Name: 跟踪超副磁性氧化铁标记的美感血干细胞使用MRI后，创伤性脑损伤Murine模型内伤分娩 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学习利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记间充质干细胞，并通过鼻内给药在小鼠创伤性脑损伤模型中进行非侵入性递送与磁共振成像追踪的方法。该技术可优化细胞靶向分布并提升治疗效果。

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本研究工作得到了中国台湾科技部基金（MOST 104-2923-B-038-004 -MY2、MOST 107-2314-B-038-063 和 MOST 107-2314-B-038-042）以及台北医学大学（TMU 105-AE1-B03、TMU 106-5400-004-400、TMU 106-5310-001-400、DP2-107-21121-01-N-05 和 DP2-108-21121-01-N-05-01）的资助。

本方案中涉及动物的所有操作均经机构动物照护与使用委员会批准，并获得中国台湾台北医学大学动物使用伦理委员会的核准（批准编号：LAC-2018-0574；批准日期：2019年3月15日）。
1. 使用SPIO纳米颗粒标记MSCs
<ol>
	<li>为了用SPIO标记MSCs，向含有MSCs（80%融合度）的T75培养瓶中加入6 mL标记培养基（含25 µg/mL SPIO的Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]，不含胎牛血清[FBS]）。</li>
	<li>将细胞置于CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中与标记培养基共同孵育，不摇动。24小时后，使用连接塑料吸头的无菌巴斯德吸管并配合真空装置，轻轻移除标记培养基。用6 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞单层2次，以去除未被细胞摄取的残留SPIO。
	<ol>
		<li>为确认细胞是否成功标记，可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察标记后的细胞，前提是所用SPIO带有荧光标记（例如本文所用的SPIO；图1B,C）。或者，可对细胞进行普鲁士蓝染色（染色步骤见6.2–6.4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用3 mL胰蛋白酶处理贴壁细胞以收获细胞，并在37 °C下孵育。孵育5分钟后，加入7 mL预热的含10% FBS（v/v）的DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性。用移液器将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。</li>
	<li>在300 x g 条件下离心细胞悬液5分钟。弃去上清液，用PBS重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞数量。 
	注意：由于铁的负载，标记后细胞沉淀呈现深色（图1D）。本方案适用于MSC的标记及MRI成像。MSC标记的流程6此前已有优化，此处仅包含为体内追踪目的而制备标记MSC的步骤，因本研究重点为体内追踪。其他细胞类型的培养与标记方案应由研究人员自行优化。</li>
	<li>用PBS调节细胞浓度，使18 µL PBS中含150,000个细胞（或达到足够MRI信号的细胞数量）（或根据鼻内给药程序所需的总体积进行调整）。 
	注意：观察发现，当PBS中细胞浓度超过150,000个/18 µL时，会导致细胞聚集，可能影响鼻内给药效率。若鼻内给药需要更多细胞，可增加细胞悬液的总体积，并增加鼻内给药次数，因为鼻内给药为非侵入性操作，允许多次给药。</li>
</ol>
2. 控制性皮层冲击（CCI）损伤
注意：在本实验方案中，雄性 C57 BL/6 小鼠（7–8 周龄）饲养在 12/12 小时明暗循环条件下，并可自由摄取食物和水。
<ol>
	<li>为每只小鼠进行 CCI 损伤前，通过腹腔注射（i.p.）给予唑拉西泮（50 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）麻醉混合物（1 mL/kg）。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度是否充分。 alternatively，将小鼠置于充满 2%–4% 异氟烷的麻醉舱中 60 秒. </li>
	<li>使用电子理发剪剃除耳间颅骨背侧表面的毛发。用浸有碘液的无菌棉签多次擦拭剃毛区域进行消毒。再用浸有70%乙醇的棉签擦去碘液。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中，使用耳杆和鼻杆固定小鼠。用无菌剪刀在剃净毛发的皮肤上做正中矢状切口（约2.5 cm），暴露颅骨表面。</li>
	<li>用棉垫去除骨骼上的组织以暴露颅骨。使用浸有3% H₂O₂的棉签清洁颅骨表面。2O2 持续10秒，然后用干燥的棉垫擦拭干净。 
	注意： 颅骨缝以及前囟点和后囟点现在均可轻松识别。</li>
	<li>在颅骨表面确定CCI损伤的目标坐标，并使用铅笔或适当的标记工具在坐标周围画出一个直径为4 mm的圆。 
	注意： 在本方案中，采用前后方向（AP）-2.0 mm 和内外侧方向（ML）+1.5 mm 的坐标进行 CCI 诱导。</li>
	<li>使用微型钻和圆钻头（直径0.5 mm）对标记的圆形区域颅骨进行减薄。钻孔时避免施加压力，以免穿透骨质损伤脑实质。用干净干燥的棉签清除骨屑。</li>
	<li>使用无菌精细镊子轻轻移除颅骨瓣，暴露硬脑膜并保持其完整。将小鼠从用于伤前准备的立体定位仪架上取下，放入CCI装置的立体定位仪架中。</li>
	<li>使用耳杆和鼻杆固定小鼠头部。确保小鼠头部在头尾方向上保持水平，必要时调整鼻杆。</li>
	<li>根据控制盒上的说明，将撞击头调零至暴露的皮层表面。使用撞击器底座上的X轴和Y轴控制旋钮，确保撞击头精确对准目标皮层坐标的正上方。</li>
	<li>使用控制箱设置实验参数，速度为5 m/s，停留时间为250 ms，损伤深度为1 mm，以在小鼠中诱导轻度损伤。</li>
	<li>通过按控制箱上的“impact”按钮诱导损伤。若发生出血，使用无菌棉签擦拭。</li>
	<li>将小鼠从立体定位仪中取出，使用丝线手术缝合线缝合切口。禁止使用金属夹闭合手术切口，因为小鼠后续将接受磁共振成像（MRI），会暴露于磁场中。</li>
	<li>在手术部位涂抹局部抗生素（杆菌肽新霉素）以预防感染。将小鼠置于加热垫上，并在恢复期间密切监测。</li>
	<li>术后每日腹腔注射酮洛芬（2.5 mg/kg）一次，连续3天，除非酮洛芬的使用与研究目的相冲突。</li>
</ol>
3. 鼻内给药
<ol>
	<li>在CCI造模后第1天，通过腹腔注射给予唑拉西泮（50 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）麻醉混合液。通过检测脚趾夹捏反射是否消失，确认小鼠已进入深度麻醉状态。</li>
	<li>通过透明质酸酶处理，为小鼠准备间充质干细胞的鼻内递送。
	<ol>
		<li>抓握小鼠颈背部皮肤，将其稳固地翻转至仰卧位，固定头部。将含有透明质酸酶的无菌PBS溶液（4 U/µL）的移液器尖端置于小鼠鼻孔附近，呈45°角。</li>
		<li>每个鼻孔给予3 µL透明质酸酶悬液。将小鼠保持固定、仰面朝上置于洁净垫上5分钟。重复透明质酸酶处理4次（共给予100 U透明质酸酶悬液）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透明质酸酶处理后，将处理过的小鼠仰面朝上置于洁净垫上静置30分钟。</li>
	<li>为将间充质干细胞递送至脑部，按照步骤3.2.1所述方法牢固握住小鼠。每个鼻孔给予3 µL干细胞悬液，间隔3&#8201;秒。保持小鼠体位不变，持续30秒，直至液滴完全消失。 
	注意：给药过程中应避免产生气泡。</li>
	<li>以2分钟间隔重复给药，最多3次。 
	注意：需递送的细胞总数为150,000个，因此可在每个鼻孔分3次、每次3 µL，共给予18 µL细胞悬液。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，并密切观察，直至其从麻醉中完全恢复。</li>
</ol>
4. 体内磁共振成像
注意：既往曾使用脑组织的组织学染色来确认经鼻给药后干细胞成功递送。然而，该方法仅可用于研究的终点检测，无法进行纵向监测。利用磁共振成像（MRI）探针对治疗性干细胞进行标记，可实现对细胞在体内的纵向、无创性追踪。重要的是，该方案可显著减少所需实验动物的数量。在本方案中，于间充质干细胞（MSCs）递送后的第1、7和14天进行了MRI扫描。
<ol>
	<li>为准备小鼠进行MRI扫描，使用异氟烷麻醉小鼠（5%异氟烷，氧气流速1 L/min）。2&#160;诱导时使用1.5%–2%异氟烷，维持时使用1.5%–2%异氟烷。通过脚趾夹捏测试确认小鼠达到所需的麻醉深度。</li>
	<li>将小鼠放置在成像支架上，并使用胶带或其他适当方法固定其位置。将支架移至MRI线圈（7 T/40 cm磁体）中心，并连接监测装置。</li>
	<li>使用自旋回波序列采集T2*加权扫描时，将重复时间（TR）设为1500 ms，回波时间（TE）设为2.8 ms。</li>
	<li>使用16 mm × 16 mm视野（FOV）、128 × 128采集矩阵（MTX）和0.75 × 0.8 mm层厚2 采用四个信号平均值和90°翻转角（FA）。</li>
	<li>扫描完成后，将小鼠固定器从MRI线圈中心移出。将小鼠放回笼中，并密切观察，直至其完全从麻醉状态恢复。</li>
	<li>使用 ITK-SNAP 软件（版本 3.8.0）在 T2* 加权图像上追踪并定量标记的间充质干细胞7.
	<ol>
		<li>将 MRI 扫描的原始数据以 DICOM（医学数字成像与通信）格式从 MRI 设备的计算机传输至用于分析的计算机。</li>
		<li>运行 ITK-SNAP 软件，通过点击加载 MRI 图像 文件 按钮。然后，单击 打开主图像 在菜单中。按下 打开图像 显示窗口中的按钮，然后找到并打开 MRI 图像 浏览 按钮 
		注意： MRI图像中标记细胞的可视化表现为低信号区域。如果需要调整图像对比度，请选择 工具 | 图像对比度.</li>
		<li>对低信号区域、病灶或其他脑部结构进行分割，方法是选择 活性标签 在分割标签部分，为不同的区域使用不同的标签颜色（如果需要对多个部分进行分割）。</li>
		<li>使用 多边形 工具在 主工具栏 勾画代表SPIO标记的MSCs的低信号区域。选择 接受位于MRI图像下方。被分割的区域将显示为与分配给该特定分割的活动标签相同的颜色。对所有MRI切片重复此分割步骤。</li>
		<li>通过选择分割区域构建三维图谱，以呈现间充质干细胞在整个大脑中的分布情况 手术刀工具 在底部 3D 工具栏，位于 分割标签 位于 ITK-SNAP 工具箱底部的区域。然后，按压 接受 在生成的3D图的底部。</li>
		<li>为了对代表标记细胞的分割低信号区域进行定量分析（体积和平均强度），请按下 分割 顶部面板中的按钮并选择 体积与统计学.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 小鼠脑组织的固定与冷冻切片
<ol>
	<li>为固定小鼠脑组织，在最后一次 MRI 扫描后，按照先前所述方法进行经心脏灌注 4% 多聚甲醛（PFA）8。
	<ol>
		<li>断头并取出脑组织8。将脑组织在 4% 多聚甲醛中固定，于 4 °C 下至少放置 48 小时。</li>
		<li>将脑组织浸入 30% 蔗糖溶液中，在 4 °C 下脱水，直至脑组织沉入溶液底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脑组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在 -20 °C 下冷冻。使用冷冻切片机将脑组织切成 14 μm 厚的切片，并贴附于载玻片上。将切片载玻片保存于 -20 °C，待后续使用。</li>
</ol>
6. 普鲁士蓝染色
注意：普鲁士蓝染色法常用于检测SPIO标记细胞中的铁含量。此处采用普鲁士蓝染色以证实MRI图像中的低信号区域对应于SPIO标记的间充质干细胞（MSCs），而非伪影。普鲁士蓝染色是检测组织中铁含量最敏感的组织化学方法之一，甚至可识别细胞内单个铁颗粒。
<ol>
	<li>用蒸馏水清洗脑切片玻片，持续 5 分钟。</li>
	<li>将玻片浸入染色液中 30 分钟进行&#160;普鲁士蓝染色，染色液由等体积的盐酸（10%）和亚铁氰化钾（10%）组成，需在使用前立即配制。</li>
	<li>用蒸馏水洗涤 3 次，每次 5 分钟。用核固红复染切片 5 分钟。用蒸馏水冲洗玻片 2 次。</li>
	<li>将玻片依次浸入 95% 和 100% 乙醇中，各 2 分钟，逐步脱水。用树脂封片剂加盖盖玻片。</li>
	<li>使用光学显微镜观察脑切片中染色的细胞。 
	注意： 标记细胞中的铁会呈现蓝色沉积物。</li>
</ol>

<ol><li>Pelled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad8%2FBMP2-engineered+mesenchymal+stem+cells+induce+accelerated+recovery+of+the+biomechanical+properties+of+the+Achilles+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Research%22%5BJournal%5D)">Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon.</a> Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).</li>
<li>Shahror, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Overexpressing+Fibroblast+Growth+Factor+21+Facilitates+Cognitive+Recovery+and+Enhances+Neurogenesis+in+a+Mouse+Model+of+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury.</a> Journal of Neurotrauma. , (2019).</li>
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<li>Ohtaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+from+bone+marrow+decrease+neuronal+death+in+global+ischemia+by+modulation+of+inflammatory%2Fimmune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).</li>
<li>Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+marrow+stromal+cells+%28MSCs%29+increases+the+expression+of+growth+factors+in+rat+brain+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).</li>
<li>Hoehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo%3A+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).</li>
<li>Reddy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+mesenchymal+stem+cells+labeled+with+a+novel+chitosan-coated+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+using+3.0T+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI.</a> Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).</li>
<li>Roeder, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+of+superparamagnetic+iron+oxide+labeling+on+mesenchymal+stem+cells+chondrogenic+differentiation%3A+a+multi-scale+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study.</a> PLoS ONE. 9 (5), e98451(2014).</li>
<li>Schafer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+human+mesenchymal+stromal+cells+with+superparamagnetic+iron+oxide+leads+to+a+decrease+in+migration+capacity+and+colony+formation+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability.</a> Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).</li>
<li>Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feridex+labeling+of+mesenchymal+stem+cells+inhibits+chondrogenesis+but+not+adipogenesis+or+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis.</a> NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案概述了使用超小超顺磁性氧化铁（SPIO）标记间充质干细胞（MSCs）以及经鼻给药后通过磁共振成像（MRI）追踪SPIO标记MSCs的一般操作步骤。该方案提供了一种非侵入性方法，可用于在体内研究MSCs给药后在脑内的迁移及生物分布情况。
由于间充质干细胞（MSCs）能够分泌神经营养因子，从而1）触发神经修复过程，并2）通过其在损伤区域的抗炎作用提供神经保护，因此MSCs成为基于干细胞治疗中枢神经系统（CNS）疾病和损伤的有吸引力的候选细胞9,10,11,12。尽管由于细胞分裂过程中细胞内超顺磁性氧化铁（SPIO）标记物的稀释，对SPIO标记的MSCs进行长期MRI示踪和检测可能受到限制，但在动物模型脑内移植后数周内仍可检测到标记的细胞13。
本文还描述了使用葡聚糖包被的超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒对间充质干细胞（MSCs）进行标记的方案，该方法无需转染试剂。文献中已报道其他多种标记方案14,15,16。然而，在所有情况下，这些方案均需根据细胞类型、SPIO粒径、孵育时间及SPIO浓度进行优化调整。已有研究表明，SPIO标记后的MSCs其成软骨分化潜能可能受损，但成脂分化潜能未受影响17。因此，强烈建议在干细胞移植前进行分化能力检测，以评估SPIO标记对干细胞分化潜能的影响。在先前的一项研究中已证实，使用与本文相同类型和浓度的SPIO对MSCs进行标记，并不影响其成骨或成脂分化潜能6。
通过鼻内途径递送治疗性干细胞以治疗脑部疾病和损伤，是干细胞临床应用的一种有前景的方法。然而，决定干细胞在鼻腔内行为的内在机制和分子机制仍不明确。尽管鼻内途径已被广泛用于小分子药物的递送，但治疗性干细胞的尺寸和生物分布行为与小分子存在差异。本方案表明，间充质干细胞（MSCs）在经鼻内递送后倾向于向损伤部位迁移。
本研究中采用T2*加权成像来追踪SPIO标记的间充质干细胞（MSCs）。其他研究曾使用梯度回波成像，但由于细胞内SPIO的存在，梯度回波成像常出现磁敏感伪影。在本实验方案中，T2*加权图像上显示的低信号区域（代表SPIO标记的MSCs）的位置与组织学检查所检测到的脑切片中SPIO分布的位置一致（图3）。这表明T2*加权自旋回波成像在脑内SPIO标记的MSCs追踪中具有足够的敏感性。
总之，所述方案有助于脑损伤和脑部疾病中的活体干细胞示踪研究。&#160;干细胞的纵向追踪&#160;体内研究传统上需在多个时间点处死动物。本方案提供了一种非侵入性且高效的方法，用于间充质干细胞（MSCs）的递送与示踪，代表了一种在临床环境中针对脑损伤和脑部疾病开展干细胞治疗的潜在操作流程。

间充质干细胞（MSC）是用于治疗人类中枢神经系统（CNS）疾病和损伤的干细胞疗法中极具前景的候选细胞。此外，MSCs 还被用作递送治疗性蛋白至损伤部位的载体1,2。近年来，已开发出若干有前景的创新技术，旨在建立 1）新型的细胞递送途径和 2）针对 CNS 疾病干细胞治疗的细胞追踪方法。干细胞经鼻入脑的递送依赖于细胞绕过筛骨板并部分通过实质途径进入嗅球的能力3。将经鼻递送与使用超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒标记 MSCs 相结合，为 MSCs 在治疗 CNS 疾病中的临床应用提供了有前景的策略，因为 SPIO 纳米颗粒是磁共振成像（MRI）的安全探针，可实现 MSCs 递送后通过 MRI 进行无创、灵敏且纵向的追踪3,4,5。此外，经鼻递送是一种安全、无创的途径，可在短时间内重复给药。
本文介绍了一种高度敏感且非侵入性的技术，用于在创伤性脑损伤（TBI）小鼠模型中经鼻给药后在体追踪间充质干细胞（MSCs），该技术采用超顺磁性氧化铁（SPIO）标记细胞并结合磁共振成像（MRI）。SPIO标记的一个重要优势在于可通过MRI灵敏地检测组织中的SPIO，从而实现对细胞高效且非侵入性的追踪。本研究使用的SPIO纳米颗粒为市售产品，并标记了异硫氰酸荧光素（FITC）荧光团，因此无需免疫染色或额外处理即可检测组织中的SPIO。此外，该方法还可实现长期实时追踪，并用于研究递送的MSCs在体内的生物分布。

<table><tbody><tr><td>细胞培养耗材（塑料制品）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Varies</td><td>可替换为任意来源</td></tr><tr><td>一次性切片刀</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>含GlutaMAX的D-MEM/F-12（1×）培养基</td><td>GIBCO</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>冷冻组织标本包埋介质（O.C.T.）</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO</td><td>12662-029</td><td></td></tr><tr><td>荧光宽场显微镜</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX43</td><td></td></tr><tr><td>Forcept</td><td>Fine Science Tools</td><td>11293-00</td><td>手术用</td></tr><tr><td>庆大霉素（10 mg/mL）</td><td>GIBCO</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>毛发剪</td><td>Pet Club</td><td>PC-400</td><td></td></tr><tr><td>头部创伤挫伤装置</td><td>Precision Systems and Instrumentation</td><td>Model TBI-0310</td><td></td></tr><tr><td>牛睾丸来源透明质酸酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>ITK-SNAP 软件</td><td>宾夕法尼亚大学宾大图像计算与科学实验室（PICSL）和犹他大学科学计算与成像研究所（SCI）</td><td>ITK-SNAP 3.8.0</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketavet）</td><td>Pfizer</td><td>778-551</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>中国台湾国家实验动物中心</td><td>C57BL6</td><td>本研究中使用的野生型小鼠品系</td></tr><tr><td>微型钻机</td><td>Nakanishi</td><td>NE50</td><td>与钻头配合使用以制备颅骨窗</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>小鼠（C57BL/6）间充质干细胞</td><td>GIBCO</td><td>S1502-100</td><td></td></tr><tr><td>MRI 扫描仪</td><td>Bruker Biospec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Corning Cellgro/ThermoFisher</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>7.5% 聚维酮碘</td><td>Purdue product L.P.</td><td></td><td>外科刷洗剂</td></tr><tr><td>普鲁士蓝染色试剂</td><td>Abcam</td><td>ab150674</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>手术用</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒</td><td>BioPAL</td><td>Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51</td><td>用于通过MRI进行活体追踪的干细胞标记</td></tr><tr><td>单股缝合线</td><td>Ethicon</td><td>G697</td><td>缝合用</td></tr><tr><td>计时器</td><td>Wisewind</td><td></td><td>可替换为任意来源</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>GIBCO</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun）</td><td>Bayer</td><td>QN05 cm92</td><td></td></tr></tbody></table>

通过鼻内递送后利用磁共振成像追踪超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在创伤性脑损伤小鼠模型中的分布

Tracking Superparamagnetic Iron Oxide-labeled Mesenchymal Stem Cells using MRI after Intranasal Delivery in a Traumatic Brain Injury Murine Model

基于干细胞的疗法在治疗创伤性脑损伤（TBI）等脑部损伤方面具有广阔前景，已进入临床试验阶段。然而，细胞递送侵入性强、移植效率低以及细胞追踪困难等技术瓶颈，仍是干细胞转化治疗面临的主要挑战。本文介绍一种新兴的干细胞标记与追踪技术，该技术利用超顺磁性氧化铁（SPIO）&#160;纳米颗粒对间充质干细胞（MSCs）进行标记，并通过鼻内途径递送标记后的MSCs。这些纳米颗粒嵌合荧光素异硫氰酸盐（FITC），可安全地标记MSCs，随后通过鼻内途径递送至TBI模型小鼠的脑部。标记细胞可在体内通过实时磁共振成像（MRI）进行无创追踪。该技术结合SPIO标记与鼻内递送，具有多项重要优势：（1）细胞递送后可在活体内实现长期、无创的MSCs追踪；（2）由于MSCs递送途径无创，可实现多次给药方案；（3）鉴于SPIO的安全性、MRI细胞追踪方法的无创性以及给药途径的可行性，该技术具有潜在的临床应用前景。

鼻内给药24小时后，在T2*加权图像上可见磁性纳米颗粒标记的间充质干细胞（SPIO-MSCs）在皮层损伤部位内侧呈现明显的低信号区域（图2B），表明SPIO成功靶向迁移至损伤部位。该迁移信号在给药后14天内仍可观察到，在此期间低信号强度未见显著减弱（图2B）。经PBS处理的损伤动物未见低信号区域，说明所观察到的低信号区域来源于SPIO标记的MSCs，而非信号伪影（图2A）。通过MRI在活体中观察到的标记MSCs的生物分布情况，采用三维重建技术进行了可视化展示（图2C,D）。通过普鲁士蓝染色以及荧光素标记的SPIO在标记MSCs中的FITC通道检测，组织学分析进一步证实了MSCs向受损皮层的迁移（图3A,B）。
<img alt="用于TBI小鼠研究的MSCs的SPIO标记；示意图、显微镜图像、SPIO分离管。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案的示意图及体外验证MSCs对SPIO的摄取情况。 MSCs（A）将MSCs与SPIO共孵育24小时以进行标记，随后通过鼻内（IN）途径将标记后的MSCs递送至TBI小鼠模型中。在不同时间点进行MRI扫描以追踪标记的MSCs。通过以下方法验证MSCs是否被SPIO充分标记：（B）荧光显微镜观察和（C）使用FITC通道的共聚焦显微镜观察，因为SPIO纳米颗粒已标记FITC。（D）由于铁的负载，标记后MSCs的细胞沉淀呈现深色。FITC = 异硫氰酸荧光素；SPIO = 超顺磁性氧化铁颗粒；MSCs = 间充质干细胞；MRI = 磁共振成像；IN = 鼻内；TBI = 创伤性脑损伤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="14天内TBI的MRI分析，比较PBS和SPIO标记的MSCs；包含光谱拟合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：实时MRI能够检测并追踪SPIO标记的MSC向TBI小鼠脑部损伤区域的迁移。（A）小鼠接受TBI处理后，通过鼻内途径在损伤24小时后给予PBS或SPIO标记的MSC。T2*加权图像的冠状切面显示，在给药后第1、7和14天，标记的MSC在损伤区域边缘（轮廓区域）表现为低信号区（箭头所示）。PBS处理的小鼠未显示低信号区。（B）基于冠状T2*-MRI图像对损伤区域（绿色）和标记MSC（红色）进行分割处理。（C）基于T2*加权图像对小鼠脑部治疗进行三维重建，展示给药后14天SPIO标记MSC在脑内的生物分布情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学分析，普鲁士蓝染色，FITC/DAPI，MSCs，TBI，显微镜图像，细胞研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60450/60450fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：组织学分析证实经SPIO标记的MSCs存在于治疗动物的大脑中。 对（A）PBS处理小鼠（对照组）和（C）SPIO标记MSCs处理小鼠的脑组织切片进行普鲁士蓝染色。在MSCs处理的小鼠中检测到SPIO阳性细胞（方框内细胞，蓝色），而在给药后第14天，对照组小鼠皮层损伤部位未见阳性细胞，该结果与MRI观察结果一致。在给药后第14天，对（B）PBS处理的对照组小鼠和（D）SPIO标记MSCs处理小鼠的皮层进行荧光显微镜分析。结果显示，在MSCs处理小鼠的受损皮层中存在FITC标记的SPIO阳性细胞（方框内细胞，绿色），而在PBS处理小鼠的皮层中未检测到FITC信号。比例尺 = 50 µm，除非另有说明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60450/60450fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在创伤性脑损伤小鼠模型中进行非侵入性间充质干细胞（MSC）递送与示踪的实验方案。采用超顺磁性氧化铁&#160;纳米颗粒作为磁共振成像（MRI）探针，对MSC进行标记，并通过实时MRI技术在经鼻递送后实现非侵入性的活体示踪。

基于干细胞的疗法在脑损伤（如创伤性脑损伤，TBI）的临床试验中展现出良好的应用前景。然而，技术上……

该方法有助于确定间充质干细胞经鼻递送至脑部后在脑内的分布情况。该技术的主要优势在于能够实现间充质干细胞向脑部的无创递送与示踪。此外，可在损伤后的慢性阶段通过多次给药以最大化移植细胞的治疗效果。该技术可最大化将细胞输送至损伤部位，并减少炎性细胞向其他组织的扩散。尽管该技术为间充质干细胞在创伤性脑损伤治疗中的应用提供了研究依据，也可用于非创伤性脑损伤的研究。对间充质干细胞进行超顺磁性氧化铁标记时，向T75培养瓶中80%融合度的间充质干细胞培养物加入6 mL标记培养基，在37°C及5%二氧化碳条件下孵育24小时。第二天，小心吸除上清液，并用六毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，每次洗涤使用六毫升。为确定细胞是否标记成功，在荧光显微镜下观察培养物。为诱导CCI损伤，在确认足底反射消失后，使用电动剪毛器剃除颅骨背侧的毛发，并用浸有碘液的无菌棉签多次清洁剃毛区域。最后一次擦拭后，使用浸有70%乙醇的棉签去除碘，然后将动物放入立体定位仪中。用耳杆和鼻杆固定小鼠，并在剃净的皮肤上做一条2.5厘米长的正中矢状切口，以暴露颅骨表面。用棉垫清除覆盖在颅骨上的组织，并用浸有3%过氧化氢的棉签清洁颅骨表面10秒。用新的棉垫将颅骨擦干，并用铅笔在暴露的骨面上所选坐标周围画一个直径四毫米的圆。使用配备有直径0.5毫米圆形磨头的微型钻，在标记的圆圈区域小心地磨薄颅骨，注意不要施加压力。用干净且干燥的棉签清除骨屑，然后用无菌镊子小心移除形成的骨瓣。当硬脑膜暴露后，将小鼠转移至 CCI 装置的立体定位架中，并使用耳杆和鼻杆固定动物，使头部在前后方向上保持水平。根据控制箱上的说明，使用冲击器底部的 X 和 Y 控制旋钮，将冲击头对准目标皮层坐标的正上方，并将冲击头与暴露的皮层表面调零。通过控制箱设置实验参数：速度为每秒五米，停留时间为 250 毫秒，损伤深度为一毫米，以诱导轻度损伤。然后，按下控制箱上的撞击按钮。若出现出血，用无菌棉签擦拭，并将小鼠从固定架中取出。使用丝线外科缝合线闭合切口，在切口处涂抹局部抗生素，随后将小鼠置于加热垫上，持续监测直至完全恢复卧姿。损伤后一天，用三毫升胰蛋白酶处理标记了超顺磁性氧化铁的间充质干细胞培养物。在37摄氏度下孵育五分钟，加入七毫升预热的含10%胎牛血清的DMEM培养基终止反应，并将细胞悬液收集至15毫升锥形管中。通过离心沉淀细胞，然后将沉淀重悬于PBS中进行计数。然后，将细胞浓度调整为每18微升PBS中含有1.5 × 10⁵个细胞。进行细胞递送时，在确认小鼠对足趾夹捏无反应后，固定小鼠头部并使其头部保持不动。将含有每微升PBS含4单位透明质酸酶的移液枪头以45度角靠近小鼠鼻孔，向每侧鼻孔内注入3微升透明质酸酶悬液。将动物仰面放置在干净的垫子上5分钟，然后重复处理四次，共完成100单位的透明质酸酶处理。最后一次处理后，将小鼠重新放回垫子上静置30分钟，随后按前述方法固定小鼠。固定头部后，在每侧鼻孔内分三次、每次3秒内滴入3 µL间充质干细胞悬液，每次给药后保持小鼠体位30秒，直至液滴完全消失。两分钟后，重复给药最多三次，直至全部间充质干细胞体积完成输送。然后将小鼠放回笼中，并持续监测直至完全恢复卧位。为通过磁共振成像（MRI）追踪间充质干细胞的迁移情况，需将麻醉后的小鼠置于磁共振成像仪的成像固定装置上。然后，将动物固定到位，并将固定装置移至MRI线圈的中心。设置重复时间为1500毫秒，回波时间为2.8毫秒。随后，设置视野为16 × 16毫米，采集矩阵为128 × 128，层厚为0.75 × 0.8毫米，信号平均次数为4次，翻转角为90度，采用自旋回波序列采集T2星加权扫描图像。完成扫描后，将小鼠固定器从MRI线圈中心撤出，并将小鼠放回笼中，持续监测直至完全恢复仰卧状态。为了在T2星号加权图像上追踪并定量标记的间充质干细胞，需在ITK-SNAP软件中打开数据并选择活动标签。使用不同标签颜色，分别对低信号区域以及病灶或其他感兴趣脑区进行分割。使用主工具栏中的多边形工具选择代表超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞的低信号区域，然后点击接受。分割后的区域将显示为与分配给该特定分割的活动标签相同的颜色。当所有切片均完成分割后，使用手术刀工具生成分割区域的三维图，以表示间充质干细胞在整个脑组织中的分布情况。为了对代表标记细胞的分段低信号区域的体积和平均强度进行定量分析，请点击分割并选择体积和统计。鼻内给药后24小时，在T2星权重重像上，超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在皮质损伤内侧表现为明显的低信号区域，表明超顺磁性氧化铁靶向迁移至损伤部位。这种迁移在给药后14天内仍可见，且信号强度无明显减弱。用PBS处理的受伤动物在任何时间点均未出现低信号区域，表明所观察到的低信号区域对应于标记了超顺磁性氧化铁的间充质干细胞，而非信号伪影所致。可通过三维重建、普鲁士蓝染色进行组织学分析，或通过荧光检测标记间充质干细胞内FITC标记的超顺磁性氧化铁，来可视化标记间充质干细胞的生物分布。务必使用组织学或其他方法对MRI结果进行验证。由于超顺磁性氧化铁颗粒可在细胞死亡后仍滞留在组织中，从而导致假阳性信号。通过本方法，可实现对间充质干细胞在脑内归巢能力及其滞留情况的量化，进行可能的无创性时间追踪研究。该技术的发展为再生医学领域的研究人员探索如何提高细胞向脑部特定区域归巢的能力奠定了基础。

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