Name: 调优并行分段流动列和启用多重检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习调优并行分段流动色谱柱以实现多重检测的方法。该技术适用于健康、环境科学和法医学等领域，能够快速分析复杂样品并获取化学指纹信息。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由西悉尼大学（UWS）和赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific）资助。其中一位作者（DK）感谢获得澳大利亚研究生奖学金。

注意：本方案包含如何在配备多种检测器的高效液相色谱（HPLC）系统上使用PSF色谱柱进行多重检测的操作说明。编写本方案时假定读者已具备色谱技术及多种HPLC检测方法的基本知识与实践经验。
注意：请在使用所有材料和试剂前查阅其材料安全数据表（MSDS）即， 甲醇的安全数据表（MSDS）。处理溶剂和高效液相色谱（HPLC）流动相时，应遵守所有适当的安全操作规程。确保正确使用HPLC的工程控制装置、分析天平和检测器仪器，并佩戴适当的个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。
1. 高效液相色谱仪的设置
<ol>
	<li>使用超纯水准备高效液相色谱仪（HPLC）仪器（例如，A相使用100%超纯水，B相使用100%甲醇作为流动相，并根据仪器制造商要求对泵进行 purge。若使用质谱检测器（如本实验），需在流动相A和B中均添加0.1%甲酸。</li>
	<li>设置高效液相色谱仪的仪器组件和检测器，如图所示 图2这要求检测器相对于色谱柱的位置应便于安装，以尽量减少检测器与色谱柱之间的死体积。高效液相色谱系统配置的灵活性是可取的。</li>
</ol>
2. 紫外-可见光和质谱检测器的设置
<ol>
	<li>根据目标样品设定紫外-可见光检测器至所需的波长（例如， 280 nm</li>
	<li>将质谱检测器设置为正离子模式，采用全扫描检测法进行总离子流（TIC）分析。同时相应调整以下质谱参数：汽化器温度 500 °C，毛细管温度 350 °C，鞘气流速 60 单位，辅助气体流速 40，吹扫气体流速 5 单位，喷雾电压 3.5 kV。这些参数可根据所分析样品的具体用户需求在后续进行调整。</li>
</ol>
3. 2,2-二苯基-1-苦肼基自由基（DPPH•）试剂的制备及DPPH•体系检测器的设置
<ol>
	<li>称取25 mg DPPH•，置于容量瓶中，加入250 ml甲醇溶解。</li>
	<li>向DPPH•试剂中加入250 µl甲酸。用铝箔包裹容量瓶，避免光照。</li>
	<li>将含有DPPH•试剂的容量瓶超声处理10分钟。</li>
	<li>按照制造商要求，用配制好的DPPH•试剂冲洗DPPH•泵。</li>
	<li>根据图2组装DPPH•系统，将泵管连接至T型接头的入口。</li>
	<li>将一根100 µl反应圈连接至T型接头的出口，并将反应圈的另一端连接至检测器。</li>
	<li>将反应圈置于柱温箱中，并将柱温箱温度设定为60 °C。</li>
	<li>将DPPH•紫外-可见检测器设置为520 nm。</li>
</ol>
4. PSF 柱的设置
<ol>
	<li>将PSF色谱柱的入口连接至高效液相色谱仪。</li>
	<li>使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路，将中心端口连接至质谱检测器。</li>
	<li>使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路，将一个外周端口连接至紫外-可见光检测器。</li>
	<li>使用一段长度为15 cm、内径为0.13 mm的管路，将另一个外周端口连接至DPPH•检测系统的T型接头。</li>
	<li>使用色谱柱堵头封闭未使用的外周端口。</li>
	<li>将高效液相色谱泵的流速调节至1 ml min-1，流动相为100% B相——100%甲醇（含0.1%甲酸）。</li>
	<li>使用100%甲醇流动相对色谱柱进行20分钟的平衡，适用于内径4.6 mm、长度250 mm的色谱柱。若使用其他尺寸的色谱柱，平衡时间应根据其尺寸相应调整。</li>
</ol>
5. 多重检测中PSF柱的调节
<ol>
	<li>使用分析天平称量至少两个空的收集容器的质量（一个用于连接紫外-可见光检测器的出口，另一个用于DPPH• 检测器）。</li>
	<li>将来自紫外-可见光检测器和DPPH• 检测器出口的流动相分别收集到两个预先称重的收集容器中（5.1）。记录收集时间。每个容器中至少收集500 mg溶剂。</li>
	<li>称量收集容器，确定流动相的质量。已知甲醇的密度为0.791 g ml-1，计算从每个出口收集的流动相体积。</li>
	<li>通过差值法，即泵设定的总流速减去通过DPPH• 检测器和紫外-可见光检测器流路的流速，计算流向质谱检测器的流速。将各路流速表示为总流速的百分比。 
	注意：理想情况下，各路流速占比应为：质谱检测器占总流速的18%，紫外-可见光检测器占22%，DPPH•检测器占60%。</li>
	<li>如果不符合上述比例，可通过调节紫外-可见光检测器的背压来调整各路流速比例。例如，若流向紫外-可见光检测器的流速过高，可在其出口处增加一段15 cm长、内径为0.13 mm的管路以降低该支路的比例。然后重复步骤5.1至5.5。</li>
</ol>
6. 最终设置条件
<ol>
	<li>将DPPH•试剂泵的流速设置为与连接至DPPH•检测器的出口端口流出的流速相同。 
	注意：现已准备好用于分析的与紫外-可见光谱（UV-Vis）、DPPH•和质谱（MS）联用的PSF色谱柱。</li>
</ol>

<ol><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations%3A+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology%3A+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.%2C+A%22%5BJournal%5D)">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography%3A+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%2C+A%22%5BJournal%5D)">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li>
<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns%3A+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+%27virtual%27+narrow+bore+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.%2C+A%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li>
<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection%3A+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究采用带有平行分段流（PSF）色谱柱的多通道检测高效液相色谱法（HPLC），对咖啡进行表征与分析。利用PSF色谱柱进行多通道HPLC分析，可在显著减少样品数据复杂性的同时，在远短于传统多检测方法所需的时间内，获得更丰富的分子特异性信息，从而实现关键化学成分的表征与鉴定。PSF色谱柱不仅为多通道检测提供了平台，还可无需额外死体积和管路，直接组合使用破坏性和非破坏性检测器。本研究将DPPH•、紫外-可见光谱（UV-Vis）和质谱（总离子流图，TIC）三种检测方法进行多通道联用，用于意式浓缩咖啡的分析。
采用4通道PSF色谱柱，结合三种不同的检测器，对咖啡样品进行多重分析。PSF色谱柱出口的中心端口连接至质谱（MS）检测器，三个外周端口中的两个分别连接至DPPH•检测系统或紫外-可见（UV-Vis）检测器。第三个可用的外周端口未被使用，因此用色谱柱堵头封闭；但该端口也可用于样品收集或其他检测器。该多重检测系统的调谐过程针对各检测器分别进行，其中分段流动的测量在UV-Vis和DPPH•检测系统之后进行。由于质谱为破坏性检...

主动流技术色谱柱
活性流技术（AFT）色谱柱最近被开发出来，旨在克服由于流动不均一性引起的分离效率低下问题1-6，并实现多重检测。本文具体阐述了具有多重检测功能的平行分段流（PSF）色谱柱的操作过程。PSF色谱柱的关键功能优势包括：（1）将色谱柱床径向中心区域的流动与外围或壁面区域的流动隔离开来；（2）减少检测源需要处理的流动相体积；（3）可对检测源进行多重化，以扩展样品信息，而无需在每次检测过程中引入检测延迟，也无需后续对柱后流路进行分流7,8。PSF色谱柱设计中实现多重检测优势的关键结构是其新颖的出口接头和烧结组件。图1展示了AFT色谱柱与传统色谱柱的实物照片。需要明确的是，通过平行分段流色谱柱实现的分流过程不同于柱后流路分流。在柱后流路分流中，整个样品带从前沿到尾部末端被均等地取样（即沿轴向），因此每条流路在效率和灵敏度方面均相同，其灵敏度的大小按分流数量等比例降低。然而，在PSF中，分流过程是径向取样，而非轴向取样。因此，中心端口采集的是峰顶——即色谱峰中浓度最高的区域。由于未受到扩散拖尾区域的稀释，此处的灵敏度最高。从外围端口流出的样品在效率上不如中心区域高，但由于是径向取样而非轴向取样，所得峰宽比沿轴向分割峰的取样方式（即柱后分流）更窄。因此，使用浓度型检测器时，灵敏度不会降低。
在PSF色谱柱中，出口接头包含多个出口端口，该端头接头内部装有一个环形烧结片。该环形烧结片的内侧部分通过径向中心出口端口引导流动相流出色谱柱，而出口烧结片的外侧径向部分则通过周边或柱壁区域的出口流路端口引导流动相流出。出口烧结片的内侧与外侧部分由一个不透流体的屏障隔开，以防止这两个流路区域之间的交叉流动2。由于这种设计，通过柱床的中心径向流路与柱内壁区域的流路实现了分离。通过压力调控，可将近似任意比例的流量分配至这两个区域，从而优化色谱柱技术的各项功能特性，例如分离效率或检测灵敏度。本质上，该设计在较大规格的色谱柱内部有效形成了一个具有更小内径的“虚拟”色谱柱，因此该色谱柱可作为真正的无壁柱运行，克服了柱床非均一性及壁效应问题9,10。
PSF色谱柱的主要优势在于提高柱效、减少检测源的溶剂处理量，并实现多重检测。然而，另一个附加优势是，由于任何色谱峰的拖尾和前延区域均被从整体洗脱曲线中去除，因此在洗脱或检测时，溶质的浓度高于在传统色谱柱上相同进样量和浓度负载下所观察到的浓度，具体提升程度取决于所采用的分流比。因此，在PSF色谱柱上进行分离时，通常可观察到信号强度的增强2。事实上，如果调节分流比，使25%的流动相从四个出口端口中的每一个流出，则使用紫外（UV）检测所观察到的信号强度实际上与在传统色谱柱上分析全部（100%）流动相时所呈现的信号强度几乎完全相同7。此外，通过精细调节中心流与壁面流区域之间的出口比例，可以优化色谱柱的柱效。AFT色谱柱所观察到的柱效提升无法用单一数值表示，因为这些效率增益是三个因素的函数：（1）流速，（2）分流比，以及（3）溶质保留因子。尽管如此，与传统色谱柱相比，几乎总能观察到效率的提升，有时理论塔板数的增益甚至超过100%1,2。调节分流比的能力使分析人员能够有效定制“虚拟”色谱柱的直径，这在检测过程中是一个重要因素。例如，当从径向中心出口端口流出的流动相占21%时，可从物理内径为4.6 mm的色谱柱建立一个虚拟的2.1 mm内径（i.d.）色谱柱。在此条件下，该虚拟2.1 mm i.d.色谱柱的柱效可能比传统的2.1 mm i.d.色谱柱高出70%以上，具体提升程度取决于流速和溶质保留因子10。
目前用于多重检测的PSF色谱柱设计采用四端口出口接头，但该色谱柱也可装配双端口端接头，不过这会将检测限制为仅能连接两个检测器。然而，这些色谱柱的基本操作原理相同，区别仅在于四端口出口PSF色谱柱可同时连接四个检测器，从而扩展了多重检测的应用范围。除了色谱柱前后的连接管路外，操作PSF色谱柱所需的其他附加条件仅为可连接至外围出口端口的管路，以及一种用于测量流经每根管路的流动相体积的方法，通常为质量测定或体积测定。为了便于调节，所有出口流路管的内径应保持一致。外围出口端口与径向中心出口端口之间的流速比例可通过压力调控进行调整，方法是改变外围出口接头上的管路长度，或改变径向中心出口端口检测器后管路的长度。
使用 PSF 柱进行多重检测
PSF 柱的一个重要优势在于，每个出口端口均可直接连接至检测源，从而实现多重检测。在设计良好的检测系统中，一次采用多重检测的分析即可提供关于样品中各组分性质的大量信息。重要的是，破坏性和非破坏性检测可同时进行，且无检测延迟。这使得能够绝对指认某些组分，例如利用 DPPH• 试剂鉴定抗氧化剂，同时通过紫外（UV）和/或质谱（MS）检测信号观察到相应组分的洗脱行为7,11。因此，可通过四个出口端口将流动相适当分配至各检测器，使四个独立的检测器同时运行。由于通过各端口的流速易于调节，因此可调整到达任一检测器的溶质量，以匹配特定检测源的灵敏度。然而需要注意的是，溶质通过径向中心出口端口时的迁移效率最高。各个外围端口具有相当的分离效率，当每个端口分配 25% 流量时，其效率仅略低于常规色谱柱。因此，定量检测器应设置为分析来自径向中心出口端口的样品。
在建立用于多重检测的PSF柱时，为获得高效且高质量的结果，需考虑多个因素：各端口的管路尺寸、不同类型检测器所用端口的选择以及流速调节。
各端口的管路尺寸
在色谱分析中，柱后管路的长度对分离效率和性能起着至关重要的作用。若从色谱柱出口到检测器之间的管路过长或内径过大，导致死体积过大，将引起柱效、分辨率和灵敏度的下降。因此，在搭建PSF色谱柱系统时，必须选用合适的管路尺寸，以充分发挥其高效分离能力，同时实现多重检测的优势。
端口至检测器
图2 展示了多重检测（紫外-可见光（U-Vis）、质谱仪（MS）和2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH•）检测）的一个示例装置示意图。图中显示，中心端口连接至MS检测器，而DPPH•和UV-Vis检测器则连接至外周端口。由于MS是这三种检测器中灵敏度最高的，因此将其流路连接至中心出口端口。DPPH•检测仅对抗氧化剂的存在具有选择性，且灵敏度最低但对谱带展宽的耐受性最强，因此将其流路连接至一个外周端口。UV-Vis作为次级“通用型”检测器，其流路则连接至第二个外周端口。
流速调节
将适当的管路从一个端口连接至检测器后，可调节每个检测器出口的流出量至所需数值。一种简单测量各检测器流出量的方法是称量在特定时间内从每个端口流出的流动相的重量。由此可确定流出的百分比流量，并通过相应地缩短或延长连接至检测器出口管线的管路，调节流量比例，以满足所选检测器的要求。不同检测器对流量的要求各不相同。例如，荧光检测器（FLD）的流通池不受流速限制，但需注意避免流通池过压。因此，通常通过调节其他检测器上的压降来控制流经FLD的流量，剩余流量则通过FLD。对输送流量敏感的检测器是质谱（MS）。通常，目前高端的质谱仪可轻松处理约1至1.5 ml/min的中等含水流动相。超过此流速可能导致离子源 flooding，使质谱仪无法正常工作。然而，大多数质谱仪的检测灵敏度在较低流速下更佳，因此在涉及质谱检测的应用中，PSF的分流能力极为有用。尽管可使用高柱体积流速，但输送至质谱检测器的体积流量较低。然而，对质谱检测器的流量调节必须在质谱检测器之前（而非之后）通过调节压降来实现。此时，使用窄内径管路（0.1 mm内径）非常有效，因为可在不引入不必要死体积的情况下轻松调节压力。
根据检测器类型的不同，分割比的调整可以在检测器之前或之后进行。如果使用紫外-可见光（UV-Vis）等非破坏性检测器，则在检测器之后测量并调节流速百分比。如果在多通道系统中使用单一破坏性检测器，则需根据其他端口的流速百分比反向计算得出该检测器的流速百分比。如果使用基于试剂的检测器（例如DPPH•），则在不添加试剂的情况下于检测器后测量流速百分比；而当使用两个或更多破坏性检测器时，流速比应在检测器前进行测量。某些可能需要附加仪器的检测系统（如DPPH•）会引入额外的系统压力，一旦连接到检测系统，可能会改变流速百分比。因此，在检测器前调节流速百分比时，应特别注意破坏性检测器所带来的系统压力变化。无论通过任何端口设定的流速比如何，定量信息都应通过适当的标准化方法获得。然而，一旦流速比设定完成，其值即具有良好的稳定性，即使在梯度洗脱条件下也不会发生变化7。
本论文附带的详细视频方案旨在展示如何使用和调节以多重检测模式运行的PSF柱。

<table><tbody><tr><td>高效液相色谱仪</td><td></td><td></td><td>可选择多种检测器以实现多重检测。所选检测器可能需要额外的仪器设备，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;泵。</td></tr><tr><td>并行分段流高效液相色谱柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>未定义</td><td>即将商业化</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>任意品牌</td><td></td><td>色谱纯</td></tr><tr><td>PEEK 管路</td><td>任意品牌</td><td></td><td>多种长度和内径</td></tr><tr><td>色谱柱堵头</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于封闭未使用的侧端口</td></tr><tr><td>PEEK 管切割器</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>秒表</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗脱液收集容器</td><td>任意品牌</td><td></td><td>可使用 1–2 ml 样品瓶作为洗脱液收集容器</td></tr></tbody></table>

优化平行分段流动柱并实现多重检测

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

主动流技术（AFT）是一种新型的色谱柱技术，旨在克服流动不均一性，从而在分离效率和灵敏度方面提升分离性能，并实现多重检测。这种形式的 AFT 采用平行分段流（PSF）色谱柱。PSF 色谱柱出口端接头包含 2 个或 4 个端口，可通过多路复用连接至最多 4 个检测器。PSF 色谱柱不仅为多重检测提供了平台，还可同时组合使用破坏性和非破坏性检测器，且无需额外的死体积管路。通过压力管理，还可调节每个端口的流速，以满足特定检测器的需求。为了利用 PSF 色谱柱实现多重检测，可通过控制多个参数来确保最佳的分离性能和结果质量，这些参数包括各端口的管路尺寸、不同类型检测器所用端口的选择以及流速调节。本实验方案旨在展示如何使用并优化处于多重检测模式下的 PSF 色谱柱。

采用AFT色谱柱在PSF模式下进行多通道HPLC分析（图1），装置设置如图2所示。该配置可同时利用紫外-可见光谱（UV-Vis）、DPPH•和质谱总离子流（MS-TIC）模式对咖啡样品进行分析。由于色谱图是同步记录的，因此可通过保留时间的对齐，将咖啡样品中对DPPH•有响应的化合物与UV-Vis及MS-TIC的响应信号轻松匹配，如图3所示。当MS-TIC检测器出现正响应时，记录相应峰的分子质量。表1列出了DPPH•峰的保留时间及其在UV-Vis和/或MS检测器中的响应情况，从而提供相应的分子质量。不同检测方法之间峰的匹配简便，使得对咖啡等复杂样品的筛选与表征更加迅速且高效。
<img alt="用于蛋白质纯化系统的高效液相色谱（HPLC）柱示意图。" src="/files/ftp_upload/53448/...

本文介绍了一种用于操作和优化并行分段流动色谱柱以实现多重检测的实验方案。

主动流技术（AFT）是一种新型色谱柱技术，旨在克服流动不均一性，以提高分离性能，适用于……

本高效液相色谱（HPLC）方法的总体目标是优化并行分段流动色谱柱，以实现多重检测。该方法可解答健康与福祉、环境科学、法医学以及需要对复杂样品（如生物发现）进行分析的其他领域中的关键问题。该技术能够在对样品进行全面分析的同时，提供有关复杂混合物中物质化学性质和生物活性的信息。多种检测方案还能够实现快速分析。该方法有助于制定策略，以确定复杂混合物（如咖啡和葡萄酒）的化学指纹，使制造商能够区分其产品与廉价的假冒品种。最初，人们可能会觉得不将整个样品送入单一检测器进行准确分析的做法有违常规。然而，每个流路中的分析物浓度高于常规色谱柱的总流路。首先，使用100%超纯水和纯甲醇分别作为流动相A和B，设置HPLC仪器。如果使用质谱检测器，则在两种流动相中各加入0.1%的甲酸，然后根据制造商的说明对HPLC泵进行 purge 操作。按照制造商的说明，组装质谱紫外可见光及DPPH检测器。确保各组件排列合理，使检测器管路中的死体积最小化。然后将紫外VISTA检测器的波长设置为针对此处样品的特定波长，质谱检测器使用280纳米。采用正离子模式，结合全扫描检测方法进行总离子流或TIC分析。将质谱检测器的温度和气体流速平衡至以下数值：汽化器温度为500摄氏度，毛细管温度为350摄氏度，辅助气体流速为40单位，清扫气体流速为5单位，鞘气流速为60单位，喷雾电压为3.5千伏。配制DPPH自由基试剂时，首先在容量瓶中将25毫克DPPH自由基溶解于250毫升甲醇中。向溶液中加入 250 微升甲酸，并将溶液超声处理 10 分钟。然后用锡箔覆盖烧瓶以避免光照。接下来，按照制造商的建议用 DPPH 自由基溶液冲洗泵，以建立 DPPH 自由基检测系统。确保泵管连接至一个T型接头的入口，然后将100微升反应圈连接至T型接头的出口。将检测器连接至反应圈ENC外壳的另一端、反应圈以及柱温箱。最后将DPPH自由基紫外检测器设置为520纳米。构建平行分段流（PSF）色谱柱时，首先将色谱柱入口连接至高效液相色谱（HPLC）仪器。接着，使用一段管路将中心端口连接至质谱（MS）检测器。再使用相同规格的管路将一个外周色谱柱端口连接至紫外-可见光（UV VS）检测器，另一个外周端口连接至DPPH自由基检测系统的T型接头。使用柱堵头封闭所有未使用的外周端口。将高效液相色谱的流速调节至每分钟1毫升，流动相B为100%，适用于内径4.6毫米、长度250毫米的色谱柱。平衡20分钟。开始调节PSF系统时，首先将收集容器清空。使用这些小瓶分别收集来自紫外VS和DPPH自由基端口的流动相。记录收集的时间段，并确保每个容器中至少收集500毫克溶剂。接下来，称量收集容器以确定流动相的质量，并将质量除以甲醇的密度，从而计算从每个出口收集到的流动相体积。最后，确定进入质谱检测器的流速，并根据文本方案中所述，计算所有检测器流速占总流速的百分比。如果流速比例与理想值存在显著偏差，可在必要位置增加额外的管路以调节背压，并重复收集和计算过程。最后，调节DPPH自由基试剂泵的流速，使其与连接至检测器的出口端口的流速相匹配。对一份咖啡样品进行了多通道HPLC分析。能够同时记录DPPH自由基的紫外光谱和质谱色谱图，从而可将样品中对DPPH自由基呈阳性响应的化合物轻松对应至紫外色谱图。根据保留时间对齐的质谱响应，当MSS总离子流（TIC）检测器出现阳性响应时，记录该峰的分子质量。不同检测方法之间峰的匹配简便，使得对于咖啡等复杂样品的筛选和表征更加迅速和高效。一旦掌握，该技术可在约一小时内完成建立并准备进行样品分析。按照此方案，还可使用其他检测器，如折光指数检测器、荧光检测器，以及基于化学反应的检测方法（如化学发光），以获取更多的样品信息。观看本视频后，您应能认识到多重检测技术在深入理解复杂样本方面的重要性。此外，利用平行分段流通道进行多重检测是开展生物探索的一种极为高效的方法。

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

调优并行分段流动列和启用多重检测

本文介绍了一种用于自动筛选适用于蛋白质纯化过程中疏水相互作用色谱（HIC）介质的自动化方法。该方法采用中压液相色谱系统，包含自动缓冲液配制、动态样品环进样、顺序柱切换、多波长分析以及分流收集洗脱组分等功能。...

自动疏水相互作用色谱柱筛选在蛋白质纯化中的应用

本文介绍了一种使用反应流高效液相色谱柱进行柱后衍生化（PCD）方法的实验方案。...

使用反应流高效液相色谱柱进行柱后衍生化

本文介绍了一种在帘流（CF）模式下操作和优化活性流技术（AFT）色谱柱以提高分离性能的实验方案。...

帘流柱：效率与灵敏度的优化

本文介绍了一种快速的蛋白质酶解消化方案，该方案采用自制的流通式胰蛋白酶微反应器，并与电喷雾电离（ESI）质谱仪联用。文中详细描述了微反应器的制备、实验装置的搭建以及数据采集过程。...

使用流通式微反应器快速酶解蛋白质以进行质谱检测

在液滴微流控中，多色荧光检测通常需要使用体积庞大且结构复杂的基于倒置荧光显微镜的检测系统。本文介绍一种紧凑且模块化的多色检测方案，该方案利用光纤阵列通过单个光电探测器对采集的多色数据进行时间编码。...

使用光纤实现液滴微流控的多色荧光检测

我们展示了一种集成表面电极网络的微流控平台，该平台结合了电阻脉冲传感（RPS）与码分多址（CDMA）技术，可实现多个微流控通道中颗粒的多重检测与尺寸测量。...

用于颗粒空间追踪的多路复用电子检测微流控平台

本方案展示了一种简单、可靠且高通量的单分子流动拉伸实验方法，用于研究分子沿DNA的一维（1D）扩散。...

一种简单、稳健且高通量的单分子流动拉伸检测方法，用于研究分子沿DNA的运输

本文详细介绍了用于系统表征胶体半导体纳米晶体合成的模块化微流控筛选平台的操作与组装方案。通过完全可调的系统配置，可在传质控制的取样空间内，跨越四个数量级的反应时间尺度，高效地完成光谱数据采集。...

一种用于胶体半导体纳米晶体系统性研究的模块化微流控技术

本文介绍了一种优化的FlashPack毛细管色谱柱填装方案。将该优化方案应用于常见的100-bar压力罐装置，可使长效超高效毛细管色谱柱的填装和制备速度提高10倍。...

采用FlashPack方法简易自制超高效毛细管色谱柱

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

本研究通过优化激励波形、采用多级滤波以及基于复杂可编程逻辑器件（CPLD）的整流方法，提高了电磁流量计的测量精度。提出了一种基于波形的新型空管检测方法，增强了系统可靠性。实验结果表明，在0.1–15...

基于复杂可编程逻辑器件波形识别的带空管检测高精度电磁流量计

学习调优并行分段流动色谱柱以实现多重检测的方法。该技术适用于健康、环境科学和法医学等领域，能够快速分析复杂样品并获取化学指纹信息。

优化平行分段流动柱并实现多重检测

探索更多视频