高分辨率定量免疫膜受体在视网膜带状突触分析

该实验的总体目标是开发一种定量分析视网膜带突触处膜蛋白的新方法。这种方法可以帮助回答视网膜神经生物学领域的关键问题，例如蛋白质在回路内突触处的精确位置。该技术的主要优点是它可以估计视网膜带突触处多种蛋白质的数量、密度和速度。

为了演示冷冻替代和超薄切片，我们有来自 NIDCD Advanced Imaging Core 的 Ron Petralia 和 Ya-Xian Wang 博士。要开始此过程，请在显微镜下解剖眼球。为此，首先要切除角膜。

然后用镊子从视网膜间表面取出晶状体和玻璃体。之后，剥开巩膜，直到视网膜与眼罩分离。立即用剃须刀将视网膜切成 100 200 微米厚的条带。

随后，将视网膜条带与 4% 多聚甲醛和 0.1 摩尔 PB 混合。然后，在 4% 多聚甲醛加 0.01% 戊二醛中，在室温下。在 PB 中用 0.15 毫摩尔氯化钙洗涤几次后，在冷冻取代之前，用 0.1 摩尔 PB 中的甘油对视黄醛条进行冷冻保护。在将冷冻组织放入扁平包埋支架之前，从透明塑料片上切出一个薄圆圈，并将其放在每个支架的底部，以便在完成后更容易取出聚合标本盒。

现在，在 AFS 中设置自动序列。用液氮填充 AFS，然后将扁平包埋支架放入 AFS 中。用 1.5% 乙酸铀酰的甲醇溶液填充它们并预冷。

要在 184 摄氏度的液态丙烷中将视黄醛条带放入冷冻，请使用细刷将样品放在小块双面胶带上，该胶带贴在插入杆末端的金属短头上。之后，使用刷子吸走多余的缓冲。将棒子插入液态丙烷中约 5 秒钟。

然后，使用充满液氮的小型运输室将它们转移到 AFS。将冷冻样品和器械、镊子和手术刀放入 AFS 后，在接触组织之前将腔室中的器械冷却几分钟。或者，将仪器的尖端放入充满液氮的小运输室中几秒钟来冷却它们。

之后，使用细手术刀从存根中取出样品和胶带。接下来，将两片冷冻切片放入扁平包埋铝支架的七个孔中，其中含有 1.5% 乙酸铀酰甲醇溶液。将它们在 AFS 中保持在 90 摄氏度至少 32 小时。

然后，按照自动顺序逐步将温度升高至 45 摄氏度。之后，在预冷的甲醇中洗涤样品 3 次。接下来，用低温包埋树脂作为包埋介质逐渐浸润样品。

第二天，再次更换填料并调整填料水平以达到孔的顶部边缘。在 AFS 上设置紫外光，并在 AFS 中用紫外光聚合样品，直到自动序列结束。然后，从 AFS 中取出样品。

通常，示例块仍会显示一些粉红色和颜色。将样品在室温下靠近化学通风橱中的荧光灯放置过夜，或直到它们看起来完全透明。在此步骤中，用超薄切片机切割 70 个 Nonometer 厚的超薄切片，并将它们收集在 formvar 碳涂层镍网格上。

用蒸馏水清洗网格一次，然后用 TBS 洗涤 3 次。然后，将骨架在 20 微升 5% BSA 的 TBS 溶液中孵育 30 分钟，然后在 20 微升含有山羊抗 CTB 和一个 NMDAR 亚基抗体的混合物中在室温下孵育过夜。之后，在 pH 值为 7.6 下，每次用 20 微升 TBS 洗涤网格 3 次。

随后，用 pH 值为 8.2 的 TBS 清洗网格一次，持续 5 分钟。用 20 微升含有驴抗兔 IGG 与 10 纳米金颗粒偶联的混合物和驴抗山羊 IGG 与 18 纳米金颗粒偶联的混合物孵育网格两个小时。两小时后，在 20 微升 TBS 中清洗网格，pH 值为 7.6 次，3 次，然后用超纯水洗涤，然后风干网格。

随后，用 5% 乙酸铀酰蒸馏水对网格进行复染 8 分钟，然后在蒸馏水中用 0.3% 柠檬酸铅溶液避光 5 分钟。对于三重标记实验，将网格在室温下与 20 μL 抗山羊 CTB、抗小鼠 PSD-95 和抗兔 UN2A 的混合物孵育过夜。然后，用 20 微升 IGG 混合物与 18、10 和 5 纳米金颗粒偶联孵育网格 2 小时。

在本部分中，首先设置比例尺。然后使用 ImageJ 软件测量单个 RGC 树突的 PSD 长度。然后，根据质膜的平均厚度为 7 到 9 纳米，对膜 10 纳米范围内的金颗粒进行计数。

将颗粒密度计算为每线性微米的金颗粒数。然后，测量每个金粒子的中心与 PSD 中间之间的突触位置或 PSD 边缘之间的距离（突触外位置）。该图显示了 GluA2/3 和 CTB 的双重免疫金标记。

这是突触前带，小金颗粒聚集在 RGC 过程的 PSD 中。该图显示了 GluN2B 和 CTB 的双重免疫金标记。小金颗粒位于突触外质膜上。

这张图显示了 GluN2A 和 CTB 的双重免疫金标记。与 GluA2/3 类似，小颗粒聚集在 PSD 内。此处显示了 GluN2A、PSD-95 和 CTB 的三重免疫金标记。

GluN2A 金颗粒和 PSD-95 金颗粒在单个 CTB 阳性 RGC 树突上的 PSD 内共定位。在尝试此过程时，重要的是要记住非常轻柔地固定组织，因为一些蛋白质抗原性，例如 NMDA 受体的抗原性会随着长时间的强烈固定而显着降低。观看此视频后，您应该对如何非常精确地检测和分析视网膜带突触的膜蛋白有很好的了解。