（a）和后侧/后肢（p）肢体的斜率计算垂直方向不对称性（AIv）。应用这两个公式的结果为一组 4 个 x-y 数据点，分别对应：1）前肢不对称性，aAIh；2）后肢不对称性，pAIh；3）左侧前-后肢不对称性，lAIv ；4）右侧前-后肢不对称性，rAIv 。</li>
		<li>将这些值绘制成图块（图 2B），以直观展示所有肢体间的不对称性分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算对角耦合指数（DI），以评估前肢与其对侧后肢参数之间的对角耦合关系（公式 3，图 2C）。</li>
	<li>使用单因素方差分析（ANOVA）及事后均值比较分析19，检验 DI 以及在相反不对称条件下的四个 AI 差值（ΔAI = |AIL9R6 - AIL6R9|）的统计学显著性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究的目的是开发一种行为学任务，以定量评估非对称运动行为中精确控制能力的变化。脊髓中枢模式发生器（CPG）的存在已在功能上被证实多年20，但其解剖和功能特征，以及来自下行通路或感觉反馈通路的调节性输入，直到过去十年才逐渐被阐明6,21,22。目前的共识是，脊髓固有机制、感觉反馈和下行指令在运动行为的产生过程中紧密整合1
本文介绍的非对称精确足部放置任务旨在功能性地挑战负责灵巧性非对称迈步控制的系统，这种控制已知需要皮层输入23,24。该表现是相对于对下行皮层和脑干控制依赖较少的对称性任务进行评估的，因此我们有机会区分脊髓通路与下行通路的各自贡献。由于运动皮层直接参与运动过程中肌肉时相的调节，以及抓取和姿势调整9,10,25，因此分析在施加的非对称精确迈步任务下时相调节的变化，为描述随意控制的改变提供了依据。这一点在左侧与右侧优势任务之间显著的偏侧化时相调节差异中得以体现，其特征表现为非对称性指数的不同。我们还观察到全身协调性的变化，这种协调需要对侧前肢与后肢之间的对角耦合...

卒中后幸存人群的病残率包括粗大运动功能障碍，这在卒中后人类及神经系统损伤动物模型的定量评估中均构成挑战1。在临床实践中，这些运动功能障碍通常采用主观标准进行测量，而这些标准对重度而非大多数患者所表现出的中度功能障碍更为敏感。类似地，在动物中对损伤后运动行为的主观评估也很常见，例如，Basso、Beattie 和 Bresnahan（BBB）运动功能评分法2,3。尽管这些主观评估方法有助于四足动物模型与人类在步态康复研究之间的转化，但它们并未评估与各肌肉群活动相关的运动缺陷的具体细节。此外，即使采用最新的自动化定量方法4,5，也仅能间接获得对运动皮层在行走中作用的评估——而运动皮层被认为是脑血管意外中运动功能障碍的潜在关键因素，因为这些方法依赖于开放场域或直线行走任务。此类任务不需要皮层参与，可由脊髓的神经机制完成，即，中枢模式发生器（CPG）网络，该网络在大多数神经损伤动物模型（例如，脊髓横断动物）中得以保留6-8。实验已证实，皮层对这些脊髓机制的必要性体现在需要预期性姿势调整9和抓取动作10，以及精确步态控制10的任务中。
此外，大多数神经损伤具有不对称性；例如，中风会导致偏瘫，即，身体一侧无力，从而引起不对称步态11-14。偏瘫步态的不对称性主要表现为肌肉在时空激活上的不对称，最显著的特征是患侧步态周期中与伸肌相关的支撑相缩短，以及与屈肌相关的摆动相延长15,16。这一趋势在健康或偏瘫动物不同运动速度下的表现尚未得到系统研究。在本研究中，我们采用了步相时程特征分析方法17，该方法描述了每一步中摆动相或支撑相持续时间与步态周期总时长之间的关系。随后，通过分析所有肢体间的不对称性，进一步描述所获得的线性回归模型。
我们报道一种基于精确踏步运动任务的新型低成本方法，用于评估四足动物运动系统中皮质下行输入的活动。该任务通过在自然行走速度范围内对足部定位提出要求，以挑战运动皮层。此外，通过操控足部定位需求，选择性地对运动系统的左侧或右侧施加挑战。在类似的运动任务中，Metz &amp;#38; Whishaw（2009）研究了大鼠在不规则横杆走道上行走时的失败频率及错步次数。我们的方法是对该先前研究的补充，进一步详细描述了&#34;成功&#34;步态中时相控制的质量18。

<table><tbody><tr><td>MATLAB&amp;reg; R2013a</td><td>MathWorks</td><td></td><td>用于自定义视频标注软件的设计平台</td></tr><tr><td>Sony HDR-CX380/B 高清 Handycam</td><td>Sony</td><td>27-HDRCX330/B</td><td>视频采集设备</td></tr><tr><td>Jif 浓稠花生酱 - 无麸质 454 g</td><td>J.M. Smucker Company</td><td></td><td>食物奖励刺激物</td></tr><tr><td>蔗糖片剂 - 巧克力味 1800 g</td><td>TestDiet</td><td>1811256</td><td>食物奖励刺激物</td></tr><tr><td>曼萨尼塔木咀嚼棒</td><td>BioServe</td><td>W0016</td><td>用于呈现食物奖励刺激物</td></tr></tbody></table>

非对称步道：一种研究非对称运动行为的新颖行为学检测方法

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

行为学检测常用于评估中枢神经系统（CNS）的感觉运动功能障碍。量化啮齿类动物运动功能障碍的最精密方法是测量其在地面自由行走时步态的微小异常。例如然而，由脊髓中央模式发生器（CPG）产生的基本 locomotion并不需要皮层输入。因此，非限制性行走任务仅能间接检测由于运动皮层损伤导致的运动功能缺陷。在本研究中，我们提出了一种新型的精确足部定位运动任务，用于评估皮层对脊髓CPG的输入作用。我们使用一种带有仪器化的 peg-way（踏钉通道）来实施对称和不对称的运动任务，以模拟偏侧化的运动功能缺陷。我们证明，在偏好步幅长度下行走时， stride length（步幅长度）间距离变化达20%即可引起前肢支撑相特征的改变。此外，我们认为这种不对称走道可用于测量由皮层控制信号产生的行为学结果，这些指标对于评估皮层损伤后的功能障碍具有重要意义。

图2展示了单个代表性受试者在运动任务期间不对称性的分析结果。所有条件下的数值均基于所有受试者个体数据（图2）以及8只雌性斯普拉格-道利大鼠（Sprague-Dawley rats，250–400 g，图3）的合并数据，使用公式1和公式2分别计算得出。通常情况下，前肢站立相的调制程度在运动偏好侧（较短的步长，ISL）较低，这与以下观点一致：随着运动速度降低，优势侧（较长的步长，ISL）的站立相在步态周期中所占比例 tends to 占据更大比例，相较于偏好侧肢体。
采用单因素方差分析（α = 0.05）以及使用Matlab中的anova1和multcompare函数进行保守的Bonferroni校正的事后t检验（校正后α = 0.0125），对从L9R6和L6R9条件获得的相应不对称性指数之间的差异（ΔAI）进行检验。...

本文介绍了一种用于量化啮齿类动物精确步态的实验方案。在受阻运动过程中，精确的足部定位需要大脑皮层和脊髓中央模式发生器信号的共同参与。本文报道了一种新型的受限行走任务，可直接检测精确的步态行为。

行为学检测常用于评估中枢神经系统（CNS）的感知运动功能障碍。目前最复杂的方法用于……

本视频介绍了一种评估大鼠步态不对称性的新型低成本方法，该方法采用精确的四肢运动定位任务。通过计算四足行走步态在不同行走速度下的相位持续时间，来生成一个用于评分动物能力的指数。我们的研究思路是开发一种行为学任务，以定量评估对称性运动行为中精确控制能力的变化。该任务提供了一个机会，用以辨别下行通路在运动时相调控中的作用。例如，在运动皮层进行同步记录或刺激可反映其对本任务中肌肉时相调制的贡献。将装置构建为一个顶部开放的塑料盒，四个角分别设有铝制支撑。包含一个由带凹槽的铝制护栏构成的框架，以提供灵活的插销放置机会。插销的位置决定了动物的强制步长。在四个角落各放置一个20厘米见方的平台。平台之间的间距应能容纳至少一个完整步态周期所经过的距离。为了创建步态条件，将铝制钉状物固定在轨道上，这些钉状物可作为大鼠迈步时的落脚点。钉子应在距尖端2.5厘米处预先弯折，直径应为1厘米。使用可调节的滑动支架固定钉子，通过螺丝刀进行调整，从而精确定位 footholds（脚踏点）。定位脚踏点后，务必确认间距正确，并且处于同一水平高度。为三个踏步任务标准化 peg 的位置。首先，通过将左右步间距离均设为 7.5 厘米，创建步幅长度为 15 厘米的对称运动任务。其次，通过将左右步间距离均改为 6 厘米，从而将步幅变为 12 厘米，创建一个具有步间挑战的对称条件。第三步，创建一个步幅长度为15厘米的非对称任务。调整销钉之间的位置，使左右步幅长度相差20%。该任务有两种配置，分别使左侧或右侧的步幅较短。因此，每侧的行走路径可代表一种独立的步态条件。现在，在装置的一侧放置一台能够以每秒60帧录制的高清相机。调整视野范围，使其覆盖约七个台阶，但不包括靠近平台的最近几个台阶。首先，准备训练环境。将步间距设置为仅一厘米，并在每个平台上放置奖励物。现在，让大鼠自由探索新环境约五分钟。接下来，通过提供奖励物引导动物穿过钉状物排列。当大鼠到达平台时，除了给予食物奖励外，还应给予口头奖励，并轻拍其背部。到这里来，就这里，你已经很接近了。完成五次训练后，将下一个五次训练中 peg 之间的距离增加一到两厘米。目标是逐步增加 peg 间距，直至达到对称的 15 厘米步幅。如果大鼠在学习该任务时遇到困难，则会表现为步态不连贯，并频繁出现停顿和蹲伏姿势。当增加的踏板间距引起焦虑或不适时，只需将踏板重新调整至先前的位置，并重复该级别的训练。如果大鼠具有足够的动机，可在同一天内完成训练和测试。当大鼠已学会该任务时，其行走将保持稳定，不会出现停顿或失足。其头部摆动幅度较小，背部拱起，尾巴竖起。然而，快速迈步且速度变化较小，通常是大鼠采用奔跑而非行走步态的迹象。通过训练大鼠以较低速度移动，通常可以避免这种行为。从相机视角来看，在支撑相的起始和结束阶段，必须确保每条肢体均清晰可见。当所有这些条件均满足后，即可开始测试。测试时，采用四种标准化的钉柱配置，并以随机化的会话设计进行，其间安排休息，以避免受试者对任务产生适应性。具体细节请参见文本方案。保存视频，并使用视频编辑软件截取行走片段以供分析。每秒60帧的速率对于任务评分至关重要。对于每次行走过程，需对运动学各时相的起始和终止进行评分。此操作可通过多种软件逐帧完成。本实验中采用的是使用 MATLAB 编写的自定义软件。当运动模糊消失时，记为支撑相开始；当首次出现运动模糊时，记为支撑相结束。待所有摆动相计数完成后，使用 MATLAB 脚本将其绘制成相应步态周期的函数图。数据来自八名受试者，并按所述方法进行分析。此处显示的是一名受试者的不对称性分析结果。对八名受试者的综合分析表明，总体而言，当某一侧肢体更倾向于进行运动时，该侧前肢站立相的调制程度减弱，反之亦然。采用保守的邦弗罗尼校正的方差分析显示，在不对称指数（包括前水平对称指数）中，两种不对称条件之间存在显著差异。右侧垂直不对称在两种条件间呈现出差异趋势。同样，在两种不对称条件之间，对角性指数也发现存在显著差异。基于方差分析（ANOVA）与事后 t 检验（未进行 alpha 校正），该指标在其他任务之间未发现差异。局灶性脑卒中和脊髓损伤的动物模型会导致运动功能缺陷，类似于临床观察到的症状，通过这种方式损毁皮质脊髓束会阻碍这种精确的踏步行为。这可能导致连续运动时相启动的延迟，这与脑卒中患者中观察到的步长比和单侧肢体支撑时间的不对称性一致。已掌握该任务的动物现可用于大脑中动脉闭塞和创伤性脑损伤等皮质损伤模型中的运动功能评估。

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科研

JoVE Journal

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行为

非对称走道：一种新的行为检测方法的研究不对称步态

梯子行走任务是一种新的测试方法，用于评估精细行走能力，并测量前肢和后肢的放置、迈步以及肢体间的协调性。...

梯子横杆行走任务：评分系统及其实际应用

我们描述了一种方法，可记录在光滑表面上行走的固定昆虫的运动活动，并将其与电记录的跗节接触信号进行时间同步。该方法用于研究在减少腿部通过基质产生机械相互作用影响的条件下，适应性行为的神经基础。...

研究昆虫适应性运动行为的神经基础

本视频介绍了使用视频和追踪软件在实验区域内记录线虫运动的方法。...

C. elegans 运动追踪：一种评估线虫运动能力的方法

在本视频中，我们介绍了用于评估小鼠步态和运动协调能力的足迹测试方法及相关分析流程。...

通过足迹分析评估步态：一种检测小鼠运动协调能力的方法

本方案描述了一种灵活且低成本的小鼠在开放场地活动实验中测量其行走能力的系统。我们证明，基于该系统的6分钟行走实验能够检测到mdx小鼠自主运动能力的下降，并能准确区分这些动物在肌肉特异性挽救后的功能改善。...

一种用于测量肌营养不良小鼠模型行走能力的简单且低成本检测方法

本研究中，我们展示了基于腹侧平面成像的运动学步态分析方法，用于监测小鼠模型（例如，内吞蛋白突变小鼠品系）随年龄增长出现的运动协调细微变化以及神经退行性病变的进展。...

神经退行性小鼠模型中年龄依赖性运动障碍的步态分析

本文介绍了一种用于临床前研究的啮齿类动物四足运动三维运动学数据采集与分析方案。...

用于啮齿类动物临床前研究的三维运动学步态分析

足迹分析是一种低成本的替代方法，可用于研究人员量化小鼠运动异常，替代数字化步态分析程序。由于其速度快、操作简单且具有纵向研究潜力，该方法非常适合小鼠模型的行为表型分析。...

低成本步态分析用于神经肌肉疾病小鼠模型的行为表型鉴定

我们提供了一种通过行为测试组合对大鼠坐骨神经 crush...

大鼠单侧坐骨神经 crush 损伤后运动行为的多因素评估

提供了一种利用 MouseWalker（MW）工具箱对自由行走小鼠的运动模式进行定量描述的实验流程，该流程涵盖从初始视频录制和追踪到后期定量分析的各个环节。采用小鼠脊髓挫伤模型以展示 MW...

利用MouseWalker量化脊髓损伤小鼠模型中的运动功能障碍

本文介绍了一种近期开发的多功能行为学检测方法——梯梁实验。与传统的运动功能评估行为学实验相比，该实验的优势在于能够检测出中枢神经系统中甲状腺激素作用缺陷所引起的细微小脑性共济失调。...

一种用于研究甲状腺激素对小脑功能影响的多功能行为学方法

学习一种低成本评估大鼠步态不对称性的新方法，通过精确运动肢体定位任务量化步态行为。该技术利用皮层和脊髓中枢模式发生器信号，为研究运动控制机制和神经损伤模型提供可靠的行为学评估框架。

非对称步道：一种研究非对称运动行为的新颖行为学检测方法

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