Name: 实验方法来研究线粒体定位和核细胞周期激酶CDK1功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: 学习利用线粒体靶向序列标记技术研究核细胞周期激酶CDK1的线粒体定位及其亚定位方法，该方法可揭示线粒体定位对细胞周期调控的功能影响。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 CA133402、CA152313 以及美国能源部科学办公室 DE-SC0001271 的支持。我们感谢加州大学戴维斯分校流式细胞术共享资源实验室，该实验室获得了美国国家癌症研究所（NCI）P30 CA0933730、NIH 国家研究中心资源（NCRR）C06-RR12088、S10 RR12964 和 S10 RR026825 资助，并感谢 Ms. Bridget McLaughlin 和 Mr. Jonathan Van Dyke 在流式细胞术实验中提供的技术支持。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

与其他靶向特定亚细胞器的蛋白质类似，线粒体靶向蛋白在其一级或二级结构中具有靶向信号，这些信号在复杂的蛋白质转运和折叠机器的协助下，引导蛋白质到达线粒体21,22。来源于 exclusively 定位于线粒体的蛋白质（如 COX8）的线粒体靶向序列（MTS）可被添加至任意基因序列的N端，从而将特定蛋白质靶向导入线粒体11,23,24。在此研究中，CyclinB1 和 Cdk1 基因被克隆至含有 COX8 MTS 的载体中，表达后，重组的 CyclinB1 和 Cdk1 被定位至线粒体。该方法的优势在于，可在不改变整体基因表达水平的前提下，实现对特定亚细胞区室（本例中为线粒体）内基因表达的调控。通过该策略，确定了核激酶 Cdk1 的线粒体特异性功能。类似地，通过将 MTS 添加至显性负性 Cdk1，实现了对 Cdk1 线粒体特异性功能的敲低，从而鉴定了 Cdk1 的线粒体特异性靶点，并可分析 Cdk1 功能在线粒体中缺失所导致的功能后果。若过表达未携带 MTS 标签的 Cdk1，则会导致 Cdk1 在线粒体和细胞核中均表达升高，从而复杂化对 Cdk1 线粒体特异性作用后果的进一步研究。
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在哺乳动物中，细胞周期的进程依赖于由细胞周期蛋白（cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdks）调控的高度有序的事件1。CyclinB1/Cdk1通过其在细胞质、细胞核和中心体的定位，能够协调有丝分裂中的多种事件，例如核膜破裂和中心体分离2。CyclinB1/Cdk1可保护有丝分裂期细胞免于凋亡3，并促进线粒体分裂，这是线粒体均等分配至新形成的子细胞的关键步骤4。
在增殖的哺乳动物细胞中，线粒体ATP通过氧化磷酸化（OXPHOS）系统（即电子传递链）生成，该系统由5个多亚基复合物组成：复合物I至复合物V（CI-CV）。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）：泛醌氧化还原酶，即复合物I（CI），是这五种复合物中最大且最不明确的一个5。该复合物包含45个亚基，其中14个构成催化核心。组装完成后，复合物呈现L形结构，一臂伸入基质，另一臂嵌入内膜6,7。CI亚基的突变可导致多种线粒体疾病8。功能高效的CI不仅对整体线粒体呼吸至关重要9，也对细胞周期的顺利进行具有重要作用10。揭示该膜结合酶复合物在健康与疾病状态下功能机制，有助于开发新型诊断方法和先进治疗策略。在最近的一项研究中，我们发现CyclinB1/Cdk1复合物在G2（间隙2期）/M（有丝分裂期）阶段转位至线粒体，并磷酸化CI亚基，从而增强线粒体能量产生，可能用于满足细胞周期过程中增加的能量需求11。本文以CyclinB1/Cdk1为例，展示可用于研究通常位于细胞核/细胞质的激酶向线粒体的转位、其线粒体底物以及其在线粒体定位后功能影响的实验方法与策略。
研究发现，CyclinB1/Cdk1 复合物在需要时会转位至线粒体，这一发现推动了针对该复合物在线粒体中特异性过表达和敲低的研究。为实现蛋白质在线粒体中的特异性表达，可在目标蛋白的 N 末端添加一段线粒体靶向序列（mitochondria targeting sequence, MTS）。线粒体靶向序列能够将线粒体蛋白分选至其正常定位的线粒体中12。我们采用了一段来源于人细胞色素 c 氧化酶亚基 8A（COX8）前体的 87 个碱基的线粒体靶向序列，并将其以同框方式克隆至表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的 CyclinB1 或红色荧光蛋白（RFP）标记的 Cdk1 的质粒中。该方法使我们能够将 CyclinB1 和 Cdk1 特异性地靶向至线粒体，从而在不影响其细胞核内蛋白水平的情况下，特异性改变它们在线粒体中的表达。通过荧光标记这些蛋白，我们能够实时监测其定位情况。类似地，我们也将 MTS 引入含有 RFP 标记的显性负性 Cdk1 的质粒中，从而特异性地敲低 Cdk1 在线粒体中的表达及其功能。对于像 Cdk1 这类具有双重定位的激酶，区分其在线粒体和细胞核中的功能至关重要。将 MTS 构建至这些双功能激酶的 N 末端，是一种简便且高效的策略。
由于Cdk1是一种细胞周期激酶，因此在Cdk1定位于线粒体时，确定细胞周期进程显得至关重要。为此，我们采用了一种新方法来监测细胞中的DNA含量。传统方法包括使用BrdU（溴脱氧尿苷），这是一种合成的胸苷类似物，可在细胞周期S期掺入新合成的DNA中以替代胸苷。随后可通过抗BrdU抗体检测正在活跃复制DNA的细胞。该方法的一个缺点是需要通过强酸或高温等剧烈手段对DNA进行变性处理，以便BrdU抗体能够结合，这可能导致实验结果不一致13,14。作为替代方案，我们采用了一种类似的方法，使用另一种胸苷类似物EdU来监测活跃分裂的细胞。EdU检测无需剧烈的DNA变性处理，仅需温和的去垢剂处理即可使检测试剂进入新合成的DNA并与EdU结合。EdU方法已被证明更加可靠、结果更一致，并具有实现高通量分析的潜力15。
最后，为了确定Cdk1的线粒体底物，我们使用了一种名为二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）的蛋白质组学工具，这是经典双向凝胶电泳的高级版本。双向电泳在第一维中根据蛋白质的等电点进行分离，在第二维中根据其分子量进行分离。由于磷酸化等翻译后修饰会影响蛋白质的等电点和分子量，因此二维凝胶可以检测不同样品中蛋白质磷酸化状态的差异。蛋白质斑点的大小（面积和强度）随蛋白质表达水平的变化而变化，从而实现多个样品之间的定量比较。利用该方法，我们能够区分在表达野生型与突变型线粒体靶向Cdk1的细胞中磷酸化蛋白质的差异。那些在野生型样品中出现但在线粒体靶向突变型Cdk1样品中缺失的特异性蛋白质斑点被分离出来，并通过质谱分析进行鉴定。
在传统的二维凝胶电泳中，使用三苯甲烷类染料对凝胶上的蛋白质进行显色。二维荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）则采用对蛋白质电泳迁移率影响极小的荧光蛋白标记物。不同的蛋白质样品可用不同的荧光染料标记后混合，并在同一块凝胶中进行分离，从而实现多个样品在单块凝胶上的共电泳16。这种方法可显著减少凝胶间的差异，而凝胶间差异是基于凝胶的蛋白质组学研究中的一个关键问题。

<table><tbody><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P ATP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠二抗</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 标记</td></tr><tr><td>抗兔二抗</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 标记</td></tr><tr><td>ATP</td><td>研究有机物</td><td>1166A</td><td>体外激酶实验</td></tr><tr><td>Cdk1 抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1激酶缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>使用 EdU 标记进行细胞周期分析</td></tr><tr><td>COX IV 抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>4844S</td><td>用于线粒体免疫染色</td></tr><tr><td>细胞周期蛋白B1抗体</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>细胞周期蛋白B1/细胞周期蛋白依赖性激酶1酶复合物</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>避免冻融循环</td></tr><tr><td>CyDye DIGE 荧光标记试剂盒</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE 凝胶和 DIGE 缓冲液试剂盒</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>用于定点突变</td></tr><tr><td>Dpn I 酶</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>用于定点突变</td></tr><tr><td>干条覆盖液</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>用作矿物油</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge 浓缩仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>用作真空离心浓缩仪</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>抗荧光淬灭封片液</td></tr><tr><td>Fortessa 流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td>649908</td><td>使用 EdU 标记进行细胞周期分析</td></tr><tr><td>组蛋白 H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>体外激酶实验</td></tr><tr><td>QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>用于从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段</td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip 凝胶</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>等电聚焦胶条</td></tr><tr><td>固定化谷胱甘肽</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15160</td><td>谷胱甘肽-琼脂糖珠</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 等电聚焦仪</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>IPGphor 胶条支架</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷&amp;nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>用于细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>用于CyDye标记</td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red/Green</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>线粒体荧光染料</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemicals</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>表达GFP的载体</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td>GST表达载体</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 透析管</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>用于透析的多孔膜管</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond 磷蛋白凝胶染色剂</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>用于二维凝胶上磷酸化蛋白的染色</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>用于细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>QuikChange 定点突变试剂盒</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>MiniPrep 质粒提取试剂盒</td></tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis 生物化学公司</td><td>270-463-M001</td><td>Cdk1抑制剂</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>复合物 I 抑制剂</td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0420-5</td><td>用于细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>偏钒酸钠</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>用于细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>十水合焦磷酸钠</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>用于细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>钠 &amp;beta;-甘油磷酸盐</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>用于细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>M2E</td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨器杵</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>用于线粒体分离</td></tr><tr><td>组织研磨管</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>用于线粒体分离</td></tr><tr><td>三氯乙酸溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>台风成像仪</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>用于二维差异凝胶电泳的激光凝胶扫描仪</td></tr><tr><td>辅酶Q</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

研究核细胞周期激酶cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

尽管线粒体拥有自身的转录机制，但仅有约1%的线粒体蛋白在线粒体内合成。由细胞核编码的蛋白则通过其线粒体靶向序列（MTS）被转运至线粒体；然而，大多数定位于线粒体的蛋白并不具有可识别的MTS。尽管如此，MTS能够引导蛋白进入线粒体这一特性，为研究通常定位于细胞核和/或细胞质的蛋白在线粒体中的功能提供了有价值的工具。我们近期在线粒体中鉴定了细胞周期激酶CyclinB1/Cdk1复合物。为了特异性地研究该复合物在线粒体中的功能，必须实现在线粒体中对该复合物的过表达和敲低，同时不干扰其在细胞核或细胞质中的功能。通过将CyclinB1/Cdk1与MTS融合标记，我们成功实现了该复合物在线粒体中的过表达，从而研究其线粒体靶标及功能。此外，通过将显性负性Cdk1与MTS融合标记，实现了对Cdk1活性的特异性线粒体抑制。我们采用基于凝胶的蛋白质组学方法鉴定了CyclinB1/Cdk1复合物潜在的线粒体靶标。与传统的二维凝胶分析不同，我们采用了二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术，并结合磷酸化蛋白染色，对表达线粒体Cdk1的细胞中差异磷酸化的蛋白进行荧光标记。通过比较野生型与携带显性负性Cdk1的线粒体中发生改变的磷酸化蛋白点，确定了Cdk1的线粒体靶标。最后，为了确定CyclinB1/Cdk1在线粒体中定位对细胞周期进程的影响，我们使用合成胸腺嘧啶类似物EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）进行细胞增殖检测，以监测细胞在细胞周期中的进程及其DNA复制情况。综上所述，我们展示了一系列可用于研究细胞周期激酶在线粒体中定位与活性的方法。这些方法先进且易于操作，将对众多细胞生物学研究人员具有重要帮助。

细胞周期蛋白B1和Cdk1的线粒体亚定位
碳酸钠提取法可用于确定蛋白质是位于线粒体内还是位于外表面，即外膜。一旦证实蛋白质定位于线粒体内，可通过线粒体破膜（mitoplasting）结合蛋白酶消化进一步确定其线粒体亚结构定位。为明确CyclinB1或Cdk1的线粒体亚结构定位，通过将线粒体稀释至低渗缓冲液中，并逐步降低渗透性蔗糖浓度（从200 mM降至25 mM），从而分离获得线粒体破膜结构（mitoplasts）。当蔗糖浓度降至150 mM时，外膜开始破裂，而内膜则保持完整，直至蔗糖浓度最终降至25 mM（图1A）。结合线粒体破膜处理，可使用胰蛋白酶进行蛋白酶保护实验，消化外膜破裂后暴露的蛋白质，从而降解位于膜间隙的蛋白质。若目标蛋白质未被胰蛋白酶消化，则表明该蛋白质定位于线粒体基质。在此代表性图示中，线粒体基质蛋白Hsp60和膜间隙蛋白Timm13被用作线粒体亚结构定位的标志物。C...

本文概述了如何研究一种（细胞周期）激酶在线粒体中的定位，以及如何确定其在线粒体内的亚结构定位和潜在的线粒体底物或靶标。将蛋白强制表达于线粒体中，是研究目的蛋白在线粒体定位后所产生功能效应的有效工具。

研究核细胞周期激酶Cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

尽管线粒体拥有自身的转录机制，但仅有1%的线粒体蛋白在线粒体内合成。

以下实验方案的总体目标是确定一种通常位于细胞核内的细胞周期激酶在亚线粒体中的定位，并进一步分析该激酶在线粒体中的定位如何影响细胞周期的进程。该方法有助于回答线粒体研究领域中的关键科学问题，例如细胞核在细胞周期过程中如何与线粒体进行通讯。通过将蛋白质与线粒体靶向序列进行标记，我们可以特异性地在线粒体中过表达目标蛋白，从而研究其在线粒体中的特异性功能。尽管该方法可用于研究特定蛋白质向线粒体的靶向运输，但也同样适用于其他细胞器，如细胞核、内质网、高尔基体和溶酶体。按照文本方案进行细胞培养、匀浆和离心收集细胞后，将上清液转移至新离心管中，并在4摄氏度条件下以7,000 g离心10分钟。然后用 200 微升预冷的 IBC 缓冲液重悬沉淀，并将匀浆液分成两等份。在 7,000 g 和 4 摄氏度条件下再次离心 10 分钟，重复洗涤一次。弃去上清液后，向其中一个沉淀物中加入 30 微升细胞裂解缓冲液，并将裂解物在 -80 摄氏度保存，用于免疫印迹分析。为了利用第二个沉淀物进行碳酸钠提取以分离可溶性蛋白和膜结合蛋白，加入 250 微升 0.1 摩尔碳酸钠（pH 11.0），并在冰上孵育 30 分钟。随后在 100,000 ×g 离心 20 分钟。然后收集上清液，并加入等体积新配制的20%三氯乙酸以沉淀蛋白质。冰上放置30分钟。在此期间，向沉淀物中加入30微升细胞裂解缓冲液，按照文本方案进行超声处理，随后于80摄氏度保存用于免疫印迹分析。在30分钟TCA孵育后，以15,000 g离心反应液10分钟。弃去上清液，然后用80 µL细胞裂解缓冲液重悬沉淀。按照文本方案所述分离细胞的线粒体组分后，将线粒体组分均分为10份。在 7,000 g 和 4 摄氏度下离心样品 10 分钟。使用 30 微升一系列浓度的低渗蔗糖缓冲液（含或不含胰蛋白酶）溶解每个沉淀。然后在冰上孵育 30 分钟。向含有胰蛋白酶的小管中加入 3 微升 10 毫摩尔的 PMSF，以终止胰蛋白酶消化反应。然后在冰上孵育 10 分钟。在 4 摄氏度、14,000 g 条件下离心样品 10 分钟。将上清液转移至新离心管中。为裂解沉淀，加入30 µL细胞裂解缓冲液。按照文本方案中所述进行超声处理，并于-80 °C保存。为构建靶向线粒体的GFP/RFP标记的cyclinB1-Cdk1载体，采用标准分子克隆技术，从人细胞色素c氧化酶亚基8A前体中克隆线粒体靶向序列，并利用NheI和BamHI位点将其与pEGFP-N1或pERFP-N1载体中GFP或RFP的N端进行框内连接。根据文本方案中列出的引物，采用标准技术扩增Cdk1和cyclinB1基因，随后用BamH1酶切PCR产物。将反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，然后使用剃刀切下正确大小的DNA片段。接着使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。随后，在37摄氏度条件下，用1微升BamH1酶切1微克MTS-pEGFP-N1和MTS-pERFP-N1质粒2小时。然后加入1 µL小牛肠碱性磷酸酶，在37°C下孵育30分钟。将消化产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并按照前述方法纯化DNA后，使用文本方案中列出的试剂设置连接反应。随后将反应体系在4°C下孵育过夜。将10微升连接混合物转化至大肠杆菌DH5-α感受态细胞中，并在含有10毫克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上于37摄氏度过夜培养细菌。第二天，使用无菌移液器吸头从平板上挑取一个菌落，并将吸头插入含有 5 毫升 LB 卡那霉素的离心管中。将培养物过夜培养，次日早晨按照说明书操作，使用质粒小提试剂盒提取质粒。转染指数生长期的 MCF-10A 细胞时，使用 Cdk1 或 cyclinB-1 质粒，按 1:2 的比例在 100 µL 无血清和抗生素的培养基中制备质粒转染试剂。转染细胞后，在 37 °C 下孵育 48 小时。根据正文方案对线粒体进行染色和观察。进行细胞分选时，将2 × 10⁵个细胞接种于6孔板中，使用DNA与转染试剂按1:2比例在2.5 mL无血清和抗生素培养基中制备的混合物进行两次转染。转染后在培养箱中孵育48小时，根据文本方案，利用流式细胞术对稳定表达GFP标记的Cdk-1和RFP标记的cyclinB1蛋白的活细胞进行分选。为通过EdU标记的流式细胞术检测细胞周期长度，将分选后的细胞以每孔2.5 × 10⁵个细胞的密度接种至6孔板中。过夜孵育后，向培养基中加入EdU，终浓度为25 µM，再孵育1小时。随后每隔2小时，用500 µL含1% BSA的PBS洗涤一个细胞孔，并将细胞收集至1.5 mL离心管中。将细胞在350 g离心5分钟。然后弃去上清液。加入100 µL固定液重悬沉淀。充分混匀，室温孵育15分钟。接着，用1毫升含1% BSA的PBS洗涤细胞三次。然后，用0.5毫升70%乙醇在4°C条件下固定细胞过夜。在对转染了GFP和RFP标记蛋白的细胞进行EdU标记时，淬灭GFP和RFP的荧光信号至关重要。为实现这一目的，我们增加一步使用70%乙醇进行过夜固定的步骤。次日，按照文本方案洗涤并通透细胞后，向每根试管中加入0.5毫升反应混合液，并充分混匀。避光孵育并再次洗涤后，使用含1% BSA的PBS缓冲液配制的50微克/毫升碘化丙啶（propidium iodide，PI）对DNA进行染色。通过流式细胞术分析EdU阳性细胞群体。展示经DNA含量和EdU染色的EdU标记细胞的散点图。使用 APC 通道检测 Alexa 647 EdU，配备 670 30 带通滤光片，所有入射光中波长小于 685 纳米的光通过该滤光片；使用藻红蛋白通道检测 PI，前方配备 581 15 带通滤光片，所有入射光中波长小于 600 纳米的光通过该滤光片。采用标准的设门策略进行数据采集，首先以 FSC 面积对 SSC 面积作图分析细胞形态，随后以 PI 对 Alexa 647 EdU 作图分析细胞染色情况。依次记录所有管的数据，每份样本采集 10,000 个事件。在此图中，线粒体基质蛋白 Hsp60 和膜间隙蛋白 Timm13 被用作亚线粒体定位标志物。与 Hsp60 相似，而与 Timm13 不同，cyclinB1 和 Cdk1 能抵抗胰蛋白酶消化，表明它们定位于线粒体基质。如图所示，通过分离的线粒体组分的 Western 印迹分析，利用带有 MTS 和 GFP 标签的 cyclinB1 和 Cdk-1 构建体，实现了 cyclinB1 和/或 Cdk-1 在线粒体中的过表达。通过EdU脉冲追踪实验发现，在表达野生型线粒体cyclinB1-Cdk1的细胞中，标记的S期细胞在4小时内即迅速通过G2/M期并进入G1期；相比之下，转染空载体对照或突变型cyclinB1-Cdk1的细胞则需6小时，表明增强线粒体定位的cyclinB1-Cdk1可加速细胞周期进程。在完成该实验流程后，还可进一步采用其他方法检测线粒体ATP生成、耗氧量、膜电位及活性氧水平，以探讨细胞周期激酶Cdk1的线粒体定位如何影响线粒体呼吸功能与能量输出等科学问题。观看本视频后，您应能充分理解如何研究一种细胞核激酶的线粒体定位及其在线粒体内的特异性功能。

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科研

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Biology

生物学

实验方法来研究线粒体定位和核细胞周期激酶CDK1功能

基于FRET的报告分子正越来越多地用于监测活细胞中激酶和磷酸酶的活性。本文介绍了一种利用基于FRET的报告分子评估细胞周期依赖性靶蛋白磷酸化变化的方法。...

通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

从中期到后期的转变是通过后期促进复合物（APC/C）依赖性的泛素化作用以及随之发生的细胞周期蛋白B的降解所触发的。在此，我们建立了一个系统，该系统在脉冲-追踪标记后，可监测整个细胞群体中细胞周期蛋白B的蛋白水解过程，并有助于检测有丝分裂检查点的干扰作用。...

在全细胞群体中于单细胞水平研究细胞周期蛋白B的蛋白水解

要深入理解线粒体功能的调控机制，必须分析线粒体结构与功能之间的关系。本文描述并演示了在活体和固定处理的黑腹果蝇（Drosophila）卵巢中研究线粒体结构与功能的特定方法。...

在 Drosophila 卵巢中研究线粒体结构与功能

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光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

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细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外...

通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

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活细胞成像评估有丝分裂纺锤体扰动后中期持续时间动态变化及细胞命运

面包酵母线粒体基因组编码八种多肽。本实验方案的目标是对所有这些多肽进行标记，随后将它们作为独立的条带进行可视化观察。...

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体基因组表达产物的标记与可视化

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在衰老过程中对C. elegans线粒体形态进行成像与定量分析

本文介绍了利用共聚焦显微镜和ImageJ评估线粒体裂变/融合动态的方法 通过 Dendra2...

肾近端小管细胞中线粒体分裂/融合动态的评估

学习利用线粒体靶向序列标记技术研究核细胞周期激酶CDK1的线粒体定位及其亚定位方法，该方法可揭示线粒体定位对细胞周期调控的功能影响。

研究核细胞周期激酶Cdk1在线粒体定位与功能的实验方法

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