实验方法来研究线粒体定位和核细胞周期激酶CDK1功能
2016年2月25日
在这里，我们概述了如何研究（细胞周期）激酶的线粒体定位，以及如何确定其线粒体亚位置以及潜在的线粒体底物/靶标。蛋白质强制表达到线粒体中为研究目标蛋白质线粒体定位的功能后果提供了有用的工具。
以下程序的总体目标是确定正常核细胞周期激酶的线粒体定位，然后分析其线粒体定位如何影响细胞周期的进程。这种方法可以帮助回答线粒体研究领域的关键问题，例如细胞核在细胞周期中如何与线粒体交流。通过用线粒体前导序列标记蛋白质，我们可以利用线粒体中蛋白质的特异性表达，因此我们可以研究它们的线粒体特异性功能。
虽然这种方法可以深入了解某些蛋白质的线粒体靶向，但它也可以应用于其他细胞器，例如细胞核、ER、高尔基体和溶酶体。根据文本方案对细胞进行培养、匀浆和沉淀后，将上清液转移到新管中。并将样品在 7， 000 g 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。
然后使用 200 微升冰冷的 IBC 缓冲液重悬沉淀，并将匀浆分成两个等分试样。再次将样品以 7， 000 g 和 4 摄氏度离心 10 分钟。然后重复洗涤。
弃去上清液后，向其中一个沉淀中加入 30 微升细胞裂解缓冲液，并将裂解物储存在 80 摄氏度用于免疫印迹。要使用第二个沉淀进行碳酸钠提取以分离可溶性和膜结合蛋白，请加入 250 微升 0.1 摩尔碳酸钠 pH 11.0，并在冰上孵育 30 分钟。以 100， 000 g 离心 20 分钟。
然后收集上清液并加入等体积的新鲜制备的 20% 三氯乙酸以沉淀蛋白质。在冰上放置 30 分钟。同时，向沉淀中加入 30 微升细胞裂解缓冲液，并根据文本方案进行超声处理，然后在 80 摄氏度下储存以进行免疫印迹。
TCA 孵育 30 分钟后，以 15， 000 g 离心反应 10 分钟。弃去上清液，然后使用 80 μL 细胞裂解缓冲液重悬沉淀。按照文本方案中的说明从细胞中分离线粒体组分后，将线粒体组分分成 10 等份。
在 7， 000 g 和 4 摄氏度下沉淀样品 10 分钟。使用 30 微升不同浓度的低渗蔗糖缓冲液（含或不含胰蛋白酶）溶解每个沉淀。并在冰上孵育 30 分钟。
向含胰蛋白酶的小瓶中加入 3 微升 10 毫摩尔 PMSF，以停止胰蛋白酶消化。并在冰上孵育 10 分钟。将样品在 14， 000 g 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。
并将上清液转移到新管中。要裂解沉淀，请添加 30 μL 细胞裂解缓冲液。按照文本方案中的说明对样品进行超声处理，并储存在 80 摄氏度。
为了构建线粒体靶向 GFP/RFP 标记的细胞周期蛋白 B-1 Cdk-1 载体，从人细胞色素-c 氧化酶亚基 8A 的前体克隆线粒体靶向序列，并在 pEGFP-N1 或 pERFP-N1 的 Nhe1 和 bAmH1 位点与 GFP 或 RFP 的 n 末端相框，使用标准分子克隆技术。使用文本方案中概述的引物，按照标准技术扩增 Cdk1 和 cyclinB1 基因。然后使用 BamH1 消化 PCR 产物。
在 1% 琼脂糖凝胶上运行反应，然后使用剃须刀片切下正确大小的 DNA 片段。然后使用凝胶提取试剂盒纯化 DNA。接下来，在 37 摄氏度下用 1 微升 BamH1 消化 1 微克 MTS-pEGFP-N1 和 MTS-pERFP-N1 质粒，持续 2 小时。
然后加入 1 微升小牛肠道碱性磷酸酶，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在 1% 琼脂糖凝胶上运行消化产物并如前所述纯化 DNA 后，使用文本方案中列出的试剂设置连接反应。然后将反应物在 4 摄氏度下孵育过夜。
用 10 μL 连接混合物转化大肠杆菌 dH5-α 感受态细胞。并在 LB 琼脂加每毫升 10 毫克卡那霉素平板上在 37 摄氏度下培养细菌过夜。
第二天，使用无菌移液器吸头从板中挑取菌落。并将尖端插入含有 5 毫升 LB 卡那霉素的试管中。孵育培养物过夜，第二天早上，根据文本方案使用小型制备试剂盒分离质粒。
要转染指数生长的 MCF-10A 细胞，请使用 Cdk1 或 cyclinB-1 质粒在 100 μL 血清和无抗生素培养基中以 1：2 的比例制备质粒转染试剂。转染细胞并在 37 摄氏度下孵育 48 小时。根据文本方案对线粒体进行染色和可视化。
为了进行细胞分选，使用 2.5 mL 血清和无抗生素培养基中制备的 DNA 与转染试剂的 1：2 比例，在 6 孔板中用所需载体转染 2 倍 10 到第 5 个细胞。孵育转染 48 小时后，根据文本方案，使用流式细胞术对稳定表达 GFP 标记的 Cdk-1 和 RFP 标记的 clyclinB1 蛋白的细胞进行活选。为了使用 EdU 标记流式细胞术测定法测量细胞周期长度，将分选的细胞以 2.5 倍的密度接种在 6 孔板中，每孔 10 至第 5 个细胞。
孵育过夜后，将 EdU 以终浓度为 25 微摩尔的浓度添加到培养基中，再孵育一小时。然后每隔两小时，使用 1% BSA 的 500 μL PBS 溶液洗涤一个细胞孔。并收集在 1.5 毫升试管中。
将细胞以 350 g 离心 5 分钟。然后丢弃上清液。通过添加 100 微升固定液去除沉淀。
充分混合并在室温下孵育 15 分钟。接下来，使用 1 毫升 1% BSA 的 PBS 溶液洗涤细胞 3 次。然后使用 0.5 毫升 70% 乙醇将细胞在 4 摄氏度下固定过夜。
当使用转染 GFP 和 RFP 标记蛋白的细胞进行 EdU 标记时，淬灭来自 GFP 和 RFP 的荧光信号至关重要。为了实现这一目标，我们增加了一个额外的步骤，即使用 70% 乙醇进行过夜细胞固定。第二天，根据文本方案洗涤和透化细胞后，向每个试管中加入 0.5 毫升反应混合物并充分混合。
在黑暗中孵育并再次洗涤后，使用 50 μg/mL 碘化丙啶或 PI 在 1% BSA PBS 中对 DNA 进行染色。通过流式细胞术分析细胞以跟踪 EdU 阳性群体。呈现 DNA 含量和 EdU 染色的 EdU 标记细胞的散点图。
使用 Alexa 647 EdU 的 APC 通道，使用 670 30 带通滤光片，所有光线都存在，小于 685 纳米照射到该滤光片上，而 PI 的藻红蛋白通道前面有一个 581 15 带通滤光片，所有存在的光照射到该滤光片上的光线都小于 600 纳米。使用用于采集的标准设门策略，逐个 SSC 面积绘制 FSC 面积进行形态学，然后用 PI 和 Alexa 647 EdU 绘制细胞染色。逐个记录所有试管的数据，每个样品采集 10， 000 个事件。
在该图中，线粒体基质蛋白 Hsp60 和膜间空间蛋白 Timm13 用作线粒体定位标志物。与 Hsp60 类似，但与 Timm13 不同，cyclinB1 和 Cdk1 受到保护，不受胰蛋白酶消化，表明它们定位于线粒体基质。如此处所示，通过使用 MTS 和 GFP 标记的细胞周期蛋白 B1 和 Cdk-1 构建体对分离的线粒体组分进行蛋白质印迹，在线粒体中实现了细胞周期蛋白 B1 和/或 Cdk-1 的过表达。
使用 EdU 脉冲追踪测定，证明标记的 S 期细胞通过 G2M 期进展，并在表达野生型线粒体细胞周期蛋白 B1 Cdk-1 的细胞中最快 4 小时出现 G1 期。与 6 小时相比，在转染载体对照或突变细胞周期蛋白 B1 Cdk-1 的细胞中，表明线粒体细胞周期蛋白 B1 Cdk-1 的增强加速了细胞周期进程。按照此程序，可以测量其他方法，如线粒体 ATP 生成、耗氧量、膜电位和活性氧，以回答其他问题，例如细胞周期激酶 Cdk-1 的线粒体定位如何改变线粒体呼吸和能量输出。
观看此视频后，您应该对如何研究核激酶的线粒体定位和线粒体特异性功能有很好的了解。
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概述
本文概述了一种研究细胞周期激酶线粒体定位及其亚线粒体位置的方法。该方法还探索了潜在的线粒体底物和靶标，为线粒体定位的功能后果提供了见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 线粒体研究
- 细胞周期调控
背景
- 线粒体在细胞功能和与细胞核的通讯中扮演着关键角色。
- 了解蛋白质定位可以揭示它们特定功能的见解。
- 这种方法可以应用于线粒体之外的各种细胞器。
- 细胞周期激酶通常定位于细胞核中，但可能具有线粒体作用。
研究目的
- 确定核细胞周期激酶的亚线粒体定位。
- 分析线粒体定位如何影响细胞周期进程。
- 研究细胞周期过程中细胞核和线粒体之间的通讯。
使用的方法
- 用线粒体靶向序列标记蛋白质。
- 在线粒体中强制表达蛋白质。
- 按照协议培养、均质化和离心细胞。
- 离心样品以分离线粒体部分。
主要结果
- 成功地将激酶定位于线粒体中。
- 对线粒体定位的功能后果有了洞察。
- 潜在地识别线粒体底物/靶标。
- 展示了该方法对其他细胞器的应用。
结论
- 该方法为研究线粒体蛋白功能提供了框架。
- 了解线粒体定位可以增强细胞周期调控的知识。
- 这种方法可以适用于各种细胞器，扩大了其适用性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Studying mitochondrial localization of nuclear-encoded kinases like Cdk1 enables mechanistic de-risking of cell cycle regulators by revealing non-canonical functions that may influence proliferation signaling. This approach supports target validation by distinguishing mitochondrial-specific activity from nuclear/cytoplasmic pools, improving predictive confidence in early discovery. It provides a reusable platform for assessing subcellular isoform function, directly informing go/no-go decisions in kinase-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating mitochondrial-specific kinase activity without perturbing nuclear or cytoplasmic functions.
- Operational Value: Uses MTS tagging to achieve compartment-specific overexpression or dominant-negative inhibition for clear causal inference.
- Scientific Value: Identifies mitochondrial phosphoprotein targets via 2D-DIGE and phosphostaining, supporting functional de-risking of kinase substrates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively comparable mitochondrial lysates for downstream assay development using standardized fractionation.
- Operational Value: Produces reproducible submitochondrial matrix vs. membrane localization data via carbonate extraction and protease protection assays.
- Scientific Value: Enables EdU-based proliferation readouts to link mitochondrial kinase activity to cell cycle progression in a scalable flow cytometry format.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates how mitochondrial Cdk1 accelerates G2/M-to-G1 transition, providing a disease-relevant system for cell cycle dysregulation models.
- Operational Value: Establishes a workflow to measure mitochondrial respiration, ATP, ROS, and membrane potential following kinase localization.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement by linking subcellular kinase activity to proliferative phenotypes and energetic output.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling subcellular resolution of kinase function before phenotypic screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by decoupling mitochondrial kinase effects from canonical nuclear cell cycle regulation.
- Screening: Delivers standardized mitochondrial fractions and EdU-compatible lysates for reproducible compound effect assessment.
- Analytics: Generates phosphoprotein profiles and proliferation metrics that allow side-by-side comparison of wild-type versus mutant kinase conditions.
- Translational Research: Connects mitochondrial kinase localization to cell cycle progression and bioenergetic parameters for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: The MTS-tagging and fractionation platform is adaptable to other nuclear proteins suspected of moonlighting in mitochondria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic separation of subcellular kinase functions.
- Operational Value: Standardized subcellular fractionation and immunoblotting ensure reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions by revealing mitochondrial contributions to kinase-driven phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of kinase inhibitors based on subcellular site of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, mitochondrial isolation, and Western blotting.
- Dependent on ultracentrifugation equipment for subcellular fractionation and protease protection assays.
- Needs standardization of MTS tagging efficiency and expression levels across cell lines.
- Adaptation to other organelles requires validation of targeting sequence specificity and functionality.
- Practical limitation: Overexpression may not reflect endogenous stoichiometry; results should be validated with knockdown or endogenous tagging where possible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Sodium Carbonate Extraction of Intact Mitochondria
3:07
Separation of Inner and Outer Membranes of Mitochondria
4:22
Construction of Mitochondria-targeted GFP/RFP-tagged CyclinB1/Cdk1 Vectors and Mitochondria Localization
7:23
Determination of Cell Cycle Phase Lengths with EdU Incorporation Assay
10:58
Results: Mitochondrial Analysis of CyclinB1 and Cdk1
12:25
Conclusion
