Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

这组实验的总体目标是使用比率测量荧光显微镜测量活细胞中的 phaco 体 pH 值。这种方法可以帮助回答吞噬细胞生物学领域的关键问题，例如识别病原体相互作用中的关键分子或遗传破坏或药物对吞噬作用的影响。该技术的主要优点是，与基于群体的方法（如事实或光谱学）不同，可以检测到效应，例如颗粒结合迁移的变化或单个吞噬体的异质性。

这项技术的影响延伸到我们针对病原化学生物的疗法，因为其中许多微生物可以改变 fragoso pH 值，以避免在吞噬体内分心。要开始此过程，请将 20 毫克干燥的 Xan 加入 10 毫升无菌 PBS 涡旋中，并在沸水浴中加热 10 分钟。然后冷却并以 2000 Gs 离心 5 分钟。

之后，去除上清液并将 Xan 重悬于 1 毫升 PBS 中。在水浴中超声处理 10 分钟。然后超声处理将 500 μL 重悬的 Xan 转移到两根 1.5 mL 试管中，并以 11， 000 Gs 离心 5 分钟。

用 500 微升 PBS 重复洗涤。然后在 pH 值为 9.3 的 500 微升新鲜制备的 0.1 摩尔碳酸钠溶液中洗涤 Xan 两次，并在最后一次洗涤后重悬于 490 微升碳酸钠溶液中。随后，将 10 微升溶解在 DMSO 中的 FZ 以 10 毫克/毫升的浓度添加到 Xan 涡旋中。

用箔纸盖住，在室温下搅拌孵育 4 小时要去除未结合的洗眼液，首先用 0.5 ml DMSO 和 150 μL PBS 进行洗眼，包括洗涤步骤之间的超声处理。接下来用 0.5 毫升 DMSO 加 300 微升 PBS 洗涤，然后用 0.5 毫升 DMSO 加 450 微升 PBS 洗涤，然后单独用 PBS 洗涤。之后，将 1 微升 Xan 加入 500 微升 PBS 中并涡旋。

然后将 10 微升稀释的 xma 沙加入血细胞仪室的边缘，在那里它与盖玻片相接，将血细胞仪安装在配备 20 x 物镜的明场显微镜上。专注于包含 16 个方格的左上角，并数出该区域的所有圣诞沙粒。使用手动计数计数器，重复右下角的步骤。

然后使用此方程计算 Xan 浓度。接下来，用狂暴的抗 Xan 抗体在 1 比 100 稀释的涡旋中对标记的 Xan 进行调理，并将样品在 37 摄氏度的水浴中孵育 1 小时。随后，使用血细胞仪对圣诞沙进行计数，然后稀释至每毫升 10 倍 10 至 6 个颗粒。

分离出原代小鼠嗜中性粒细胞后，将 2 乘以 10 至五分之一的嗜中性粒细胞添加到 35 毫米玻璃底培养皿的中心。然后加入 50 μL 培养基，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟，使细胞粘附。然后，加入 1 毫升温热至 37 摄氏度的 HBSS，其中含有骨髓过氧化物酶抑制剂。

将培养皿安装在宽视场荧光显微镜上，该显微镜配备 37 摄氏度加热系统和 40 倍油物镜。将细胞孵育 10 分钟而不进行成像，以使细胞和设备达到平衡。接下来，调整显微镜设置以每 30 秒获得 440 纳米或 490 纳米激发和 535 纳米发射的明场透射图像。

两分钟后，将 10 乘以 10 的 6 分 fitzy zy 沙子加入到培养皿中央，继续成像 30 分钟。30 分钟后，停止延时采集并启动计时器。移动载物台并在不同的视野中捕获 10 张或更多快照，以便在 5 分钟内对其他 vaga 区域进行成像。

在此过程中，解冻校准溶液并在水浴中加热至 37 摄氏度。用 pH 计检查 pH 值并记录下来。接下来，在图像采集之前，将蠕动泵安装在玻璃底培养皿上。

然后在 30 分钟采集期结束时进行实时视频显微镜检查。打开泵以去除培养皿中的溶液。随后，加入 1 毫升第一种校准溶液并停止泵。

等待 5 分钟，直到信号稳定下来。对每种校准溶液重复该过程。要分析延时电影和吞噬体快照，请打开带有图像的图像 J.减去 490 通道中的背景，方法是在没有单元格的区域绘制一个小方形 ROI。

使用方形多边形选择工具并单击 plugins。然后是 BG 减法。单击 edit 在 440 渠道上上传相同的 ROI。

然后选择 select 然后 restore selection 并重复背景扣除过程。首先单击过程，制作 490 通道除以 440 通道的 32 位比例图像。然后是图像计算器。

之后，在图像 1 和 图像二 下拉菜单。选择 divide 在作下拉菜单中，然后选中 32 bit result 复选框。之后，通过单击图像，然后单击 up tables 将颜色编码查找表更改为与比率兼容的颜色编码。

然后是彩虹 RGB。为比率图像设置阈值，以通过单击图像来消除零像素和无穷大像素。然后 adjust 后跟 threshold。

调整滚动条，使 Xan 显示为红色，然后单击 apply，并确保选中 set background pixels to nan 复选框。如果背景和 Xan 信号值产生的比率值非常相似，从而导致比率图像出现噪点，请单击"处理"，将少量背景添加回 440 通道。然后是数学。

然后添加，然后重新制作比率图像以获得更清晰的结果。或者，省略 440 通道背景减法。接下来，通过单击图像颜色，将此比率堆栈与明场通道合并为多通道合成。

然后合并频道。在灰色通道下拉菜单中选择明场图像，并在绿色通道下拉菜单中选择比例图像。然后选中 keep source images 复选框。

之后，扫描比较明场和比率通道的延时电影或快照以确定要分析的吞噬体，使用椭圆形多边形选择工具在吞噬体周围绘制 ROI，并通过单击分析工具将它们添加到 ROI 管理器。然后 ROI 管理器，然后是 add，然后通过单击更多多重测量来测量他们的 Xan 强度比率，并取消选中每个切片一行复选框。对于延时短片。

通过绘制 ROI 类型控件 M 来测量每个时间点，并在必要时移动 ROI 以跟踪随时间变化的强度值，从而一次跟踪一个 FGA 区域。然后将测量结果从结果窗口复制到电子表格中，以将荧光转换为 pH 值。在电子表格中测量校准延时电影中吞噬体的 490 与 440 比率后，绘制随时间变化的比率值。

然后计算与每种 pH 校准溶液相对应的时间段中间的五个时间点视野内所有吞噬体的平均比率值。通过将至少三个独立的校准组合到一个图表中，将这些 490 到 440 的平均比率值与实际测量的 pH 值作图。然后执行非线性回归分析，以获得将比率值转换为 pH 值的方程。

该图显示了如何区分吞噬体和摄入的 Xan。左侧面板显示了合并的明场图像以及 490 到 440 的 Fitz zy 和比率。而右侧面板仅显示明场图像。

吞噬体可以与外部颗粒区分开来，这些外部颗粒要么不与细胞共定位，要么其荧光与明场图像中所示的吞噬体特征的较亮环包围的暗中心不匹配。以下是野生型和 HV CN one 敲除中性粒细胞 FGA 在野生型中性粒细胞 pH 值的典型时间过程，pH 值在早期时间点为中性或微碱性摄入后，HV CN one 敲除中性粒细胞的吞噬体可以是碱性或酸性编译。在添加靶标后 30 至 35 分钟拍摄快照，可以从此处显示的 Fitz Xan 比率直方图中的大量吞噬体计算平均群体 smal pH 值。

我们可以看到野生型和 HVCN one 敲除中性粒细胞之间 s小 pH 值的差异一旦掌握，这项技术可以在 6 小时内完成。在尝试此过程时，从优化步骤开始，请务必记住优化成像条件。首先，优化优化步骤的抗体浓度也有助于确保稳健的吞噬作用遵循此程序。

可以执行其他方法，例如测量 Ross 的产生或测量细菌杀灭，以回答其他问题，例如小 Ross 或吞噬体杀死细菌的能力是否在发育后随着 pH 值而改变。这项技术为吞噬细胞生物学领域的研究人员铺平了道路，以探索哪些因素会影响吞噬细胞杀死或处理摄入物质以引发进一步免疫反应的能力。观看此视频后，您应该对如何进行几何荧光显微镜检查以实时测量活细胞中吞噬体的生理参数有很好的了解。

不要忘记，使用 UNIFOR 抑制剂和活细胞可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套。