Name: 基于电润的数字微流体平台，用于自动酶链接免疫吸附测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习基于电润湿的数字微流体平台用于自动酶联免疫吸附测定检测病原体的方法。该技术结合磁免疫沉淀与自动化液滴操控，可在6至10分钟内完成快速、可扩展的病毒检测，适用于现场诊断应用。

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我们谨此感谢来自微流控领域的同事们所做的贡献 &amp;#38; 微型工程研究组在机械设计和系统集成方面所做的工作。作者感谢英国国防科学技术实验室（Dstl Porton Down）对本研究以及过去和正在进行的进一步开发数字微流控（DMF）技术及其应用项目的宝贵支持和资金资助。

1. 实验检测所需的初步步骤
注意（重要）：所有初步步骤必须在无菌环境中进行，以避免污染。储存时不应使用叠氮化钠，因为它会抑制辣根过氧化物酶（HRP）的活性。
<ol>
	<li>配制运行缓冲液（100 mM HEPES，pH 7.5），使用4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸，并加入Tween 80至终浓度为0.01%（v/v）。</li>
	<li>按照供应商提供的说明书，将一抗（捕获抗体）固定在NHS活化的磁性微珠表面。简要而言，磁性免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒（材料表）的说明书包含以下步骤：
	<ol>
		<li>取0.2 mL微珠（2 mg）加入塑料离心管中，去除上清液。</li>
		<li>加入1 mL冰浴的1 mM盐酸洗涤微珠。</li>
		<li>将选定的一抗（抗人血清白蛋白[15C7]、兔抗BG多克隆抗体、兔抗E.coli MRE 162多克隆抗体或山羊抗MS2多克隆抗体）以40 μg/mL的浓度溶于67 mM硼酸盐缓冲液中，与微珠在37 °C下振荡孵育1小时，实现共价结合。表1列出了本实验方案所用全部抗体及其对应的抗原病原体6。</li>
		<li>用0.8 mL洗脱缓冲液洗涤两次，去除未结合的抗体。</li>
		<li>加入1 mL封闭缓冲液，封闭反应1小时。</li>
		<li>用改良型硼酸盐缓冲液洗涤一次，再用IP裂解/洗涤缓冲液洗涤一次。</li>
		<li>将微珠重悬于0.5 mL IP裂解/洗涤缓冲液中，4 °C保存，待用。 
		注意：为获得最佳效果，建议在数字微流控（EWOD）分离及芯片上ELISA实验前一天新鲜制备偶联抗体的微珠。然而，偶联了一抗的微珠可在4 °C保存最多一个月。若发生聚集，轻敲管壁以打碎沉淀，并将微珠重新悬浮于溶液中。</li>
		<li>使用含酪蛋白阻断剂（1% w/v）的100 mM磷酸盐缓冲液（PBS），在4 mg/mL微珠终浓度下，于4 °C过夜封闭偶联抗体的微珠。 
		注意：封闭步骤总是在生物检测实验前一天进行。</li>
		<li>使用磁铁分离微珠，弃去上清液。</li>
		<li>将微珠重悬于1 mL运行缓冲液中，混匀1分钟。</li>
		<li>使用磁铁分离微珠，弃去上清液。</li>
		<li>重复上述洗涤步骤（1.2.10 和 1.2.11）两次。 
		注意：三次洗涤足以减少微珠对表面的黏附，促进液滴自由移动。</li>
		<li>将微珠以2.5 mg/mL的浓度重悬于运行缓冲液中。该微珠溶液即可用于EWOD芯片实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶（HRP）与生物素标记的二抗混合，配制成运行缓冲液中的终浓度均为1 μg/mL的混合溶液（用于BG检测6）。 
	注意：为靶向不同抗原（表1），已成功测试了多种浓度的生物素化二抗，范围为0.5至4.0 μg/mL。</li>
	<li>在开始实验前，立即将鲁米诺溶液与过氧化氢溶液等体积混合。 
	注意：鲁米诺用于量化结合事件的数量，其原理基于共价结合在靶向抗原（如病原体）的二抗上的HRP酶。然而，也可采用其他报告分子和检测策略17替代化学发光和鲁米诺进行检测。</li>
</ol>
2. 数字微流控芯片组件的制造与表面处理
注意：数字微流控芯片由一块带有图案化铬电极的驱动板和一块盖板组成，驱动板用于改变液滴的表观接触角，盖板用于限定液滴的高度。
<ol>
	<li>使用标准CAD软件以二维形式绘制电极和连接器的设计图。同时包含一个尺寸为5 × 5 mm2的废液收集垫，用于储存使用过的溶剂（图1）。 
	注意：为操控液滴，我们使用47个电极，每个电极尺寸为1.7 × 1.7 mm2。该电极尺寸适用于体积范围为1.5 µL至3 µL的液滴（在500 µm间隙条件下）。根据经验，当使用500 µm间隙时，1.5 µL是可驱动液滴的最小体积，此时液滴（投影）轮廓大致与方形电极垫外接。然而，除流体本体的阻力（摩擦）外，并无其他理论上的尺寸限制。尽管如此，建议在使用500 µm间隙时，液滴体积不超过3 µL，以确保可靠的驱动性能。电极由48通道电子系统进行寻址。 
	注意：电极垫的设计尺寸和大小可根据预期液滴体积以及实验方案中包含的实验室单元操作（LUOs）而变化。</li>
	<li>将设计图发送至掩模制造服务商，将铬掩模打印在玻璃基底上。铬层厚度为100 nm。 
	注意：用作数字微流控芯片基底的光刻掩模上的铬层本质上是不透明的。我们每个电极的设计均包含网格布局，以确保半透明性。</li>
	<li>使用精密CNC划片/切割锯将基板切割至56 × 56 mm2的尺寸。</li>
	<li>在电接触点上粘贴遮蔽胶带，以便在后续两次涂层步骤中将其隔离。</li>
	<li>通过在基板表面沉积6 µm厚的聚对二甲苯-C（Parylene-C），在铬玻璃基板上涂覆介电层。采用Gorham工艺18，使用7.4 g DPX-C在聚对二甲苯沉积系统中进行（材料表）。</li>
	<li>在基板上方使用旋涂仪以1500 rpm转速旋涂非晶氟聚合物（材料表）30秒，并在140 °C下烘烤30分钟。 
	注意：此步骤使表面具有疏水性。可通过在表面放置一滴水来验证涂层是否成功沉积。液滴与基板之间的接触角应约为110º。</li>
	<li>移除电接触点上的遮蔽胶带。</li>
	<li>在4英寸硅片上使用旋涂仪以1500 rpm转速旋涂非晶氟聚合物（材料表）30秒，并在140 °C下烘烤30分钟。 
	注意：为确保在检测过程中离散液滴能够顺畅移动，驱动基板和覆盖板的表面均需具备疏水性。</li>
</ol>
3. 数字微流控平台上的液滴微流控芯片加载、组装与操作
注意：数字微流控芯片采用平行板结构，驱动板与导电接地盖板之间的间隙精确设定为 0.5 mm。本节将描述该三明治结构的组装过程。
<ol>
	<li>从DMF平台取下盖子6 并将其放置在实验台上。 
	注意：必须使用暗室法拉第笼，以防止检测过程中杂散光和电磁干扰。笼盖无联锁装置，因此该平台允许我们观察液滴的运动。</li>
	<li>将一块干净的驱动板放置在旋转台面上，铬面朝上。驱动板需与凹陷台面的左上角对齐（图2A).</li>
	<li>使用带有47个接触针的面板从顶部夹紧驱动板。这可将驱动板固定到位，并有助于与接触针进行对准。</li>
	<li>将0.5 mm垫片和2 mm聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）隔离片放置在旋转平台上，以在驱动板与盖板之间形成受控间隙。 
	注意：可选择在下一步之前，将吸水纸放置于废液处理垫上，再进行液滴分装。随着实验的进行，废液将直接被吸水纸吸收，实验结束后可将吸水纸移除。</li>
	<li>将液滴加载至指定的加载垫上（图1).
	<ol>
		<li>从运行缓冲液中吸取四份2.5 µL的液滴，分别加入标有B、A、R、E的垫片上，每个垫片加一滴。</li>
		<li>分装 2.5 µL 的 Luminol:H2O2 将体积比为1:1的溶液加入标记为D的垫片上。</li>
		<li>将 2.5 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（1 μg/mL）加样至标记为 F 的垫片上。</li>
		<li>将2.5 µL生物素化二抗（1 μg/mL）加入标记为G的垫片上。</li>
		<li>将2.5 µL偶联有一抗的微珠（2.5 mg/mL）加入标记为I的垫上。</li>
		<li>将2.5 µL未知样品加入标记为C的垫片上。 
		注意：上述加样模式仅为实验布局的一个示例，但只要与软件中定义的顺序一致，用户可根据实际需求调整加样模式。补充文件 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盖板放置在设备表面的圆形凹槽区域旁边，然后侧向滑动，使其进入凹槽并覆盖在驱动板上方图2B).</li>
	<li>将永磁体放在盖板顶部，并通过滑动两个锁扣来固定图2C).</li>
	<li>将载物台旋转180°，并目视检查已加载的液滴是否仍处于原位（图1C). 
	注意：应能够通过透明载物台和驱动板背面目测液滴的位置和形状图2D如果在加样电极垫表面可见圆形液滴，则表明检测可进行。若液滴发生移位，可移除磁铁和盖板，用洁净的移液枪吸取移位的液滴，并将其重新置于加样垫上。</li>
	<li>检查每个液滴的加载位置是否与软件中预设的驱动序列一致（参见 补充文件 1 有关软件的详细信息）。 
	注意：为了能够直观检查液滴的位置，需要拆下光电探测器（图2D).</li>
	<li>放置屏蔽后的光电探测器 &#34;能&#34; 插入旋转台的插槽中。 
	注意：光电检测系统以一个具有大面积收集区域（10 × 10 mm）的光电二极管为核心进行枢轴转动2以最大化光收集效率而不使用额外光学元件，同时采用跨阻放大器以最小化噪声6然而，该系统极为敏感，能够采集微弱信号。为了降低噪声水平，已采用多种基于电子学的策略（例如，将光电探测系统置于法拉第笼中加以保护，法拉第笼是一种被称为屏蔽罩的金属外壳） &#34;能&#34;).</li>
	<li>将电缆连接至屏蔽的光电探测器 &#34;能&#34;. 
	注意：一旦数字微流控芯片与光电探测器对齐，数字微流控平台即完成全部组装，可开始运行。</li>
	<li>将盖子盖在数字微流控平台上方，使用赫特福德大学开发的软件界面启动程序序列。 
	注意：需要使用其他软件来读取并记录液滴随时间变化的发光信号，并以 CSV 文件格式保存（参见 补充文件 2).
	<ol>
		<li>确保程序设定的序列（参见 补充文件 1) 界面会显示提示信息，告知操作人员 &#34;鲁米诺液滴已准备好收集提取的磁珠&#34; 或 &#34;检测液滴已准备就绪，可移至检测位点。&#34; 在这两种情况下，均需操作员确认后才能继续执行程序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 可视化模式下的操作（可选，用于优化实验方案）
注意：如有需要，为了可视化观察每一个基于液滴的操作，可跳过步骤 3.10–3.12，并将其替换为以下操作。
<ol>
	<li>使用软件界面启动程序序列。 
	注意：在视觉模式下运行时，可观察液滴的移动情况，这在优化实验方案期间非常有用。首先，用于检查磁性分离操作的可重复性。例如，若使用的磁珠量过少，则无法实现磁性分离；反之，若磁珠量过多，液滴可能会被磁珠沉淀物固定住。其次，用于确认新检测方法的可靠性，因为某些液滴配方可能导致驱动功能受损，通过观察可发现此类问题。</li>
	<li>当系统提示时，将带屏蔽的光电探测器&#34;can&#34;插入旋转台的狭缝中。</li>
	<li>通过将插针插入插座，将电缆连接至带屏蔽的光电探测器&#34;can&#34;。</li>
	<li>将盖子盖在数字微流控（DMF）平台上方，并继续进行检测。 
	注意：使用附加软件读取并记录液滴随时间变化的发光信号，保存为 CSV 文件格式（参见 补充文件 2）</li>
</ol>
5. 去除废液并清洗芯片
警告：清洁前请确保设备已关闭并断开电源（计算机、主电源）。从芯片上移除生物样本时，必须佩戴手套、实验服和护目镜（个人防护装备）！
<ol>
	<li>为接触驱动板上的电极和所用溶剂，打开数字微流控（DMF）平台盖板，并将载物台旋转180°。</li>
	<li>打开磁体外壳，将磁体从旋转载物台上取下，并放置于实验台面。</li>
	<li>使用镊子从狭缝中取出覆盖板（硅片），用去离子水冲洗，再用压缩空气吹干，然后放入培养皿中，以便储存和重复使用。</li>
	<li>使用微量移液器将垫片上的液体废液移除，注意不要触碰表面。</li>
	<li>使用吸水纸（滤材）通过毛细作用吸除驱动板表面的液体，以清洁表面。 
	注意：保持表面完整可延长驱动板的使用寿命，实现多次使用。</li>
	<li>用洁净的移液器吸取少量去离子水，在电极表面轻轻擦拭以清洁驱动板，随后用吸水纸（滤材）吸除水滴。 
	警告：将被生物材料污染的纸巾、纸张、移液器吸头和手套丢弃至生物废弃物垃圾桶中。</li>
	<li>将驱动板用于其他检测实验，或从DMF平台上取下以进行储存或回收。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

数字微流控免疫分析实验方案具有灵活性，可根据检测方案定义的试剂类型、稳定性和使用要求，包含多种实验室单元操作（例如，捕获抗原、混合、孵育、磁珠提取、洗涤）。作为原理验证，本文中展示了两种免疫分析方案，分别实现了八步或十步单元操作（图4），均在所述的数字微流控芯片上完成。这种微型化的优势在于采用微升级别的离散试剂/分析物体积，通过减少试剂消耗量以及每步操作所需时间，显著缩短了整个实验时间（6至10分钟），从而提高了ELISA的效率。此外，该检测通过定时操控液滴实现自动化，减少了操作变异，提升了免疫分析的精密度17。在当前的形式下，每次检测开始时仍需手动处理液滴，这一点将在下一节中进一步讨论。
当前数字微流控方法中的一个关键步骤是将液滴分配到电润湿芯片的表面。通常使用带有一次性吸头的微量移液器来量取精确体积并加载液滴。然而，由于液滴与一次性吸头带电表面之间的相互作用，可能难以将液滴稳定地固定在驱动板的疏水表面上。结果，液滴可能沿着吸头外表面向上弹起，而非停留在板面上。为避免此问题，必须将微量移液器保持竖直状态，垂直于芯片表面但不接触，然后通过使吸头与表面接触将液滴分配到加载区域。如果液滴粘附在移液器吸头上，应将其返回原储备溶液中，更换吸头后重新沉积一个新的液滴。在当前概念验证系统的进一步发展中，可设想实现液滴的自动递送。
在运行检测之前的另一个关键步骤是关闭平行板组件的盖子。如本方案前面所述，盖子必须滑动到驱动板的顶部。盖子的疏水表面可防止位于驱动板上的液滴发生形变和位移。为了确保液滴的顺畅移动，强烈建议使用洁净的驱动板、正确加载液滴以及正确组装芯片。驱动板可以重复使用，但使用次数取决于驱动电压（图3）以及分析物/试剂在表面的沉积情况，即生物污染。本研究所采用的平台使用了铬图案化的EWOD芯片，在120 V工作电压下，每次实验后对芯片进行中间清洗，该芯片可稳定重复使用多达四次。为降低每次实验的成本，通过去污染处理（先用未稀释的清洁剂刷洗表面，再彻底冲洗）去除驱动板表面被生物污染的非晶态氟聚合物（材料表）涂层，并在板上重新旋涂一层新的涂层来实现驱动板的回收利用。然而，驱动板的回收需要人工操作、成本较高的试剂（非晶态氟聚合物（材料表））以及专用设备（旋涂仪）。目前已有研究成功探索了其他成本更低的替代性EWOD芯片，例如以纸张19、醋酸纤维素膜或印刷电路板（PCBs）20,21作为基底材料。这类一次性耗材有助于实现数字微流控（DMF）平台的可靠且经济的使用，并可有效规避生物污染问题。
生物污染是数字微流控（EWOD）在生物应用中的主要限制因素22,23。早期关于数字微流控（DMF）的研究已确定了导致生物污染的两种机制：一种是由于疏水相互作用引起的被动吸附，另一种是在施加电场时发生的静电驱动吸附24。本文的研究结果与该理论一致，观察到在高驱动电压下，驱动板的可重复使用性降低。一种可能的解释是，蛋白质容易吸附在氟聚合物涂层（类特氟龙）表面，并且在已被污染的表面上比在原始表面上更快地聚集24。因此，基于DMF的蛋白质相关检测难以准确定量，并可能出现分析物损失、交叉污染以及精密度下降等问题17。最严重的情况是当有关键量的蛋白质发生吸附，导致装置完全失效。为尽量减少生物污染，已探索多种方法，包括缩短液滴在芯片上的停留时间、使用表面涂层23，以及向含生物材料的液滴中添加添加剂（如表面活性剂或泊洛沙姆酸）6,22。因此，在EWOD上进行免疫分析时，一个重要方面是选择与特定实验方案相容的抗生物污染策略。
该自动化的数字微流控（DMF）平台设计为每次运行执行一次夹心酶联免疫吸附测定（ELISA），且试剂和分析物均仅需微升级体积。在需要高通量的情况下，已有基于预包被96孔或384孔板的传统夹心ELISA试剂盒，结合辅助实验设备可实现每轮更高的检测通量；仅按试剂价格计算，每个检测/孔的成本分别约为6.04美元（580美元/96）和0.33美元（2×580美元/384）。这使得传统ELISA方法适用于由经过培训的技术人员在集中式实验室设施中处理大量样本的情况。然而，在偏远地区，针对环境监测的ELISA详细成本分析表明，当计入资本成本（即实验室运营成本、重复性开支、样本运输、耗材和人员费用）后，每次ELISA的实际价格为60美元，其中每份样本的耗材费用为34美元25。相比之下，所提出的DMF平台具有便携性，操作所需培训极少，并可通过预包被微珠在数分钟内完成从样本到结果的分析。因此，该技术可部署至需求现场，作为集中式实验室分析能力的补充。
在代表性结果部分，采用自动化的数字微流控免疫分析平台直接检测病原体，用于国防应用。该数字微流控平台的其他潜在应用包括但不限于生物诊断、连续监测和自动化采样。该技术有望影响多个领域，例如用于个性化医疗的即时检测，用于保护患者免受空气传播的医院获得性感染的密闭环境监测，以及用于农业和食品生产的作物监测系统。

本方法旨在通过基于电润湿（EWOD）的数字微流控（DMF）技术结合磁泳分离，实现酶联免疫吸附测定（ELISA）中抗原定量检测的自动化样本制备。已有多种生物应用表明，将数字微流控与磁泳技术相结合，是液体操控应用的一种颇具前景的替代方案1。更具体而言，病原体检测在诸多领域中均具有重要意义，涵盖从医疗保健2到农业与环境3,4，乃至国家安全5。一种能够有效应对病原体威胁的检测技术，必须具备高通量（例如较短的检测时间）、高效率（低检测限——LoD——及高灵敏度）以及高特异性（针对目标病原体类型），方能具备实际功能6。
此前，基于电润湿的数字微流控（EWOD-based DMF）已成功应用于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、利用低成本印刷电路板芯片和磁泳技术检测耐药病原体（耐甲氧西林Staphylococcus aureus，MRSA）、M.pneumonia 和 C.albicans7。该技术还被用于通过焦磷酸测序和化学发光检测方法检测脱氧核糖核酸（DNA）突变8。基于EWOD的平台功能进一步拓展至免疫分析应用，从而在单一集成平台上实现样本富集与检测的同步进行。例如，已有研究成功在一个数字微流控平台上，利用同一款EWOD芯片设计，分别实现了全血样本中基于微珠的心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I）免疫分析的即时检测，以及独立实验中的MRSA检测RT-PCR2。该芯片采用油相填充物，可防止液滴蒸发，并有助于纳升级体积液体的可靠自动化操控。通过采用类似的数字微流控方法，研究人员已探索了多种生物应用，涵盖均相与非均相免疫分析的定量检测9,10，并包括用于优化检测参数的实验设计（Design of Experiments, DoE）研究11。
尽管油填充的数字微流控（DMF）平台由于工作体积微小而在过程强化方面具有明显优势，但其操作可能具有挑战性，需要具备一定专业水平的技术人员。由于油填充系统需要密封组件，因此在需要系统便携性的某些现场应用中并不理想。此外，对于某些特定应用，例如利用表面干物质收集的方法（如Zhao和Cho12、Jönsson-Niedziółka等13以及Foat等14所提出），基于油的系统将极难甚至无法使用。相比之下，无油系统更易于集成，并具有实现芯片间样品简便转移的优势。基于上述原因，本研究提出了一种基于电润湿数字微流控（EWOD）的免疫分析方法，该方法无需使用油相，从而有效简化了装置的操作。
本文介绍了一种定制的、独立式、全自动数字微流控（DMF）平台在免疫分析中的应用，并详细阐述了用于快速检测生物分子（包括蛋白质、营养细胞、细菌芽孢和病毒）的实验方案。此前已有研究将电润湿数字微流控（EWOD）芯片与磁性颗粒结合，用于自动化样品制备和免疫沉淀，并辅以离线质谱（MS）检测15。最近，Wheeler 团队已在肯尼亚西北部偏远地区人群中实现了针对麻疹和风疹 IgG 的现场诊断16。Wheeler 团队的系统与本系统均具备可运输、自包含、全自动的特点，并集成了芯片内实时化学发光检测功能，堪称目前最先进的 DMF 生物检测系统之一。
这两个系统的设计初衷截然不同。Wheeler 的系统针对生物标志物，旨在实现对患者的生物医学诊断；而我们的生物检测系统则是围绕国防需求构建，用于直接检测此前从空气中采集的病原体。两者的共同之处在于其底层的液滴驱动原理，这表明基于电润湿的数字微流控（EWOD）技术可广泛影响多个与生命相关的领域。具体而言，基于数字微流控（DMF）的检测平台及其相关的EWOD系统，可能在以下领域发挥关键作用：医疗健康（生物医学诊断）、军事与民用防护（威胁物检测）、农业技术（作物监测）以及职业安全（受控环境监测）。
本研究通过全自动检测人血清白蛋白（HSA，一种球状蛋白）、Escherichia coli（E. coli，一种营养态细菌）、Bacillus atrophaeus（BG，一种细菌芽孢）以及MS2（一种噬菌体病毒）来评估我们开发的数字微流控（DMF）平台的性能。更重要的是，所提出的DMF方法具有极高的灵活性，可通过更换捕获抗体以针对本文所述四种目标物以外的其他抗原进行检测。此外，该平台亦可完全不依赖抗体传感，转而构建基于适配体生物传感的潜在应用，其中磁珠携带特异性适配体用于核酸的捕获和/或检测。构成该集成式、完全自包含DMF平台的各个组件的设计与实现，包括高压波形发生器及驱动电子系统，已在其他文献中公开6。

<table><tbody><tr><td>4-(2-羟乙基)哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9897</td><td></td></tr><tr><td>抗人血清白蛋白抗体 [15C7]</td><td>Abcam</td><td>ab10241</td><td></td></tr><tr><td>抗人血清白蛋白抗体 [1A9]（HRP标记）</td><td>Abcam</td><td>ab24438</td><td></td></tr><tr><td>B. atrophaeus（BG）芽孢</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的兔抗BG多克隆抗体</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的兔抗E. coli MRE 162多克隆抗体</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的兔抗MS2多克隆抗体</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>封闭剂酪蛋白（Blocker Casein）</td><td>Thermo Scientific</td><td>TFS 37582</td><td></td></tr><tr><td>CNC划片/切割锯</td><td>MTI Corp, 美国</td><td>SYJ-400</td><td></td></tr><tr><td>Cytop</td><td>AGC, 日本</td><td>CTL-809M</td><td>非晶态氟聚合物，为双组分涂层。</td></tr><tr><td>E. coli MRE 162</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗MS2多克隆抗体</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>滨松光电二极管</td><td>滨松，日本</td><td>S9270</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（32%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W530574</td><td></td></tr><tr><td>掩模制造服务</td><td>Compugraphics, 苏格兰，英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>MS2病毒</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>聚对二甲苯-C（Parylene-C, DPX-C）</td><td>Specialty Coating System, 美国</td><td>CAS号：28804-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Pierce直接磁性免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>88828</td><td>包含酶固定化所需的所有缓冲液和试剂。4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>兔抗BG多克隆抗体</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>兔抗E. coli MRE 162多克隆抗体</td><td>Dstl, 英国</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>重组人血清白蛋白蛋白（HAS）</td><td>Abcam</td><td>ab201876</td><td></td></tr><tr><td>SCS聚对二甲苯沉积系统</td><td>Specialty Coating System, 美国</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆，4英寸，p型，&amp;lt;100&gt;，1&amp;ndash;10 &amp;Omega;cm</td><td>Pi Kem Ltd</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>S&amp;Uuml;SS MicroTec AG, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA Femto高灵敏度底物</td><td>Thermo Scientific</td><td>37075</td><td>包含50 mL鲁米诺/增强剂和稳定过氧化物溶液。4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>吐温80（Tween 80）</td><td>Thermo Scientific</td><td>28328</td><td>制造商为Surfact-Amps去垢剂溶液。</td></tr></tbody></table>

基于电润湿的数字微流控平台用于自动化酶联免疫吸附测定

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

电润湿是指液滴在表面电荷作用下接触角发生变化的现象。介电层电润湿（EWOD）利用薄绝缘膜的介电特性来提高电荷密度，从而增强电润湿效应。电荷的存在会诱导液滴铺展，使其能够在疏水表面上进行有目的的操控。本文中，我们展示了一种基于EWOD的自动化表面驱动平台，通过两种酶联免疫吸附测定（ELISA）方法的变体，实现对四类抗原的样本处理与检测。该ELISA检测在固定有初级抗体的磁性微珠上进行，可根据目标抗原选择相应的抗体。与HRP偶联的抗体与抗原结合后，加入H2O2/鲁米诺进行反应，以定量检测捕获的病原体。实验可在6至10分钟内完成，且仅需极微量的试剂。

为阐明进行检测的最佳条件，研究了驱动电压的影响。从缓冲液中驱动液滴，在不同驱动电压下记录其运动情况。研究结果表明（图3）均方根驱动电压（Vrms）与平均速度之间存在相关性。然而，当使用较高的Vrms值时，驱动板的使用寿命会降低。基于这些结果，选定105 Vrms作为标准驱动电压，H2O2/鲁米诺液滴采用120 Vrms效果最佳，而提取LUO则采用165 Vrms。这些电压值已被纳入自动编程序列中（补充文件1）。
使用数字微流控（DMF）平台上的电润湿（EWOD）芯片，成功测试了针对四种不同病原体的两种免疫测定方法（图4）（表1）。EWOD芯片实现了液滴从加样区连续转移至混合区域，最终进入废液区。在整个ELISA流程中，重复执行了两个基本的液滴操作单元（LUO）。第一个是提取LUO；简要描述如下：含有悬浮微珠的液滴被驱动至混合区中部的分离位点，磁铁自动靠近芯片，将磁性微珠聚集形成沉淀（图5）。随后，液滴被移向废液区，而微珠则留在驱动板上，从而完成提取LUO。下一个关键LUO是在EWOD芯片上进行混合操作。通过电润湿将含有未知浓度病原体的待测样本液滴转移至微珠上。然后，通过在混合区域（共10个电极垫）移动含有聚集微珠的液滴，使微珠重新悬浮。这两个LUO至关重要，它们实现了样本处理的微型化、快速化和可重复性，并可在6至10分钟内连续检测病原体。图6展示了利用EWOD芯片完成免疫测定的全部LUO操作序列。
为达到所需的自动化水平，可对方案进行若干调整。例如，可将磁珠从抗原耗尽的液滴中分离，随后将该液滴转移至废液垫，重复基本的提取液滴操作单元（LUO）。在此阶段，方案可根据检测抗体是否已与辣根过氧化物酶（HRP）偶联而分叉，从而在不同抗原检测中总共有效使用八个液滴操作单元（LUO）。图7A-C）。在这些情况下，将含有检测抗体的液滴移至磁珠处，然后通过驱动进行混合。或者，也可在EWOD芯片上原位依次将检测抗体与Neutravidin-HRP偶联物结合，正如先前在定量检测中所展示的那样。 E. coli (图7D）。这两种方案，八步法和十步法ELISA（图4），实现了抗原的可重复检测。
通过调整孵育时间和偶联物浓度，实验确定了该检测的最佳条件（图7A）。结果表明，孵育时间为160秒、偶联物浓度为2 μg/mL时，信噪比最佳，信号强度提高了36%，而背景噪声水平几乎未发生变化。代表性结果部分所使用的全部图示和数据均修改自先前的研究6。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>一抗 / 捕获抗体</td>
			<td>检测抗体</td>
			<td>抗原</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗人血清白蛋白 [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241)</td>
			<td>辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗-HSA [1A9] (Abcam ab24438)</td>
			<td>人血清白蛋白 (HSA, Abcam)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>兔抗B. globigii多克隆抗体</td>
			<td>生物素标记的兔抗B. globigii多克隆抗体</td>
			<td>B. globigii (BG) 芽孢</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>兔抗大肠杆菌MRE 162多克隆抗体</td>
			<td>生物素标记的兔抗大肠杆菌MRE 162多克隆抗体</td>
			<td>大肠杆菌MRE 162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>山羊抗MS2多克隆抗体</td>
			<td>生物素标记的兔抗MS2多克隆抗体</td>
			<td>MS2噬菌体病毒</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中测试的抗原和抗体。 使用了四种类型的病原体抗原，以展示数字微流控平台中EWOD芯片的功能。
<img alt="微流控芯片示意图及放大后的网格成像；用于细胞分选分析的芯片内部结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：电润湿驱动（EWOD）板的设计。（a）EWOD驱动板的示意图，包含连接器（上方方块），通过连线与电极（下方方块）相连。每个焊盘均被赋予一个编号，并可通过软件代码进行寻址（补充文件1）。加载电极焊盘用箭头标出，并在每个焊盘上方或下方用大写字母标注。数字微流控（DMF）平台的一个关键特征是混合区，由十个焊盘组成（编号31、32、33、36、37、42、43、44、46、47）。为便于观察，混合区以红色矩形标出。（b）焊盘微网格设计的显微图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在旋转台上带有磁体的 EWOD 芯片装置；用于光学激发实验的示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：数字微流控系统（DMF）组装的组件与关键步骤。 （A） 固定 EWOD 驱动板，将垫片放置在旋转台上并加载液滴。（B） 安放盖板。（C） 安装磁体外壳，扣紧卡扣并将台面旋转 180°。（D） 自动化磁体朝下。检查液滴的位置与形状，确认印制电路板（PCB）引脚与 EWOD 芯片上的触点对齐，连接光电探测器并将其插入光电探测器插槽。将控制电子设备连接至计算机后，系统即可准备运行检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="液滴速度与电压关系图；每块板的检测次数分析；带误差棒的数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig3large.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：驱动板的重复使用及其对驱动电压的影响。 运行缓冲液中液滴的平均速度随驱动电压的变化关系（蓝色圆圈）以及三次独立测量的标准偏差（N = 3）被绘制出来。此处每块板的检测次数（灰色柱状图）表明在较高电压下表面退化加剧。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫分析中磁珠-抗原-HRP偶联物检测的流程图，展示提取与检测步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：采用EWOD测试的免疫分析示意图。 本图中每个圆圈代表加载到EWOD芯片上的2.5 μL体积。第一个方案（左侧）显示使用预混的抗体-HRP偶联物进行八个液滴操作单元（LUO）；而第二个方案包含十个LUO，分别添加生物素化检测抗体、磁珠提取以及连续结合Neutravidin-HRP偶联物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="磁珠分离过程示意图序列；蛋白质纯化实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：磁珠提取。 该过程分解为 (a–c) 驱动含有悬浮磁珠的液滴移动至混合区中部的磁分离位点（垫片编号 33），(d, e) 磁铁移动到位以聚焦磁珠，(f, g, h) 磁力将磁珠固定在原位，同时通过电润湿驱动（EWOD）将液滴驱离至废液垫（垫片编号 41）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig5alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="数字微流控免疫分析示意图；液滴驱动、磁珠回收、抗原检测步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：使用电润湿数字微流控（EWOD）完成的完整免疫分析流程，展示试剂、样品加载及实验室单元操作。 每一行包含液滴在典型操作过程中的一系列样本图像。操作按列划分。悬浮液中磁珠不进行混合操作，以黑色虚线表示。液滴移动方向由蓝色箭头指示，橙色箭头在一个图像中突出显示磁珠。灰色方框（右下角）分隔代表检测区域中移动与位置的两张图像，虚线圆圈标出检测区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig6alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="基于纳米碳传感器的生物标志物检测中浓度与检测器输出关系图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig7a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：基于数字微流控平台在EWOD芯片上进行免疫测定所获得的校准曲线。 如先前报道6 输出电压（mV）随浓度的变化如图所示： （A） 人血清白蛋白，用于研究结合抗体浓度 [C] 和孵育时间 t 的影响inc从已知分析物与珠粒混合至提取出 LUO 的时间， (B) B. atrophaeus （BG）孢子展示了免疫测定的可重复性， (C) MS2噬菌体免疫测定，以及 (D) ten-LUOs 方案的结果 E. coli缩写：菌落形成单位（cfu）、空斑形成单位（pfu）、独立实验次数（N）、实验室单元操作（LUO）。图表改编自先前发表的文献6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1：使用链霉亲和素-HRP 作为偶联物在数字微流控平台上自动化 ELISA 检测的完整运行序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/APPENDIX_A.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件2：显示化学发光测量的图形用户界面及该软件测量结果的示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/APPENDIX_B.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

基于电润湿的数字微流控技术是一种利用电压驱动微升体积液滴的表观接触角变化来实现液滴操控的方法。将该技术与功能化磁珠相结合，可集成多种实验室单元操作，用于基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的病原体样本制备与鉴定。

电润湿是指液滴在表面电荷作用下接触角发生变化的现象。介电层电润湿（EWOD）利用……

实现单个液滴的自动化激活，可将复杂的实验室单元操作序列集成到一个芯片上。我们的数字微流控平台致力于在实地快速特异性检测病毒病原体。该方法基于利用基于电润湿的数字微流控技术结合磁性免疫沉淀，对特异性抗原进行定量检测。本研究采用含不同浓度细菌、芽孢、病毒和蛋白质的样本对该方法进行评估。该过程完全自动化、可连续操作、可扩展且具有多功能性。可根据特定实验方案的要求，调整操作步骤顺序及液滴体积。完全绕开基于抗体的检测方法，数字微流控平台有望基于适配体生物传感技术实现潜在应用，其中磁珠携带特异性适配体用于捕获和检测核苷酸序列。首次尝试该技术时，重要的是要考虑表面活性剂的类型及其与所选生物化学体系以及疏水性聚合物涂层之间的相互作用。首先，将磁铁从数字微流控（DMF）平台取下，并放置在实验台上。将洁净的驱动板放置在旋转台面上，使铬面朝上，并与凹陷台面的左上角对齐。使用带有47个触点针的面板从顶部夹紧驱动板，以固定板片位置并便于与触点针对齐。然后将0.5毫米垫片和2毫米厚的PMMA隔离片依次装到旋转台面上，以在驱动板与盖板之间形成受控的间隙。为了将液滴加载到指定的加载垫上，使用移液器将运行缓冲液分别取四份2.5 µL的液滴，依次加至标记为B、A、R和E的垫片上，每个垫片加一滴。然后，将2.5 µL的鲁米诺过氧化氢溶液加至标记为E的垫片上。接着，将2.5 µL的辣根过氧化物酶（HRP）偶联链霉亲和素（Neutravidin）生物素化二抗与微珠的混合物，分别取2.5 µL加至标记为F、G和I的垫片上。最后，取2.5 µL未知样品加入标记为C的垫片上。将盖板放置在装置表面圆形凹槽区域旁，然后横向滑入凹槽并覆盖在驱动板上方。将永磁体置于盖板顶部，并通过滑动两个卡扣将其固定，随后将装置旋转180度，目视检查以确保加载的液滴仍处于原位。检查每个液滴的加载位置是否与软件中预设的驱动序列一致。将带屏蔽罩的光电探测器插入旋转台的插槽中，并连接电缆。将盖子盖在数字微流控平台上方，然后通过软件界面启动程序序列。通过电容传感记录液滴位置，随后可在用户界面上观察到。程序序列将提示界面显示相应消息，告知操作者鲁米诺液滴已准备好收集提取的磁珠，或检测液滴已准备好移至检测位点。在这两种情况下，均需操作者确认后方可继续。化学发光反应产生的光强度由光电探测器读取，并实时记录。为以可视化模式运行以优化实验方案，需通过软件界面启动程序序列。在芯片上可观察到每个关键检测步骤的自动液滴操控过程，例如磁珠的磁性提取、磁珠重悬及混合。当提示时，将光电探测器屏蔽罐安装到旋转台的狭缝中。通过将插针插入插座来连接光电探测器屏蔽罐的电缆。将盖子盖在 DMF 平台上，并继续进行检测。通过电容传感监测液滴，并可在用户界面上观察液滴状态。清洁设备时，打开数字微流控平台的盖子，将载物台旋转180度。松开磁体外壳的铰链，从旋转载物台上取下磁体。用镊子从载片上取下硅片，并用蒸馏水冲洗。然后用压缩空气吹干，并将其放入培养皿中，以便储存和重复使用。使用微量移液器从垫片上移除液体废液，注意不要接触表面，并用吸水纸从驱动板上吸走液体以清洁表面。为了研究驱动电压的影响，将缓冲液中的液滴在不同驱动电压下进行驱动，并记录其运动情况。结果显示，均方根电压（Vrms）与平均速度之间存在相关性，且当Vrms达到某一数值后，速度趋于稳定。当使用较高的Vrms值时，驱动板的使用寿命降低。在提取实验室单元操作中，含有悬浮微珠的液滴被驱动至混合区中部的分离位置。随后，磁铁自动启动，靠近芯片并将微珠聚焦。接着，液滴被移向废液垫，留下微珠。在EWOD芯片上进行的提取和混合实验室单元操作，实现了样本处理的微型化、快速化和可重复性，并可在6至10分钟内连续检测病原体。通过调整孵育时间和偶联物浓度，以寻找检测的最佳条件。结果表明，孵育时间为160秒、偶联物浓度为每毫升2微克时，信噪比最佳。可根据需要引入自动化程度不同的实验方案变体。八步ELISA法用于检测不同的抗原，如萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）孢子和MS2噬菌体；而十步法用于定量大肠杆菌（E.coli）。必须确保所施加的电压、分析物和试剂的浓度均处于最佳条件，以实现液滴的有效激活以及芯片上的成功磁性分离。为获得精确的测量结果，应考虑磁珠的结合能力，可能需要对分析物进行系列稀释。通过更换抗体的类型，即可检测不同于结果部分所报告的其他病原体。该方法还可应用于生物标志物检测或现场即时诊断。除已提及的应用外，该系统在开发时还特别考虑了对空气中病原体的现场检测。数字微流控（DMF）是此应用的理想平台，因为液滴体积与我们近期开发的其他采样器的输出相匹配。

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