Name: 蛋白质的MS检测快速酶法处理与流通型微反应器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习利用流通型胰蛋白酶微反应器进行蛋白质快速酶法消化，结合电喷雾质谱实现高效蛋白质鉴定。该方法快速、经济，适用于高通量蛋白质组学研究。

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本工作获得了美国国家科学基金会（NSF）DBI-1255991 赠款对 IML 的支持。

1. 毛细管微反应器的制备
<ol>
	<li>使用玻璃毛细管切割器将内径（ID）100 µm、外径（OD）360 µm的毛细管切成7–8 cm长，将内径20 µm、外径90 µm的毛细管切成3–5 cm长；在显微镜下检查，确保两根毛细管的端面切割平整、笔直，无任何突出的毛刺。</li>
	<li>将内径20 µm、外径90 µm的毛细管插入内径100 µm、外径360 µm毛细管的一端，插入深度约为6 mm；必要时可在显微镜下观察操作过程。</li>
	<li>用棉签末端在90 µm外径/100 µm内径毛细管连接处周围涂上少量E6000胶水，并在室温下静置过夜使其固化。</li>
	<li>将已插入的内径20 µm、外径90 µm毛细管进一步切割至约10–15 mm长度；此部分将作为电喷雾电离发射器。</li>
	<li>预先将外径1/32&#34;的PEEK管、外径1/16&#34;的PEEK管以及外径1/16&#34;的PTFE管分别切成4–5 cm长的小段；这些管段将用作毛细管连接件中的套管，以实现无泄漏连接。</li>
	<li>将内径100 µm、外径360 µm毛细管的另一端连接至一个PEEK连接头；使用一段外径1/32&#34;的PEEK套管以确保连接处无泄漏。</li>
	<li>将一段长约5 cm的外径1/16&#34; PTFE管插入连接头的另一端并拧紧。</li>
	<li>在预先清洗并干燥的2 ml玻璃小瓶中称取约4 mg C18（5 µm）填料颗粒，加入0.5 ml异丙醇，盖紧瓶盖，并在超声水浴中分散悬浮液。</li>
	<li>用250 µl注射器吸取约200 µl悬浮液，将针头插入PEEK连接头的外径1/16&#34; PTFE管中，缓慢将悬浮液注入内径100 µm、外径360 µm的毛细管中；在显微镜下观察颗粒填充过程，直至形成2–3 mm长的固定相填充段；此部分即为微反应器（图1）。内径20 µm的毛细管通过楔紧效应（Keystone effect）将颗粒保留在微反应器中。15</li>
	<li>用约50 µl体积比为50:50的H2O/CH3CN溶液冲洗微反应器，随后再用约50 µl体积比为98:2的H2O/CH3CN溶液冲洗。</li>
</ol>
2. 样品溶液的制备
注意：涉及有机溶剂、酸类操作及溶液配制的步骤均应在通风橱中进行。请佩戴护目镜、手套和防护服。
<ol>
	<li>用 CH3OH 冲洗数个玻璃小瓶（4 ml）和聚丙烯管（15 ml），并干燥。</li>
	<li>在 15 ml 聚丙烯管中，通过将 9.8 ml H2O 与 200 µl CH3CN 混合，配制 10 ml H2O/CH3CN（98:2 v/v）溶液；通过超声处理混合。</li>
	<li>在 15 ml 聚丙烯管中，通过将 5 ml H2O 与 5 ml CH3CN 混合，配制 10 ml H2O/CH3CN（50:50 v/v）溶液；通过超声处理混合。</li>
	<li>在 4 ml 玻璃小瓶中，向 4 ml H2O/CH3CN（98:2 v/v）溶液中加入 4 µl TFA(10%)，配制 4 ml 酸化水溶液（TFA 0.01% v/v）；通过超声处理混合。</li>
	<li>在 4 ml 玻璃小瓶中，向 4 ml H2O/CH3CN（50:50 v/v）溶液中加入 4 µl TFA(10%)，配制 4 ml 酸化有机溶液（TFA 0.01% v/v）；通过超声处理混合。</li>
	<li>用分析型微量天平在 4 ml 玻璃小瓶中称取 16 mg NH4HCO3 ；加入 4 ml H2O/CH3CN（98:2 v/v）溶液，通过超声处理分散；得到 50 mM NH4HCO3 水缓冲液溶液（pH~7.8）。</li>
	<li>用分析型微量天平在 4 ml 玻璃小瓶中称取 5 mg 标准蛋白（例如，牛血清白蛋白、血红蛋白 α/β、细胞色素 C、碳酸酐酶、α-2-HS-糖蛋白，等）；加入 4 ml 去离子水，通过超声处理分散；通常得到高 µM 浓度的溶液。</li>
	<li>用适量 NH4HCO3（50 mM）水缓冲液稀释高 µM 浓度溶液，配制 1 ml 蛋白溶液（1–2 µM）；通过超声处理混合。</li>
	<li>将 20 µg 测序级胰蛋白酶溶解于 170 µl NH4HCO3（50 mM）水缓冲液中，配制胰蛋白酶溶液（5 µM）；通过超声处理分散。</li>
</ol>
3. 实验设置&#160;
注意：LTQ-MS 系统配备了一个经过改装的电喷雾离子源（ESI），其中包含一个自制的 XYZ 位移台，可实现质谱仪与多种样品输入方式的联用。
<ol>
	<li>将毛细管微反应器从PEEK接头断开，并连接至PEEK三通。</li>
	<li>将一段长约2 cm的铂丝插入PEEK三通的侧臂；使用1/32&#34; PEEK套管以确保连接处无泄漏并绝缘铂丝。</li>
	<li>将一根内径50 µm、外径360 µm、长约0.5 m的样品转移毛细管连接至PEEK三通的另一端；使用1/32&#34; PEEK套管以确保连接处无泄漏。</li>
	<li>将PEEK三通固定在XYZ位移平台上，并将电喷雾电离（ESI）发射器置于距质谱仪进样毛细管约2 mm的位置。</li>
	<li>将铂丝连接至质谱仪的ESI电源。</li>
	<li>将样品转移毛细管的另一端连接至不锈钢接头；使用1/16&#34; PEEK套管以确保连接处无泄漏。</li>
	<li>将一段长4–5 cm、规格为1/16&#34;的PTFE管连接至不锈钢接头的另一端，并将250 µl注射器针头插入PTFE管中；启动泵并调节流速至所需值（例如，2 µl/min）。</li>
	<li>在控制质谱仪的软件中输入串联质谱数据采集参数，并保存为方法文件以准备进行分析；对于LTQ-MS系统，使用以下依赖数据采集的参数：动态排除时间为180秒，排除质量窗口为±1.5 m/z；一次MS扫描后，对强度最高的5个峰依次进行一次Zoom扫描和MS2扫描，Zoom扫描窗口为±5 m/z；碰撞诱导解离（CID）参数设置为：隔离宽度3 m/z，归一化碰撞能量35%，激活Q值0.25，激活时间30毫秒。</li>
</ol>
4. 微流控装置&#160;
<ol>
	<li>使用玻璃或聚合物基底制备微流控装置；16-18 装置布局见图2A，包含一个微反应器（1）（0.13 mm 宽 × 2 mm 长 × 50 µm 深），连接一个进样口（2）、出样口（3）和一个侧向端口（4）；用于流体操控的连接通道宽度约为110 µm，深度约为50 µm；一个多通道结构（5），由间距25 µm、约1.5–2 µm 深 × 10 μm 宽 × 100 μm 长的微通道组成，将作为过滤器用于在微反应器中截留颗粒。</li>
	<li>通过将专用连接器粘接到进样口，或设计一个可容纳流体输送接头的聚合物支架，实现芯片的流体输送连接（图2B）。16</li>
	<li>按步骤1.8所述方法制备C18颗粒（5 µm）悬浮液；使用连接至芯片侧向端口（4）的1/16&#34; PTFE管，通过注射器将悬浮液输送至微反应器；颗粒装载完成后，用环氧树脂胶密封端口，并在90 ºC烘箱中固化1小时。16</li>
	<li>将一根毛细管（内径20 µm × 外径90 µm × 长度10 mm）插入出样口，用E6000胶密封，并过夜固化；该毛细管将作为电喷雾电离（ESI）发射器（6）。</li>
	<li>将一根内径50 µm × 外径360 µm（长约0.5 m）的样品转移毛细管连接至芯片进样口（2）；将毛细管另一端连接至250 µl注射器及注射泵，具体操作如3.6–3.7所述。</li>
	<li>在进样口（2）前的样品转移管路上安装一个轻质PEEK三通接头，并按3.2所述方法将一根铂丝插入三通的侧臂；该铂丝将作为电喷雾电离（ESI）电极。</li>
	<li>将微流控装置固定在XYZ位移台上，使电喷雾电离（ESI）发射器位于质谱仪进样毛细管约2 mm处；按3.8所述方法准备质谱仪进行分析。</li>
</ol>
5. 样品上样、蛋白酶解消化及质谱分析的洗脱
注意：所有溶液/样品转移步骤均需借助注射泵完成，且应额外预留数分钟时间以补偿与微型反应器相连的转移管路所带来的死体积；所需时间将取决于所涉及的流速。
<ol>
	<li>使用250 µl注射器，以2 µl/min的流速注入H2O/CH3CN（98:2 v/v）中含50 mM NH4HCO3 的水溶液5分钟，冲洗微反应器并为其分析做准备。</li>
	<li>使用250 µl注射器，以2 µl/min的流速注入1 µM蛋白质样品溶液5分钟，将蛋白质样品加载至微反应器上。</li>
	<li>以2 µl/min的流速将5 µM胰蛋白酶溶液流经微反应器上吸附的蛋白质，持续1–3分钟。</li>
	<li>使用250 µl注射器，以2 µl/min的流速用含0.01%（v/v）三氟乙酸（TFA）的H2O/CH3CN（98:2 v/v）酸化水溶液冲洗微反应器5分钟，以终止蛋白酶解消化过程。</li>
	<li>以300 nl/min的流速注入含0.01%（v/v）TFA的H2O/CH3CN（50:50 v/v）酸化有机溶液，开始从微反应器中洗脱蛋白质酶解产物。</li>
	<li>启动质谱数据采集过程及电喷雾电离电压（约2,000 V）；采用步骤3.8中提供的数据采集参数采集质谱数据；观察胰蛋白酶肽段的洗脱情况。</li>
</ol>
6. 数据处理
<ol>
	<li>使用与原始质谱数据格式兼容的搜索引擎处理串联质谱数据。
	<ol>
		<li>使用特定物种的最小冗余蛋白质数据库处理LTQ-MS原始文件；将原始数据上传至搜索引擎，设定母离子和碎片离子质量容差分别为2和1 Da，搜索时仅使用完全胰蛋白酶切的肽段，允许最多两个漏切位点；不考虑翻译后修饰；设定高置信度和中等置信度的错误发现率（FDR）分别为1%和3%，且不考虑翻译后修饰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对数据进行筛选，仅保留数据库中蛋白质的高置信度肽段匹配结果；评估蛋白质和肽段水平的分析结果。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本研究中描述的微反应器提供了一种易于实施的实验装置，可用于在30分钟内完成蛋白质的酶解，从而实现质谱分析与鉴定。与传统方法相比，该系统具有操作简便、反应快速、试剂消耗少和成本低等显著优势。特别是，该方法无需使用昂贵的固定化胰蛋白酶微珠或色谱柱。毛细管微反应器的制备过程简单（图1A），仅需数分钟即可利用色谱实验室中常见的标准材料完成。尽管反相C18填料颗粒可通过高有机溶剂（CH3CN或CH3OH）冲洗以彻底去除吸附的蛋白质或肽段，从而实现微反应器的重复使用，但其简便且低成本的制备工艺更适用于生产一次性使用的 disposable 单元。该毛细管微反应器可安装于自制的电喷雾电离（ESI）源中（如图1B所示），也可插入标准商用离子源中使用。用于样品捕获和酶解的填料床长度无需超过约1–2 mm，只需足以捕获足量样品以实现质谱检测的最优灵敏度即可；而毛细管本身的长度则可根据特定离子源的尺寸进行调整。
对于具备微流控器件制备能力的实验室，本文提供了一种可固定于支架上以方便与质谱检测接...

纯化蛋白质的鉴定与表征通常通过质谱（MS）技术实现。蛋白质经酶消化后，其产生的肽段可通过简单的进样实验装置直接进行质谱分析。蛋白酶解消化的目的是产生适合大多数质谱分析仪有效质量范围的小肽片段，并可通过低能量碰撞诱导解离（CID）轻易碎裂，从而获得氨基酸序列信息。对于单一蛋白质或简单的蛋白质混合物，在质谱检测前无需对肽段进行色谱分离。含有25至50个肽段的混合物可通过注射泵将样品直接引入质谱离子源进行分析。
质谱仪能够在短时间内完成分析并确认蛋白质的序列。借助现代数据采集方法，该过程可在数分钟甚至数秒内完成。在整个流程中，限制其在短时间内完成的主要因素是蛋白酶解消化步骤。通常，该步骤在溶液中于37 ºC下进行数小时（或过夜），底物与酶的比例为(50–100):1。为了将酶解时间缩短至数分钟或数秒，已有研究报道采用固定化酶微反应器，其形式包括微流控反应器或市售的 cartridges。1–6 通常，酶通过共价结合、非共价/物理吸附、复合物形成或包埋等方式被固定化3,6，其酶促反应效率的提升得益于较大的表面积与体积比以及酶与底物的高比例。固定化反应器的其他优势还包括减少自溶现象、降低酶对质谱分析的干扰、提高酶的稳定性和可重复使用性。已有多种方法被报道，包括使用玻璃或聚合物微加工装置，将酶通过抗体-抗原相互作用固定于磁性微珠上7,8、包埋于金纳米颗粒网络中9、封装于二氧化钛-氧化铝溶胶-凝胶中10和纳米沸石中11，或通过Ni-NTA或His-Tag复合物形成进行捕获6。此外，也已开发出带有固定化酶的开管毛细管反应器12。另外，通过使用可控微波辐照13，或采用压力辅助或压力循环技术（PCT），已证明可增强蛋白酶解切割效率，将反应时间缩短至30–120分钟14。
尽管固定化酶反应器具有多种优势，但商用柱的成本较高，适用于常规使用的微流控装置可获得性有限，而使用微波或PCT技术则需要额外的仪器设备。本研究的目标是开发一种能够规避上述缺点的方法，并可在每个实验室中轻松实施，使研究人员能够以简单高效的方式在数分钟内完成蛋白质的酶解消化，为质谱分析做好准备。该方法依赖于使用疏水性的C18颗粒，这些颗粒预先装填在毛细管或微流控装置中，目标蛋白质吸附于这些颗粒上，随后在酶溶液流经填充床及被捕获的蛋白质时实现酶解消化。在此方法中，底物通过非共价相互作用被固定，酶则流经固定化的蛋白质。由于颗粒具有较大的表面积，使蛋白质更充分暴露于酶的作用环境，同时缩短了分子到颗粒表面的距离和扩散时间，提高了传质效率，且无需共价连接，避免了可能对酶活性造成的影响；此外，该方法还具备可快速评估不同酶组合、一次性使用以及在微流控格式下实现多重分析等优势。本文以标准蛋白混合物和胰蛋白酶（trypsin）——即电喷雾质谱（ESI-MS）检测前最常用的蛋白酶——为例，验证了该方法的可行性。本研究中用于检测的质谱仪为线性离子阱四极杆（LTQ）仪器。

<table><tbody><tr><td>离子阱电喷雾电离质谱仪（Ion trap ESI-MS）</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>LTQ 质谱仪用于获取串联质谱数据</td></tr><tr><td>XYZ 位移平台</td><td>Newport</td><td>多个部件</td><td>自制的 XYZ 位移平台用于适配商用 LTQ 纳升电喷雾电离源，以接收来自不同样品输送系统的输入</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>显微镜用于观察微反应器的填料过程</td></tr><tr><td>分析天平/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>天平用于称量蛋白质样品</td></tr><tr><td>超声波清洗仪/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>超声浴用于混合/均质样品以及分散 C18 颗粒悬浊液</td></tr><tr><td>微量注射泵 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>微泵用于将样品和酶加载、冲洗并洗脱出填充毛细管微反应器</td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&amp;nbsp;</td><td>MilliQ 水系统用于制备纯化去离子水</td></tr><tr><td>移液器/Eppendorf（1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l）</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>移液器用于量取小体积的样品溶液</td></tr><tr><td>移液器/Eppendorf（100&amp;nbsp;&amp;micro;l）</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>移液器用于量取小体积的样品溶液</td></tr><tr><td>移液器/Eppendorf（10&amp;nbsp;&amp;micro;l）</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>移液器用于量取小体积的样品溶液</td></tr><tr><td>熔融石英毛细管（100 &amp;micro;m 内径 × 360 &amp;micro;m 外径）</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>该毛细管用于微反应器的制备</td></tr><tr><td>熔融石英毛细管（20&amp;nbsp;&amp;micro;m 内径 × 100 &amp;micro;m 外径）</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>该毛细管用于电喷雾电离发射器的制备</td></tr><tr><td>熔融石英毛细管（50&amp;nbsp;&amp;micro;m 内径 × 360 &amp;micro;m 外径）</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>该毛细管用于将样品和洗脱液从注射泵输送至毛细管微反应器</td></tr><tr><td>玻璃毛细管切割器</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>该工具用于将熔融石英毛细管切割至所需长度</td></tr><tr><td>胶水</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>该胶水用于将电喷雾电离发射器固定在毛细管微反应器或微流控芯片中</td></tr><tr><td>环氧胶</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>该胶水用于密封微流控芯片的进样孔，C18 颗粒通过该孔装入</td></tr><tr><td>反相 C18 颗粒（5&amp;nbsp;&amp;micro;m）</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>这些是用于吸附蛋白质的 C18 颗粒；颗粒提取自安捷伦公司 4&amp;nbsp;mm × 20 cm 的 C18 液相色谱柱</td></tr><tr><td>玻璃注射器（250 &amp;micro;l）</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>玻璃注射器用于将 C18 颗粒悬浊液装入毛细管微反应器，并将样品和洗脱液输送至微反应器</td></tr><tr><td>内螺纹还原型 PEEK 接头（1/16&amp;rdquo; 转 1/32&amp;rdquo;）</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>该接头用于将 250 &amp;micro;l 注射器连接至微反应器，以加载 5 &amp;micro;m 颗粒悬浊液</td></tr><tr><td>不锈钢接头（1/16&amp;rdquo;）</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>不锈钢接头用于将玻璃注射器针头连接至输注毛细管</td></tr><tr><td>微型 PEEK 三通连接器（1/32&amp;rdquo;）</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>PEEK 三通用于将样品传输毛细管连接至毛细管微反应器；其侧臂可用于插入铂丝</td></tr><tr><td>三通连接器（轻质）</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>该三通连接器用于通过样品传输管线向微流控芯片施加电喷雾电离电压</td></tr><tr><td>铂丝（0.404 mm）</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>铂丝提供电喷雾电离所需的电连接，并连接至质谱仪的电喷雾电离电源</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）管（1/16&amp;rdquo; 外径）</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>特氟龙管用于实现注射器针头与不锈钢接头之间的气密连接&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK 管（0.015&amp;rdquo; 内径 × 1/16&amp;rdquo; 外径）</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>PEEK 管用作套管，以实现不锈钢接头与 50&amp;nbsp;&amp;micro;m 内径传输毛细管之间的气密连接</td></tr><tr><td>PEEK 管（0.015&amp;rdquo; 内径 × 1/32&amp;rdquo; 外径）</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>PEEK 管用作套管，以实现熔融石英毛细管与 PEEK 三通之间的无泄漏连接</td></tr><tr><td>洁净切割聚合物管切割器</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>该切割器用于预切 1/16&amp;rdquo; 和 1/32&amp;rsquo; 的 PEEK 聚合物管，作为无泄漏连接的套管，长度约为 4–5 cm</td></tr><tr><td>棕色小瓶（2 ml）</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>小瓶用于制备样品溶液和 C18 颗粒悬浊液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>棕色小瓶（4 ml）</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>小瓶用于制备样品溶液</td></tr><tr><td>聚丙烯管（15&amp;nbsp;ml）</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>小瓶用于制备缓冲液</td></tr><tr><td>量筒（100 ml）</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>量筒用于量取溶剂体积</td></tr><tr><td>量筒（10 ml）</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>量筒用于量取溶剂体积</td></tr><tr><td>移液枪吸头（1,000 &amp;micro;l）</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>移液枪吸头用于量取小体积的样品溶液</td></tr><tr><td>移液枪吸头（100 &amp;micro;l）</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>移液枪吸头用于量取小体积的样品溶液</td></tr><tr><td>移液枪吸头（10 &amp;micro;l）</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>移液枪吸头用于量取小体积的样品溶液</td></tr><tr><td>玻璃基底</td><td>Nanofilm</td><td>B270 白冕玻璃，3&amp;rdquo; × 3&amp;rdquo;</td><td>这些是用于微芯片制备的玻璃基底</td></tr><tr><td>公螺母接头（1/16&amp;rdquo;）</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>该接头用于将传输毛细管连接至微流控芯片</td></tr><tr><td>Nanoport 组件</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>该接头用于将传输毛细管连接至微流控芯片</td></tr><tr><td>蛋白质标准品</td><td>Sigma</td><td>多个编号</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，HPLC 级</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，HPLC 级</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇，HPLC 级</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，测序级</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

使用流通式微反应器快速酶解蛋白质以进行质谱检测

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

基于质谱（MS）的蛋白质分析方法绝大多数在检测前需要进行酶解步骤，通常使用胰蛋白酶。该步骤对于生成小分子量肽段（一般分子量小于4,000 Da）至关重要，这些肽段更适合电喷雾电离（ESI）并可在质谱中有效检测。然而，这种方法存在一个关键局限：它破坏了完整蛋白质的信息，使得无法直接获得蛋白质的翻译后修饰、剪切变体或异构体等全局特征。近年来，越来越多的研究关注于完整蛋白质或大分子量蛋白质复合物的分析，即“自上而下”（top-down）质谱策略，以保留这些重要的结构信息。尽管如此，由于完整蛋白质的电离效率较低且谱图复杂，其广泛应用仍面临挑战。因此，开发既能保留完整蛋白质信息又能提高检测灵敏度和分辨率的新方法，已成为蛋白质组学研究的重要方向。 
关键词：质谱，蛋白质分析，酶解，胰蛋白酶，肽段，分子量，电喷雾电离，自上而下质谱，翻译后修饰，蛋白质异构体 &#60; 3,000–4,000 Da，处于质谱仪器有效扫描范围内的肽段。传统方案通常在37 °C下进行过夜酶解。近年来的技术进展已催生出多种新策略，通常采用固定化酶的微反应器或一系列辅助的物理处理方法，可将蛋白酶解所需时间缩短至数分钟例如，微波或高压）。本文描述了一种简单且成本低廉的方法，可在任何实验室中实现蛋白质的快速酶解消化。将蛋白质（或蛋白质混合物）吸附于预装在毛细管柱中的C18键合反相高效液相色谱（HPLC）硅胶颗粒上，随后用含水缓冲液中的胰蛋白酶短时间流经颗粒。为实现在线质谱（MS）检测，直接使用有机溶剂含量递增的洗脱体系将胰蛋白酶肽段从颗粒洗脱至质谱离子源中。该方法无需使用昂贵的固定化酶颗粒，也无需任何辅助手段即可完成整个过程。蛋白质消化和完整的样品分析分别可在约3分钟和约30分钟内完成。

使用上述微反应器（图1或图2）对蛋白质混合物同时进行蛋白酶解消化的代表性结果见于表1。该表列出了可鉴定特定蛋白质的唯一肽段序列、交叉相关评分（Xcorr）（即，表征相应串联质谱图实验值与理论值匹配质量的评分）、漏切位点数、肽段电荷态（z）以及质子化肽段的质量/电荷比（m/z）。在蛋白质水平上，该表提供了UniProt蛋白质ID、蛋白质的描述（名称）、蛋白质评分和蛋白质覆盖度。所有蛋白质在经过90秒的蛋白酶解消化后，均可通过多个肽段被鉴定。
所有肽段洗脱所需的时间取决于传递酸化有机溶液的转移毛细管长度，其流速为300 nl/min，该流速与纳米电喷雾电离（nano-ESI）的最佳工作条件相兼容。水相与酸化有机相在毛细管内混合导致少数肽段较早洗脱，但绝大多数肽段仅在有机相中于数分钟内洗脱。使用毛细管微反应器生成的、显示代表五种蛋白质的多个肽段共洗脱的质谱图见<strong...

本文介绍了一种快速的蛋白质酶解消化方案，该方案采用自制的流通式胰蛋白酶微反应器，并与电喷雾电离（ESI）质谱仪联用。文中详细描述了微反应器的制备、实验装置的搭建以及数据采集过程。

基于质谱（MS）的蛋白质分析方法绝大多数在检测前需进行酶解步骤，通常使用胰蛋白酶。

本方案的总体目标是描述一种用于快速酶解蛋白质的流通式胰蛋白酶微反应器的制备方法，从而实现通过电喷雾电离质谱仪进行蛋白质鉴定。该方法有助于阐明分离纯化后蛋白质的氨基酸序列，以支持其结构与功能的后续表征。本方案的主要优势在于操作快速、成本低廉，并且易于整合到采用微加工平台的工作流程中。首先，使用玻璃毛细管切割器将较粗的玻璃毛细管切割至7到8厘米的长度，将较细的毛细管切割至3到5厘米的长度。使用显微镜检查，确保两根毛细管的端面均整齐、平直，无任何突出的毛刺。将较细的毛细管一端插入较粗毛细管的一端，插入深度约为6毫米。然后，使用棉签将少量胶水涂抹在毛细管连接处周围，并在室温下静置过夜使胶水固化。接着，将插入的毛细管切割至约10至15毫米的长度。此端将作为电喷雾电离发射器。将较大直径毛细管的另一端插入一段预先切好的、长度为四到五厘米的1/32英寸PEEK管中，并将该PEEK管连接至一个PEEK连接头。然后，将一段五厘米长的1/16英寸PTFE管插入连接头的另一端并拧紧。在一支洁净、干燥的2毫升玻璃小瓶中，称取4毫克C18颗粒，随后加入0.5毫升异丙醇。盖上瓶盖。将其放入超声波清洗器中，进行超声处理，使颗粒在溶液中均匀分散。接着，使用250微升注射器吸取200微升C18浆液。将注射器插入1/16英寸的PTFE管中，并缓慢将浆料注入大口径毛细管内。在显微镜下观察毛细管中颗粒的填充过程，直至形成2至3毫米的颗粒柱。较小的毛细管通过楔形效应将这些颗粒保留在微反应器中。最后，用50微升水与乙腈按50:50配制的溶液冲洗微反应器，随后用50微升含有49微升水和1微升乙腈的溶液冲洗。将毛细管微反应器从PEEK接头断开，并连接至PEEK-T接头。然后，插入一根长2厘米的铂丝，铂丝外包裹1/32英寸的PEEK套管以实现绝缘，并确保与PEEK-T接头侧臂之间无泄漏连接。将一根半米长的样品传输毛细管连接到PEEK-T的另一端。使用1/32英寸的PEEK套管以确保连接处无泄漏。将PEEK-T固定在XYZ位移平台上。将电喷雾电离发射器置于距离质谱仪进样毛细管约两毫米处。然后，将铂丝连接至质谱仪的电喷雾电离电源。同时，使用1/16英寸PEEK套管将样品传输毛细管的另一端连接至不锈钢接头，以确保无泄漏连接。接下来，将一段长约4至5厘米、1/16英寸的PTFE管连接到不锈钢接头的另一端。按照随附文本方案中的描述，在控制质谱仪的软件包中输入串联质谱的数据采集参数。将这些参数保存为方法文件，以完成分析前的准备工作。LTQ 质谱系统配备了一个经过改装的电喷雾电离（ESI）源，其中包含一个自制的 XYZ 位移台，可实现质谱仪与多种样品输入方式的联用。用含有2%乙腈的50毫摩尔碳酸氢盐水溶液填充一支250微升的注射器。然后将注射器连接至微反应器，并将其置于注射泵下方。以每分钟2微升的流速冲洗微反应器5分钟，以准备进行分析。然后，将目标蛋白质样品加入250微升注射器中，并以每分钟2微升的流速注入样品溶液，持续5分钟。接着，将装有5微摩尔胰蛋白酶溶液的250微升注射器置于注射泵下，以每分钟2微升的流速在微反应器上吸附的蛋白质上孵育1至3分钟。每次实验前必须新鲜解冻并配制胰蛋白酶溶液，以确保该蛋白水解酶保持其活性以及微反应器的工作 pH 值（约为 8）。另取一支 250 微升注射器，装入由 0.1% 三氟乙酸加入 2% 乙腈水溶液组成的溶液。使用该溶液以每分钟2 µL的速度冲洗微反应器5分钟，以终止蛋白酶消化过程。随后，切换至装有含0.1%三氟乙酸的50%乙腈溶液的注射器，并将电喷雾电离电压调至约2000伏，启动质谱数据采集过程。使用酸化溶液以每分钟300 nL的速度从微反应器中洗脱蛋白质消化产物，持续20至30分钟。使用随附文本方案中提供的数据采集参数获取质谱数据。通过将原始数据上传至搜索引擎，使用最小冗余蛋白质数据库处理LTQ MS原始文件。然后，将母离子和碎片离子的质量容差分别设置为2道尔顿和1道尔顿，并在搜索中仅使用完全由胰蛋白酶切割产生的肽段，允许最多两个漏切位点。此外，将高置信度和中等置信度的错误发现率分别设置为 1% 和 3%，除非特别针对特定修饰进行检测，否则不要允许翻译后修饰的存在。最后，对数据进行过滤，仅选择高置信度的肽段匹配结果。此处显示的是由经过微反应器中蛋白水解处理的蛋白质混合物所产生的胰蛋白酶肽段组成的质谱图。这些标签代表了强度最高的胰蛋白酶肽离子，并提供了其序列及相应的蛋白质标识符。该微反应器提供了一种易于实施的实验装置，可用于进行蛋白质的酶解消化，并可在30分钟内完成质谱分析与鉴定。在进行该操作时，必须注意保持与溶液接触的小瓶和仪器的清洁，这对于避免样品污染至关重要。采用此方法后，可结合其他质谱数据采集方法，以更全面地表征生成的肽段，并进一步探究蛋白质结构相关的问题。该技术的建立为蛋白质组学领域的研究人员提供了基础，使其能够开发出更快速的蛋白质分析方案，并推动新型微降解平台的发展，从而实现对生物样本的高通量分析。该技术的局限性在于仅适用于分析较为简单的蛋白质混合物，此类混合物通常产生 25 至 50 个肽段。这些肽可通过简单的进样实验进行分析，无需在质谱分析前进行液相色谱分离。请注意，使用有机溶剂可能具有极高危险性，在执行本操作时，应始终采取预防措施，例如避免明火。

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