跟踪超副磁性氧化铁标记的美感血干细胞使用MRI后，创伤性脑损伤Murine模型内伤分娩

这里介绍的是一个非侵入性的中伤性干细胞（MSC）传递和跟踪的小鼠模型创伤性脑损伤的协议。超对磁氧化铁纳米颗粒用作磁共振成像（MRI）探头，用于MSC标签和非侵入性体内跟踪，使用实时MRI进行鼻内传递。

这种方法可以帮助确定细胞内细胞干细胞在脑内传递后的基础分布。这项技术的主要优点是，促进非侵入性的传递和跟踪的中质干细胞到大脑。此外，多种剂量是可能的，以最大限度地提高移植细胞在受伤后慢性阶段的治疗效果。

这项技术最大限度地增加传递到损伤地点的细胞数量，并最大限度地减少了洛比特细胞进入其他组织的过程。虽然这项技术提供了对在创伤性脑损伤治疗中使用中质干细胞的见解，但它也可用于非创伤性脑损伤的研究。对于具有超顺磁氧化铁的中质干细胞标记，在T 75烧瓶中加入6毫升标记介质，在37摄氏度和5%的二氧化碳下进行24小时孵化。

第二天，小心吸吸超级盐，每次洗涤用六毫升PBS洗两次细胞。要确定细胞是否已成功标记，请在荧光显微镜下检查培养。为了诱发 CCI 损伤，在确认对踏板反射缺乏反应后，使用电子剪子从头骨的后侧表面剃毛，并使用浸泡在碘中的无菌棉签清洁剃光区域几次。

使用浸泡在70%乙醇中的棉签，在最后一个拭子后去除碘，将动物放在立体战术框架中。用耳鼻保护，在剃光的皮肤中做一个2.5厘米的中下部切口，以进入头骨的表面。使用棉垫取出覆盖头骨的组织，用浸有 3% 过氧化氢的棉签清洁头骨表面 10 秒钟。

用新鲜的棉垫擦干头骨，用铅笔在裸露的骨头上选择的坐标周围画一个四毫米的圆。使用装有0.5毫米直径圆毛刺的微型钻头，在不施加压力的情况下小心地将标记的圆的头骨薄。用干净干燥的棉签去除任何骨质灰尘，并使用无菌的石膏来小心地取出产生的骨瓣。

当杜拉母体暴露后，将鼠标转移到 CCI 设备的立体定向帧中，用耳朵和鼻条固定动物，使头部在玫瑰花道方向上水平。按照控制箱上的说明，使用冲击器底部的 X 和 Y 控制轮将冲击器尖端降至外露的皮质表面，使冲击器尖端直接在要受影响的要受影响的皮层坐标上方。使用控制框将实验参数设置为 5 米/秒的速度、250 毫秒的停留时间以及 1 毫米的伤害深度以诱发轻度损伤。

然后，按下控制箱上的冲击按钮。用无菌棉签擦拭任何出血，然后将鼠标从框架中取出。用丝绸手术缝合线关闭切口，并将局部抗生素涂抹到部位，然后将鼠标放在加热垫上，并监测直至完全恢复。

受伤后一天，用三毫升的三丁普辛治疗标有中质干细胞培养的超级顺磁氧化铁。在37摄氏度下5分钟后，用7毫升预热DMEM介质开始反应，辅以10%的胎儿牛血清，将细胞悬浮液收集到15毫升锥形管中。通过离心沉淀细胞，并在PBS中重新悬浮颗粒进行计数。

然后，将细胞浓度调整为每18微升PBS的5个细胞的1.5倍10。对于细胞分娩，在确认对头趾捏没有反应后，在固定头骨时将鼠标擦伤。将一个移液器的尖端，每微升PBS含有四个单位的透明龙酶，以45度角靠近鼠标的纳雷，并在每个鼻孔中施用三升透明龙酶悬浮液。

将动物脸朝上放在干净的垫子上五分钟，然后重复治疗四次，共进行 100 单位的海卢罗尼达塞治疗。最后一次治疗后，将鼠标放回垫上30分钟，然后像刚才演示的一样约束鼠标。头部固定时，每次溶液输送三秒钟内，将三根微升的中质干细胞悬浮液插入每个鼻孔，将鼠标保持30秒，直到样本滴完全消失。

两分钟后，重复分娩三次，直到整个体积的中质干细胞被交付。然后，将鼠标返回到其保持架，并进行监视，直到完全保持。要通过 MRI 跟踪中质干细胞的迁移，请将麻醉小鼠放在 MR 成像器的成像支架上。

然后，将动物固定到位，然后将支架移动到 MRI 线圈的中心。将重复时间设置为 1500 毫秒，将回波时间设置为 2.8 毫秒。然后，将视场设置为 16 乘 16 毫米，采集矩阵设置为 128 乘 128，将切片厚度设置为 0.75 乘 0.8 毫米，具有四个信号平均值和 90 度翻转角度，使用自旋回波序列获取 T2 星加权扫描。

完成扫描后，从 MRI 线圈中心收回鼠标支架，然后将鼠标返回到其保持架，并进行监控，直到完全保持。要跟踪和量化 T2 星加权图像上标记的中质干细胞，请打开 IT 案例捕捉软件中的数据并选择活动标签。创建催眠区域和病变或其他大脑部分的分割，为每个段使用不同的标签颜色。

使用主工具栏中的多边形工具选择表示标有中质干细胞的超级顺磁氧化铁的催眠区域，然后单击"接受"。分段区域将显示与分配给该特定分段的活动标签相同的颜色。当所有切片都已分段后，使用手术刀工具开发分段区域的 3D 地图，以表示整个大脑中的中生血切都是干细胞分布。

要对表示标记单元格的分段海点区域的体积和强度均值进行定量分析，请单击分段并选择体积和统计数据。在鼻内传递24小时后，标有间质干细胞的超级顺磁氧化铁被检测为T2星加权图像的皮质损伤的强催眠区，表明超级顺磁氧化铁定向向损伤地点迁移。这种迁移在交付后 14 天内仍然可见，不会明显减少信号。

使用PBS治疗的受伤动物在任何特定时间点内不表现出催眠区域，表明观察到的催眠区域对应于标有中质干细胞的超顺磁氧化铁，并且不是由于信号伪影造成的。标记的中层干细胞的生物分布可以通过3D重建进行可视化，组织学上通过普鲁士蓝色染色，或通过贴有的中层干细胞内贴有的HTIC标记的超级顺磁氧化铁的荧光检测。请务必用病理学或其他方法验证 MRI 结果。

由于超磁性氧化铁颗粒在细胞死亡后可能留在组织中，从而导致误报信号。按照这个程序，可能的脾气非侵入性跟踪定量可以应用于回答有关磨练能力和保持大脑中的中质干细胞的问题。经过这一开发，这项技术为再生医学领域的研究人员探索改善细胞磨练到大脑特定区域的方法铺平了道路。