A depleção seletiva de Microglia de Cerebelar Granule culturas de células utilizando L-leucina éster metílico

O objetivo geral deste procedimento é eliminar seletivamente as células microgliais das culturas de células granulares da sela. Isso é feito primeiro cultivando uma população de cgcs e armazenando-os em uma incubadora a 37 graus Celsius com 6% de dióxido de carbono. O segundo passo é fazer uma solução de LME em meio MEM para dar uma concentração final de 150 milimolares LME.

A próxima metade do meio MEM das culturas CGC é removida e retida na incubadora e as culturas CGC são então substituídas por um volume igual de LME contendo meio MEM e colocadas na incubadora a 37 graus Celsius com 6% de dióxido de carbono por uma hora. A etapa final é lavar as culturas CGC duas vezes com pré-aquecimento fresco. Meio MEM.

Substitua o meio de cultura retido por um volume igual de meio fresco e, em seguida, retorne as células à incubadora por 24 horas antes de qualquer tratamento adicional. Em última análise, a imunoquímica e a microscopia de fluorescência são usadas para mostrar a depleção específica de células microgliais de culturas de células granulares cerebelares. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como quais efeitos a microglia tem sobre os neurônios sob várias condições e qual o significado desses efeitos para nossa compreensão de distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson.

Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldades porque trabalhar com culturas primárias requer precisão e velocidade. Comece este procedimento coletando o cerebelo de filhotes de ratos de quatro a sete dias de idade. Coloque-os imediatamente em uma placa de Petri contendo cinco mililitros de solução A no gelo.

Em seguida, remova o excesso de solução do cerebelo e coloque o tecido na tampa da placa de Petri. Em seguida, pique o tecido finamente com uma lâmina de barbear em pelo menos três direções diferentes. Em seguida, adicione o tecido picado à solução B.Coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos e agite-o suavemente a cada dois minutos.

Em seguida, adicione 20 mililitros de solução D ao tubo para neutralizar o shake de tripsina na centrífuga a 60 5G por cinco minutos. Depois. Despeje o sobrenadante S ressuspenso em quatro mililitros de solução CT tri. Classificar a amostra 10 vezes com cada uma das três pipetas de vidro inflamado de diâmetro decrescente até que a suspensão seja o mais homogénea possível.

Em seguida, lenta e suavemente, adicione algumas gotas deste homogeneizado em cima do B-S-A-E-B-S-S se ele começar a afundar mais através do tritrato B-S-A-E-B-S-S-T e adicione um pouco mais de solução C. O homogeneizado deve ficar em uma camada em cima do B-S-A-E-B-S-S. Centrifugar a 100 G durante cinco minutos e não agitar. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o palato.

Em um mililitro de meio MEM, conte as células usando um hemocitômetro e coloque-as em placas a 800.000 células por capa. Deslize 500 microlitros de meio MEM depois disso, colocou-o em uma incubadora a 37 graus Celsius com 6% de dióxido de carbono. Em seguida, faça uma solução de meio MEM contendo 10 micromolares do inibidor do ciclo celular RC Para cada lamínula, retenha 250 microlitros do meio antigo em uma placa nova de 24 poços e aspire o restante.

Adicione 250 microlitros de meio MEM normal para lavar as células. Posteriormente, adicione 250 microlitros de meio antigo de volta às células e complete com 250 microlitros de meio contendo RSE. Neste procedimento, adicione LME puro a cinco mililitros de meio MEM para obter uma concentração final de 150 milimolares LME.

Retorne a solução a pH 7,4 usando solução à base de ácido. Em seguida, filtre-o estéril usando um PES de 28 milímetros com filtro de seringa de 0,2 micrômetro. Em seguida, diluir a solução LME a uma concentração de 50 milimolares em meio MEM.

Em seguida, coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos, junto com o meio MEM normal para culturas de controle. Após 10 minutos, remova 250 microlitros do meio MEM de cada cultura CGC. Em seguida, mantenha a mídia a 37 graus Celsius.

Em seguida, trate as células com meio MEM contendo duas vezes LME ou com meio MEM pré-aquecido sem LME Para culturas de controle, incube as células a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 6% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, lave as células duas vezes em meio MEM fresco pré-aquecido para remover o meio contendo LME. Em seguida, substitua o meio de cultura retido por uma quantidade igual de meio MEM fresco pré-aquecido.

Por fim, incube as culturas em dióxido de carbono umidificado a 6% a 37 graus Celsius por 24 horas antes de qualquer tratamento adicional. Esta figura mostra as imagens representativas dos experimentos realizados em culturas de CGC após o tratamento com LME de 25 a 75 milimolares por uma hora, seguido de lavagem Imunoquímica foi realizada com DPI para quantificação do número total de células e aquelas que apresentam morfologia apoptótica e ISO lectina B quatro para identificação e quantificação microglial. Este gráfico mostra a quantificação de células exibindo morfologia apoptótica mostradas aqui estão as imagens representativas dos experimentos realizados em culturas de CGC após serem tratadas com LME 25 milimolares por uma hora.

A imunoquímica foi realizada com DAPI anti beta três tubulina para a identificação de alterações na densidade neuronal e anti GFAP para a identificação de alterações na densidade astrocítica e morfologia. As imagens de controle negativo representam culturas de CGC em que os anticorpos primários foram omitidos uma vez dominados. Esta técnica pode ser feita em aproximadamente duas horas se for realizada corretamente.