使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行细胞标记与靶向

本实验的总体目标是合成超顺磁性氧化铁纳米颗粒，并利用这些颗粒标记细胞，用于磁性靶向和分选应用。该目标的实现分为两个步骤：首先合成直径为10纳米的磁铁矿纳米颗粒；第二步是用厚度为50纳米的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）包覆磁铁矿纳米颗粒。

接下来，对磁性纳米颗粒进行洗涤并进行冷冻干燥。最后一步是用磁性纳米颗粒标记细胞，用于细胞靶向和分选应用。最终，通过荧光显微镜观察磁性纳米颗粒标记的细胞在磁场中的靶向效果。

与现有的抗体介导细胞靶向等方法相比，该技术的主要优势在于磁性细胞靶向具有高度特异性和可控性。该技术的应用前景广泛，可应用于多种疾病的治疗，因为治疗性细胞能够被递送至靶部位，同时避免对非靶部位产生影响。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为需要格外注意实验细节，才能获得高纯度和高质量的纳米颗粒。

我们希望提高活细胞在体内的靶向性和定位能力。首先，使用杜氏瓶通过向500毫升去离子水中轻轻通入氮气30分钟来进行脱气处理。设置反应装置时，将一个500毫升三颈圆底烧瓶置于ISO加热套中。

接下来，用橡胶隔垫封住烧瓶一侧的瓶口，并在另一侧安装回流冷凝管。持续向冷凝管中通入冷水，以建立反应的惰性气氛。首先，用连接至氮气管路的针头刺穿烧瓶的橡胶隔垫。

然后用连接鼓泡器的针头刺穿冷凝器的隔垫，以观察气体流出情况。接着，将桨叶转子通过桨叶适配器安装到中心颈口。为保持反应混合物持续搅拌，将桨叶轴连接至安装在支架上的顶部搅拌器。

用氮气吹扫烧瓶，并保持氮气以低速但可检测的流速通入烧瓶中。然后取下回流冷凝管，加入1克三氯化铁、612.5毫克二氯化亚铁四水合物和50毫升脱气水。重新装上冷凝管，在50摄氏度加热的同时以1000转/分钟的速度搅拌反应。

这将生成直径为10纳米的磁铁矿颗粒。当反应温度达到50摄氏度时，使用注射器通过烧瓶的隔膜注入10毫升28%的氢氧化铵溶液。随着磁铁矿沉淀析出，溶液应变为黑色。

移除橡胶隔垫和气体管路，将反应加热至 90 摄氏度。然后向烧瓶中加入 1 毫升油酸，以包覆纳米颗粒并形成磁铁矿凝胶。接着，重新安装烧瓶上的隔垫和气体管路，并移去冷凝器。

关闭热源，以500转/分钟的速度搅拌反应液两小时。搅拌结束后，用强磁铁将纳米颗粒吸附在烧瓶底部，倾倒除去上清液。开始纯化前，先将磁铁矿凝胶溶于40毫升己烷中。

将此溶液缓慢倒入含有 40 毫升脱气水的分液漏斗中，轻轻旋转摇动漏斗 5 分钟。摇动后，倾倒出下层水相部分，再用脱气水以同样方式洗涤磁铁矿溶液两次。接下来，将磁铁矿溶液转移至锥形瓶中。

加入几药匙的硫酸钠并旋摇混合物，使溶液干燥。然后进行真空过滤。将混合物通过孔径为一微米的滤纸过滤。

将旋转蒸发仪的水浴温度设置为50摄氏度，冷凝器中通入24摄氏度的循环水。然后将滤液转移至50毫升的蒸发瓶中，在真空条件下以中等转速旋转蒸发2小时，去除己烷。将磁铁矿凝胶分装至玻璃小瓶中，分为六份各40毫克的等分试样，每份将单独进行包覆和洗涤操作：取一份凝胶与40毫升溶于乙酸乙酯中的PLGA加入塑料烧杯中，混合物超声处理10分钟。

接下来，向烧杯中加入 80 毫升的 F127 溶液，并立即以高速混合器乳化七分钟。这些纳米颗粒现为超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）。用一升去离子水稀释该溶液，并在通风橱中进行超声处理一小时。然后将一块强磁铁置于溶液旁边，轻轻搅拌溶液，使 SPION 在磁铁处聚集收集。

将水溶液倾析除去，同时保留在烧杯中的 S scions。每次用清水洗涤 S scions，共洗涤三次。在所有六份等分试样均完成包被和洗涤后。

将S接穗收集到一个玻璃小瓶中。在冻干机中将spy on溶液过夜冷冻干燥，以准备细胞标记。首先将pyon悬浮于PBS中，浓度为40毫克/毫升，并超声处理30分钟。

接下来，将溶液以每毫升细胞培养基5 µL的浓度加入至接近汇合的细胞培养瓶中。轻轻摇动培养瓶，使溶液均匀分布。将细胞孵育16小时。

在 37 摄氏度下。轻柔地吸去培养基，然后用 PBS 洗涤细胞两次。磁标记的细胞现在可用于实验。

通过在50摄氏度、1000转/分钟条件下搅拌氯化铁三和四水合氯化亚铁的水溶液，可稳定制备直径为10纳米的四氧化三铁纳米颗粒。透射电子显微镜（TEM）是测定颗粒尺寸的首选方法。使用高速乳化器将PLGA包覆在四氧化三铁纳米颗粒表面，可重复地获得直径为120纳米的PLGA-四氧化三铁复合颗粒。扫描电子显微镜（SEM）用于观察这些颗粒。将血液来源的内皮祖细胞与吡喃（pyon）孵育16小时后，可通过TEM观察到纳米颗粒被细胞内吞。PLGA-四氧化三铁纳米颗粒可在细胞内被观察到，其储存于胞质内的内体中。

将铁加载到细胞内的水平足以实现对活细胞的磁捕获，使其附着于铁磁性可植入医疗设备。与非磁性支架相比，磁标记的内皮细胞向铁磁性支架的迁移速率更高。在实施该操作时，需注意务必彻底清洗所有玻璃器皿和设备，以在后续操作中最大限度地提高纳米颗粒的纯度和安全性。

其他方法，如磁性细胞靶向技术，可用于回答更多问题，例如哪些医学疗法可受益于特定且可控的细胞递送。该磁性靶向技术将有助于开发适用于多种生物医学应用的靶向细胞递送方法。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成超顺磁性氧化铁纳米颗粒，并利用这些颗粒标记细胞以用于磁性靶向应用。