木质纤维素材料的高通量检测糖化
2011年7月3日
描述一个简单，快速的方法确定了大量的植物生物量的样品糖化潜力。这种分析的自动化平台，涉及植物生物量在96孔板和随后的表现预处理，水解和释放糖的定量分析的准备。
嗨，我是 Kara Ted，我是 Leo。我去吧。我是 Simon McQueen Mason。
植物生物质的消化率是目前非常有趣的话题。这是因为构成这种生物质的植物细胞壁的多糖中含有大量糖分，如果我们能以可用的形式提取这些糖分，我们就可以发酵这些糖分来生产各种产品，例如燃料和化学品。不幸的是，这些材料极难消化，更好地了解是什么控制了消化率是一个紧迫的问题。
因此，为了能够使用植物材料生产更新组，我们需要能够测量这些植物的化潜力。因此，在约克大学，我们正在筛选大量植物材料，以确定它们的制造潜力。Fication 是将复杂的碳水化合物分解成其单糖成分以通过不同的工业过程生产有价值的化学物质的过程。
为了测量生产潜力，我们在微观层面上复制了工业过程，其中我们对生物质进行预处理和酶水解，以确定释放的糖分。这确定了基因型中有趣的品种。高通量系统以 IG 六孔板形式工作。
温和的水解条件用于揭示基因型之间的细微差异，并且它还足够灵活，可以支持不同的底物材料以及评估不同的酶。我们使用的方法包括将植物材料格式化为粉末，然后用 90 度的稀酸或碱预处理 20 分钟。接下来，使用市售纤维素酶混合物在 50 度下进行酶消化 8 小时。
最后，使用 MBTH 方法测定还原糖的释放。植物材料以干茎的形式收获，被切割成四毫米的段。这些样品与三个 5 毫米的金属球一起放入 2 毫升小瓶中。
样品瓶单独贴有条形码标签，扫描条形码以确保样品的可追溯性。样品被加载到机器人中的研磨和格式化机器人中。样品自动研磨和混合 以便将生物质分配到 96 孔板中。
刺穿样品瓶，然后将样品瓶重新定位在机械臂中，使其位于振动以分配粉末的漏斗内。漏斗的振动由天平调节，以达到每个分配孔的质量目标量。将生物质分配到板的 10 列中，留下两列标准品。
通过对每个样品进行 4 次重复，我们每个板加载 20 个样品。该板的水解物将被一式三份分成 PCR 板，得到三个光学板。通过这种方式，我们有三个测定每孔生物质的还原糖分的方法。
格式化后，用硅垫密封板以避免蒸发。当它们准备好时，它们被移动到液体处理机器人。在液体处理过程中，机器人预处理、酶水解和释放的糖分测定都是自动完成的。
两个仪表台上有用于存放所需不同试剂的容器，以及用于塑料器皿的存储空间。有用于预处理和水解的培养箱，以及用于糖分测定的热循环仪。预处理在深孔板中进行。
通过向生物质粉末中加入稀酸或碱溶液。将板转移到加热块并在 90 度下孵育 20 分钟。孵育完成后，用 500 μL 乙酸盐缓冲液冲洗 5 次以去除预处理。
冲洗预处理后，加入酶混合物。这是一种标准混合物。它含有纤维素、诺维酶 1、8、8，比例为 4：1，浓度为每孔 7 FPU。
将板在 50 度下摇动孵育 8 小时。将 75 μL 所得水解物转移到 PCR 板中。在 PCR 板的第 11 列和第 12 列中，加入葡萄糖标准品。
接下来，向所有孔中加入 25 微升一摩尔氢氧化钠。最后，将 50 μL MBTH 试剂移液到 PCR 板中。在水解产物完成转移到第三个 PCR 板后，储存深孔板。
而将 PCR 板移至热循环仪中，在 60 度下孵育 15 分钟。该过程的最后一步是将反应混合物转移到光学板上以显色。孵育后，将 PCR 板从热循环仪中取出。
将 100 μL 氧化试剂添加到转移的反应混合物中。为了促进颜色开发，液体处理过程在 24 小时内运行四次，其中预处理冲洗，添加酶大约需要两个小时。酶水解需要 8 小时，糖分测定需要另外 2 小时。
当第一个板孵育 8 小时时，下一个板开始该过程。通过这种机器人资源的分配，每天可以处理 80 个样品，以确定还原糖的释放量。光学板的额定值为 620 纳米。
分析获得的结果以将释放糖量化为每小时反应毫克纳摩尔。所以，感谢您的观看，我希望这能激发您对生物燃料的研究。
概述
本文介绍了一种使用自动化平台来评估各种植物生物质样品糖化潜力的快速方法。该过程包括预处理、水解和高通量格式下释放糖的定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 生物质转化
- 可再生能源
背景
- 植物生物质含有多糖中难以消化的糖。
- 了解可消化性对于利用植物材料生产可再生燃料至关重要。
- 该研究重点是确定不同植物基因型的糖化潜力。
- 高通量筛选可以识别出适合工业应用的有前景品种。
研究目的
- 开发一种测量植物生物质糖化潜力的方法。
- 促进糖的提取以发酵生产燃料和化学品。
- 增强对影响生物质可消化性因素的理解。
使用的方法
- 植物生物质用酸或碱溶液进行预处理。
- 使用商业纤维素酶混合物进行酶水解。
- 在96孔板格式中进行高通量筛选。
- 用MBTH法在水解后定量还原糖。
主要结果
- 该方法允许快速评估多个样品的糖化潜力。
- 可以检测到不同基因型之间的微妙可消化性差异。
- 自动化过程提高了通量，每天可以分析80个样品。
结论
- 开发的方法对于筛选工业应用的植物生物质是高效的。
- 它提供了对各种植物材料可消化性的洞察。
- 这种方法可以帮助选择用于生物燃料生产的植物品种。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput saccharification assays enable rapid, quantitative assessment of lignocellulosic biomass digestibility, a critical bottleneck in biorefinery feedstock optimization. This platform supports early-stage screening and mechanistic de-risking by revealing genotype-dependent variability in sugar release. The approach enhances predictive confidence for feedstock selection and process development in industrial biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of plant cell wall recalcitrance and digestibility factors.
- Supports identification of genetic or breeding variants with improved saccharification profiles.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying the impact of cell wall composition on sugar release.
- Provides data-driven triage for feedstock advancement in renewable chemical and fuel portfolios.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible saccharification measurements across large sample sets.
- Automates sample preparation, pretreatment, and enzymatic hydrolysis in a 96-well format.
- Generates quantitative outputs (reducing sugars) suitable for comparative analysis and downstream screening.
- Enables scalable evaluation of enzyme formulations and substrate types for process optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns laboratory-scale digestibility data with industrial process conditions for translational relevance.
- Supports continuity from genotype screening to preclinical feedstock validation in biorefinery development.
- Reduces risk of late-stage process failure by providing predictive digestibility metrics early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput assay integrates into the discovery-to-development continuum for renewable feedstocks, bridging early genotype screening with preclinical process validation.
- Discovery Biology: Quantifies saccharification potential to clarify biological bottlenecks in cell wall deconstruction.
- Screening: Provides reproducible, high-throughput assay outputs for genotype and enzyme evaluation.
- Analytics: Delivers nanomole/mg/hour sugar release data for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects laboratory digestibility profiles to industrial biorefinery requirements.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated platform adaptable to diverse plant species and enzyme systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in feedstock selection and process design.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and enables high-throughput scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for feedstock advancement and enzyme optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genotypes and process conditions for industrial biotechnology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell wall biology and enzymatic hydrolysis analytics.
- Depends on automated liquid handling, grinding, and analytical instrumentation infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptable to various plant species and enzyme mixtures with protocol adjustments.
- Throughput and reproducibility are contingent on robotic resource allocation and maintenance.
