通过鼻内递送后利用磁共振成像追踪超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在创伤性脑损伤小鼠模型中的分布

该方法有助于确定间充质干细胞经鼻递送至脑部后在脑内的分布情况。该技术的主要优势在于能够实现间充质干细胞向脑部的无创递送与示踪。此外，可在损伤后的慢性阶段通过多次给药以最大化移植细胞的治疗效果。

该技术可最大化将细胞输送至损伤部位，并减少炎性细胞向其他组织的扩散。尽管该技术为间充质干细胞在创伤性脑损伤治疗中的应用提供了研究依据，也可用于非创伤性脑损伤的研究。对间充质干细胞进行超顺磁性氧化铁标记时，向T75培养瓶中80%融合度的间充质干细胞培养物加入6 mL标记培养基，在37°C及5%二氧化碳条件下孵育24小时。

第二天，小心吸除上清液，并用六毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，每次洗涤使用六毫升。为确定细胞是否标记成功，在荧光显微镜下观察培养物。为诱导CCI损伤，在确认足底反射消失后，使用电动剪毛器剃除颅骨背侧的毛发，并用浸有碘液的无菌棉签多次清洁剃毛区域。

最后一次擦拭后，使用浸有70%乙醇的棉签去除碘，然后将动物放入立体定位仪中。用耳杆和鼻杆固定小鼠，并在剃净的皮肤上做一条2.5厘米长的正中矢状切口，以暴露颅骨表面。用棉垫清除覆盖在颅骨上的组织，并用浸有3%过氧化氢的棉签清洁颅骨表面10秒。

用新的棉垫将颅骨擦干，并用铅笔在暴露的骨面上所选坐标周围画一个直径四毫米的圆。使用配备有直径0.5毫米圆形磨头的微型钻，在标记的圆圈区域小心地磨薄颅骨，注意不要施加压力。用干净且干燥的棉签清除骨屑，然后用无菌镊子小心移除形成的骨瓣。

当硬脑膜暴露后，将小鼠转移至 CCI 装置的立体定位架中，并使用耳杆和鼻杆固定动物，使头部在前后方向上保持水平。根据控制箱上的说明，使用冲击器底部的 X 和 Y 控制旋钮，将冲击头对准目标皮层坐标的正上方，并将冲击头与暴露的皮层表面调零。通过控制箱设置实验参数：速度为每秒五米，停留时间为 250 毫秒，损伤深度为一毫米，以诱导轻度损伤。

然后，按下控制箱上的撞击按钮。若出现出血，用无菌棉签擦拭，并将小鼠从固定架中取出。使用丝线外科缝合线闭合切口，在切口处涂抹局部抗生素，随后将小鼠置于加热垫上，持续监测直至完全恢复卧姿。

损伤后一天，用三毫升胰蛋白酶处理标记了超顺磁性氧化铁的间充质干细胞培养物。在37摄氏度下孵育五分钟，加入七毫升预热的含10%胎牛血清的DMEM培养基终止反应，并将细胞悬液收集至15毫升锥形管中。通过离心沉淀细胞，然后将沉淀重悬于PBS中进行计数。

然后，将细胞浓度调整为每18微升PBS中含有1.5 × 10⁵个细胞。进行细胞递送时，在确认小鼠对足趾夹捏无反应后，固定小鼠头部并使其头部保持不动。将含有每微升PBS含4单位透明质酸酶的移液枪头以45度角靠近小鼠鼻孔，向每侧鼻孔内注入3微升透明质酸酶悬液。

将动物仰面放置在干净的垫子上5分钟，然后重复处理四次，共完成100单位的透明质酸酶处理。最后一次处理后，将小鼠重新放回垫子上静置30分钟，随后按前述方法固定小鼠。固定头部后，在每侧鼻孔内分三次、每次3秒内滴入3 µL间充质干细胞悬液，每次给药后保持小鼠体位30秒，直至液滴完全消失。

两分钟后，重复给药最多三次，直至全部间充质干细胞体积完成输送。然后将小鼠放回笼中，并持续监测直至完全恢复卧位。为通过磁共振成像（MRI）追踪间充质干细胞的迁移情况，需将麻醉后的小鼠置于磁共振成像仪的成像固定装置上。

然后，将动物固定到位，并将固定装置移至MRI线圈的中心。设置重复时间为1500毫秒，回波时间为2.8毫秒。随后，设置视野为16 × 16毫米，采集矩阵为128 × 128，层厚为0.75 × 0.8毫米，信号平均次数为4次，翻转角为90度，采用自旋回波序列采集T2星加权扫描图像。

完成扫描后，将小鼠固定器从MRI线圈中心撤出，并将小鼠放回笼中，持续监测直至完全恢复仰卧状态。为了在T2星号加权图像上追踪并定量标记的间充质干细胞，需在ITK-SNAP软件中打开数据并选择活动标签。使用不同标签颜色，分别对低信号区域以及病灶或其他感兴趣脑区进行分割。

使用主工具栏中的多边形工具选择代表超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞的低信号区域，然后点击接受。分割后的区域将显示为与分配给该特定分割的活动标签相同的颜色。当所有切片均完成分割后，使用手术刀工具生成分割区域的三维图，以表示间充质干细胞在整个脑组织中的分布情况。

为了对代表标记细胞的分段低信号区域的体积和平均强度进行定量分析，请点击分割并选择体积和统计。鼻内给药后24小时，在T2星权重重像上，超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在皮质损伤内侧表现为明显的低信号区域，表明超顺磁性氧化铁靶向迁移至损伤部位。这种迁移在给药后14天内仍可见，且信号强度无明显减弱。

用PBS处理的受伤动物在任何时间点均未出现低信号区域，表明所观察到的低信号区域对应于标记了超顺磁性氧化铁的间充质干细胞，而非信号伪影所致。可通过三维重建、普鲁士蓝染色进行组织学分析，或通过荧光检测标记间充质干细胞内FITC标记的超顺磁性氧化铁，来可视化标记间充质干细胞的生物分布。务必使用组织学或其他方法对MRI结果进行验证。

由于超顺磁性氧化铁颗粒可在细胞死亡后仍滞留在组织中，从而导致假阳性信号。通过本方法，可实现对间充质干细胞在脑内归巢能力及其滞留情况的量化，进行可能的无创性时间追踪研究。该技术的发展为再生医学领域的研究人员探索如何提高细胞向脑部特定区域归巢的能力奠定了基础。