蛋白质的MS检测快速酶法处理与流通型微反应器
2016年4月6日
提出了一种使用与电喷雾电离 （ESI） 质谱仪耦合的内部构建的流通式胰蛋白酶微反应器进行蛋白水解消化的快速方案。描述了微反应器的制造、实验装置和数据采集过程。
该方案的总体目标是描述流通式胰蛋白酶微反应器的制造，该反应器对蛋白质进行快速酶消化，以便使用电喷雾电离质谱仪进行蛋白质鉴定。该方法可以帮助说明分离和纯化蛋白质的氨基酸序列，以支持结构和功能的下游表征。该协议的主要优点是它快速、经济高效，并且容易集成到使用微制造平台的工作流程中。
首先，使用玻璃毛细管切割器将较大的玻璃毛细管切割成 7 到 8 厘米长，将较小的玻璃毛细管切割成 3 到 5 厘米长。使用显微镜验证毛细管末端是否具有干净、笔直的切口，没有任何突出的毛刺。将较小的毛细管插入较大的毛细管的一端约 6 毫米。
然后，使用棉签在毛细管连接处周围涂抹一小滴胶水，让胶水在室温下固化过夜。接下来，将插入的毛细管切成约 10 至 15 毫米的长度。该端将充当电喷雾电离发射器。
将较大直径毛细管的另一端插入 1/32 英寸 PEEK 管中，该管已预先切割成 4 到 5 厘米长，并连接到 PEEK 接头。然后，将 5 厘米长的 1/16 PTFE 管插入并拧紧到接头的另一端。在一个干净、干燥的 2 毫升玻璃锉中，称取 4 毫克 C18 颗粒，然后加入 0.5 毫升异丙醇。
关闭样品瓶。将其置于超声浴中并超声处理，以使颗粒均匀分散在溶液中。接下来，使用 250 微升注射器吸取 200 微升 C18 浆液。
将注射器插入 1/16 英寸 PTFE 管中，然后将浆液缓慢分配到大毛细管中。在显微镜下观察毛细管充满颗粒，直到达到 2 到 3 毫米的颗粒堆积。较小的毛细管通过梯形石效应将这些颗粒保留在微反应器中。
最后，用 50 微升 50 至 50 水与乙腈溶液冲洗微反应器，然后用 50 微升含有 49 微升水的溶液与 1 微升乙腈混合冲洗。断开毛细管微反应器与 PEEK 接头的连接，并将其连接到 PEEK-T。然后，插入一根 2 厘米长的铂丝，用 1/32 英寸 PEEK 套管绝缘，以提供与 PEEK-T 侧臂的无泄漏连接。
将半米长的样品转移毛细管连接到 PEEK-T 的另一端。使用 1/32 英寸 PEEK 套管提供无泄漏连接。将 PEEK-T 固定在 XYZ 载物台上。
并将电喷雾电离发射器放置在距离质谱仪入口毛细管约 2 毫米的位置。然后，将铂丝连接到质谱仪的电喷雾电离电源。此外，使用 1/16 英寸 PEEK 套管将样品转移毛细管的另一端连接到不锈钢接头，以提供无泄漏连接。
接下来，将一根 4 到 5 厘米长的 1/16 英寸长的 PTFE 管连接到不锈钢接头的另一端。按照随附文本协议中的说明，将串联 MS 数据采集参数输入到控制 MS 仪器的软件包中。将它们保存为方法文件，以准备执行分析的设置。
LTQ MS 系统配有改进的 ESI 离子源，其中包括一个自制的 XYZ 载物台，使质谱仪能够连接到各种样品输入方法。在250 μL注射器中加入溶解在2%乙腈中的50 mmol碳酸氢盐水溶液。然后，将注射器连接到微反应器，并将其放在注射泵下方。
冲洗微反应器，每分钟 2 μL，持续 5 分钟，以准备分析。然后，将目标蛋白质样品装入 250 μL 注射器中，以每分钟 2 μL 的速度注入样品溶液，持续 5 分钟。接下来，将一个装有 5 微摩尔胰蛋白酶溶液的 250 μL 注射器放在注射泵下，并以每分钟 2 μL 的速度将吸收的蛋白质注入微反应器上，持续 1 到 3 分钟。
在每次实验之前，新鲜解冻并制备胰蛋白酶溶液至关重要。这将确保原生分解酶保持其活性和微反应器的工作 pH 值，即 pH 值约为 8。在另一个 250 μL 注射器中加入由 0%1% 三氟乙酸添加到 2% 乙腈中的水溶液。
使用该溶液以每分钟 2 μL 的速度冲洗微反应器，持续 5 分钟，以此溶液淬灭蛋白水解酶解过程。然后，切换到装有 01% 三氟乙酸和 50% 乙腈的注射器，并在电喷雾电离电压下打开 MS 数据采集过程，电压约为 2000 伏。使用酸化溶液开始以每分钟 300 纳升的速度从微反应器中洗脱蛋白质消化物，持续 20 至 30 分钟。
使用随附文本实验方案中提供的数据采集参数采集质谱数据。首先在搜索引擎中上传原始数据，使用最小冗余的蛋白质数据库处理 LTQ MS 原始文件。然后，将母离子和碎片离子质量容差分别设置为 2 道尔顿和 1 道尔顿，并仅使用最多两个缺失切割的完全胰蛋白酶碎片进行搜索。
此外，将高置信度和中置信度错误发现率分别设置为 1% 和 3%，并且不允许翻译后修饰，除非专门寻找特定的修饰。最后，筛选数据以仅选择高置信度肽匹配。这里显示的是由胰蛋白酶肽组成的质谱，这些肽是由在微反应器中进行蛋白水解的蛋白质混合物产生的
。这些标记代表最强的胰蛋白酶肽离子，并提供其序列和相应的蛋白质标识符。该微反应器为进行蛋白质的酶消化提供了易于实施的实验设置，并能够在不到 30 分钟的时间内进行质量分析和鉴定。在尝试此程序时，请务必记住，保持与溶液接触的样品瓶和仪器的清洁度对于避免样品污染至关重要。
在此程序之后，可以使用其他质谱数据采集方法来更好地表征生成肽并回答与蛋白质结构相关的其他问题。开发后，该技术为蛋白质组学领域的研究人员铺平了道路，以开发更快的蛋白质分析方案，并探索开发新型微相溶解平台，以实现生物样品的高通量探索。该技术仅限于分析产生 25 至 50 种肽的相当简单的蛋白质混合物。
这些肽可以通过简单的输注实验进行分析，并且在 MS 分析之前不需要液相色谱分离。不要忘记，使用有机溶剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如避免明火。
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概述
本协议概述了一个流动型胰蛋白酶微反应器的制作，该反应器专为蛋白质的快速酶解而设计，可通过电喷雾电离质谱法促进蛋白质鉴定。该方法强调速度、成本效益和与微制造工作流程的兼容性。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 质谱分析
- 微制造
背景
- 蛋白质酶解对于蛋白质分析至关重要。
- 电喷雾电离质谱分析是蛋白质鉴定的关键技术。
- 微反应器可以提高酶反应的效率。
- 蛋白质组学工作流程需要快速和经济高效的方法。
研究目的
- 制作用于快速蛋白质酶解的微反应器。
- 使用质谱分析实现高效的蛋白质鉴定。
- 将该方法集成到现有的微制造平台中。
使用的方法
- 将玻璃毛细管切割成特定长度。
- 将较小的毛细管插入较大的毛细管中以进行微反应器组装。
- 使用显微镜对毛细管端部进行质量控制。
- 将微反应器与电喷雾电离质谱仪耦合。
主要结果
- 微反应器允许快速的蛋白质酶解。
- 与质谱分析的集成支持蛋白质鉴定。
- 该方法高效且适用于高通量应用。
- 质量控制确保了微反应器的可靠性能。
结论
- 本协议提供了一种快速和经济高效的蛋白质酶解方法。
- 它增强了研究环境中蛋白质分析的工作流程。
- 微反应器的设计可适用于蛋白质组学的各种应用。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
Rapid enzymatic digestion of proteins is a critical bottleneck in mass spectrometry-based proteomics workflows, directly impacting target validation and lead identification timelines. This flow-through microreactor approach reduces digestion time from overnight to under three minutes, enabling faster hypothesis testing and mechanistic de-risking in early discovery. The cost-effective, integration-ready design supports scalable assay development and reproducible peptide generation for downstream analytical confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables rapid interrogation of protein sequences to support functional target validation and pathway clarification.
- Operational Value: Reduces proteolytic digestion time from hours to minutes, accelerating hypothesis testing cycles.
- Predictive Value: Generates consistent tryptic peptides for reliable mass spec detection, improving data reproducibility across experiments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized peptide outputs suitable for quantitative MS-based assays in target engagement studies.
- Operational Value: Eliminates need for expensive immobilized enzymes, lowering reagent costs in high-throughput screening preparation.
- Assay Readiness: Delivers digested samples compatible with direct infusion MS, streamlining workflow integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports consistent protein identification from discovery through preclinical validation stages.
- Mechanistic De-risking: Reduces variability in peptide generation, enhancing confidence in target engagement and biomarker measurements.
- Predictive Confidence: Enables rapid iteration in lead optimization by providing fast structural insights via MS detection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where rapid protein digestion enables timely MS-based characterization to inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven protein analysis by enabling fast conversion of proteins to detectable peptides.
- Screening: Prepares digested samples for rapid screening campaigns without chromatographic separation, increasing throughput.
- Analytics: Generates fully tryptic peptides with defined mass tolerances, enabling reliable database searching and false discovery rate control.
- Translational Research: Provides peptide-level data that supports structural and functional continuity into preclinical models.
- Enterprise Reuse: Uses standard capillary and tubing components, allowing adaptation across proteomics platforms and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through reproducible, rapid peptide generation.
- Operational Value: Reduces hands-on time and reagent costs, increasing laboratory throughput.
- Strategic Value: Accelerates lead identification timelines by shortening protein analysis workflows.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in target validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic assembly and electrospray ionization setup.
- Depends on access to mass spectrometry systems with compatible ionization sources.
- Necessitates standardized trypsin preparation and quenching protocols to maintain enzyme activity.
- Limited to simple protein mixtures generating 25–50 peptides, as noted in source material.
- Requires careful solvent handling due to use of acetonitrile and trifluoroacetic acid.
