Name: 数字微流体进行自动蛋白质组学处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 了解数字微流体技术用于临床蛋白质组学的自动化样品处理方法。该技术整合蛋白质提取、还原、烷基化和酶解等步骤，可在室温下实现并行分析，为生物标志物发现提供高效工具。

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感谢自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大癌症协会提供的资金支持。SCCS 感谢 NSERC 提供的研究生奖学金，VNL 感谢安大略省研究生奖学金（OGS）项目提供的资助。ARW 感谢加拿大研究主席计划（CRC）授予的加拿大研究主席职位。

第一部分：器件制备
<ol>
<li>将玻璃基底浸入piranha溶液（浓硫酸:30%过氧化氢 = 3:1）中清洗，持续10分钟，并频繁振荡。</li>
<li>用去离子水（DI水）冲洗基底后，用N2气体吹干，随后将基底放入电子束蒸发腔中进行铬层沉积（厚度为250 nm）。</li>
<li>为使镀铬基底脱水，先用异丙醇冲洗，然后在热板上115°C条件下烘烤5分钟。</li>
<li>将基底干燥后，通过旋涂法（30秒，3000 rpm）涂覆六甲基二硅氮烷（HMDS）进行表面处理；再以相同参数旋涂Shipley S1811光刻胶。</li>
<li>在热板上预烘基底（100°C，2分钟），然后通过掩膜对光刻胶进行紫外光（UV）照射曝光，曝光时间为5秒。</li>
<li>将曝光后的基底浸入Shipley MF 321显影液中显影3分钟，随后用去离子水清洗，并在热板上后烘（100°C，1分钟）。</li>
<li>将暴露的铬层浸入铬刻蚀液中刻蚀30秒；用去离子水冲洗后，再浸入AZ300T剥离液中10分钟，以去除残留的光刻胶；再次用去离子水冲洗，并用N2气体吹干。</li>
<li>通过化学气相沉积法在具有图案化铬层的基底上沉积2–5 μm厚的聚对二甲苯-C（Parylene-C，一种绝缘聚合物）；再将Teflon-AF溶液（1% wt/wt溶于Fluorinert FC-40）以2000 rpm旋涂60秒，在基底表面沉积50 nm Teflon-AF以增强疏水性；随后在热板上后烘（160°C，10分钟）。</li>
<li>制备上层基板时，将未图案化的氧化铟锡（ITO）玻璃基底按上述相同方法涂覆50 nm Teflon-AF。</li>
<li>将两个基底均在热板上后烘（160°C，10分钟）。</li>
</ol>
第二部分：设备设置与自动化
<ol>
<li>在采用“双板”构型运行的数字微流控装置中1，液滴被置于底部基板（带有图案化电极）和顶部基板（带有一个连续的透明电极，通常由氧化铟锡（ITO）制成）之间。</li>
<li>设置装置时，用手术刀轻轻刮除底部基板电极焊盘上的聚合物涂层。将底部基板暴露的焊盘与40针连接器耦合（图1a）。</li>
<li>启动运行LabView软件（National Instruments，Austin，TX）的计算机、自制控制箱（配备由National Instruments DaqPad信号控制的高压继电器阵列）、函数发生器和放大器。计算机/控制箱可通过40针连接器实现对装置施加100 VRMS/18 kHz信号的用户控制。</li>
<li>通过在底部基板边缘放置两段双面胶带（总厚度140 μm），并将未图案化的ITO载玻片（顶板）覆盖其上，完成装置组装。</li>
<li>为初始化控制系统，运行内部编写的LabView校准程序，以校准反馈控制。</li>
<li>将样品和试剂加载至相应的储液区（见下文第3节），并将其封闭在顶部基板下方（特氟龙涂层面向下）。将接地连接器连接至顶部基板。</li>
<li>在LabView中加载驱动代码（内部编写），并执行程序以启动液滴驱动。</li>
</ol>
第3部分：样品与试剂制备
<ol>
<li>配制工作缓冲液（WB）：100 mM TrisHCl（pH 7.8）和 0.08% Pluronic F127 w/v。</li>
<li>将待分析的蛋白质溶解于WB缓冲液中，并用移液器将样品加入装置的储液池1（R-1），如图1b所示。</li>
<li>配制沉淀剂：将20%三氯乙酸（TCA）溶于去离子水中，移液至R-2管。</li>
<li>配制洗涤缓冲液，将70/30 氯仿/乙腈（ACN）移入R-4管中。</li>
<li>配制复溶缓冲液：100 mM 碳酸氢铵（pH 8.0）和 0.08% Pluronic F127（w/v），用移液器加入 R-5 中。</li>
<li>溶解还原剂， tris(2-羧乙基)膦（TCEP），在WB中浓度为10 mM，移取至R-6。</li>
<li>将烷基化试剂碘乙酰胺（IAM）以12 mM浓度溶解于WB缓冲液中，并用移液器加入R-7管中。</li>
<li>将胰蛋白酶溶解于WB中，其浓度等于总蛋白样品浓度的1/5（见上述3.1），并用移液器加入R-8中。</li>
</ol>
第4部分：数字微流控样本处理
<ol>
<li>以下步骤通过自行编写的 LabView 代码自动实施。从储液池中分配的液滴体积由电极尺寸决定（在本例中，分配的液滴约为 600 nL）。</li>
<li>从 R-1 分配一滴含蛋白质样品的液滴，从 R-2 分配一滴沉淀剂液滴（图 2，帧 1）。将两滴液滴合并，并让合并后的液滴孵育 5 分钟，使蛋白质沉淀到表面（图 2，帧 2-3）。将上清液驱动离开沉淀的蛋白质，移至废液储液池 R-3（图 2，帧 4）。</li>
<li>从 R-4 分配三滴洗涤缓冲液，并将其驱动穿过沉淀的蛋白质，移至废液储液池 R-3（图 2，帧 5）。</li>
<li>让沉淀物干燥，然后从 R-5 分配一滴复溶缓冲液至蛋白质处。让缓冲液孵育 20 分钟，直至沉淀物完全溶解（图 2，帧 6）。</li>
<li>从 R-6 分配一滴还原剂，并与样品液滴合并。通过将合并后的液滴以环形路径驱动经过 6 个电极进行混合。将液滴在加湿腔室中室温孵育 1 小时（图 3，帧 1-2）。</li>
<li>从 R-7 分配一滴烷基化试剂，并与样品液滴合并，随后进行混合（同步骤 4.5）。将液滴在加湿腔室中室温孵育 15 分钟，避光（图 3，帧 2-3）。</li>
<li>从 R-8 分配一滴胰蛋白酶，并与样品液滴合并，随后进行混合（同步骤 4.5）。将液滴在加热板上的加湿腔室中 37°C 孵育 3 小时（图 3，帧 3-4）。</li>
</ol>
第5部分：样品后处理制备
<ol>
<li>移除上层底物，并通过加入 0.6 mL 含 2.5% 三氟乙酸的水溶液终止消化反应。</li>
<li>按照生产商说明书，使用 C18 ZipTips（Millipore, Billerica, MA）纯化终止反应后的产物。</li>
<li>用去离子水将纯化后的样品稀释至终体积为 100 mL。</li>
</ol>
第6部分：质谱分析
<ol>
<li>使用与串联质谱仪联用的纳米高效液相色谱（nano-HPLC）对处理后的样品进行分析。本实验所用的HPLC系统来自Eksigent Technologies，配备捕获柱（3 mm直径C18填料，150 μm内径 × 2.5 cm）和反相分离柱（3 μm直径C18填料，75 μm内径 × 15 cm）。所用质谱仪为Thermo-Fisher Scientific公司的LTQ型号。</li>
<li>在流动相为含5%乙腈的水溶液条件下，以5 μL/min的流速将2 μL样品加载至捕获柱。随后在反相分离柱上以0.5 μL/min的流速进行洗脱，采用线性梯度从20%乙腈升至80%乙腈，历时25分钟。之后继续以80%乙腈运行10分钟。</li>
<li>通过串联质谱法分析从色谱柱洗脱出的组分。在本研究中，洗脱液通过NewObjective公司的纳米电喷雾电离源（内径20 μm，锥形末端内径10 μm）引入质谱仪进行检测。</li>
<li>使用数据库搜索程序（如SEQUEST）鉴定样品中的蛋白质。本研究中采用整合于Bioworks v3.01（Thermo-Fisher Scientific）中的SEQUEST版本进行分析，所鉴定的蛋白质概率评分低于1.0E-03（相当于99.9%置信区间），且序列覆盖率至少达到30%（图4）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" alt="数字微流控平台与针式连接器；芯片实验室研究的电子电路图。" data-altupdatedat="1787630408000"> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" alt="血清样本经试剂处理用于蛋白酶消化分析的微流控示意图" data-altupdatedat="1787630408000"> 图1. (a) 与40针连接器连接的数字微流控（DMF）装置照片，用于自动液滴操控。(b) 装置示意图，展示蛋白质组学前处理所需的样本与试剂位置布局。
<img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" alt="蛋白质沉淀过程示意图；微图案装置；步骤：沉淀剂、合并、洗涤、重新溶解。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图2. 视频帧显示在20%三氯乙酸（沉淀剂）和70/30%氯仿/乙腈（洗涤液）中自动提取和纯化牛血清白蛋白（BSA）的过程。在第6帧中，沉淀的蛋白质重新溶解于100 mM碳酸氢铵液滴中。
<img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" alt="微流控芯片中的蛋白质处理流程：还原、烷基化、消化序列示意图。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图3. 视频帧展示重新溶解的蛋白质液滴依次进行还原、烷基化和消化的过程。本图中，试剂被染料着色以增强可视性；实际操作中，试剂未着色。
<img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" alt="色谱-质谱分析结果；显示相对丰度与时间关系的图谱。" data-altupdatedat="1787630408000"> 图4. 通过数字微流控技术处理的牛血清白蛋白样品的质谱色谱图。共鉴定出25种不同的肽段（置信区间为99.9%），对应序列覆盖率为44%。

<ol><li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+Revolution%3A+A+New+Paradigm+for+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mat%22%5BJournal%5D)">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li>
<li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li>
<li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li>
</ol>

蛋白质组学领域面临的一个主要局限是缺乏标准化的样品处理和加工流程。此外，传统的宏观尺度样品操作涉及多个容器和溶液转移步骤，可能导致样品损失和污染。解决这些问题的一个潜在方案是采用基于数字微流控技术1（DMF）的集成化样品处理系统。在先前的研究中，已证明DMF可用于高效去除含有蛋白质的异质溶液中的不需要的污染物2。同样，DMF也被证实能够与多步液相处理过程（包括还原、烷基化和酶解）集成于单一设备中3。本文中，我们展示了一种完全集成的系统，该系统通过自动化液滴控制实现沉淀法蛋白质提取，随后进行液相处理。我们推测，如果此类方法被广泛采用，蛋白质组样品处理中固有的人为主观误差将可被大幅消除，从而获得更高重复性的分析结果。简而言之，我们认为DMF具有广泛适用于多种应用的潜力，因为其操作条件可在全球任何实验室中被精确复制。

用于自动化蛋白质组学处理的数字微流控技术

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

临床蛋白质组学已发展成为一个重要的新兴学科，有望发现可用于疾病早期诊断和预后的生物标志物。尽管临床蛋白质组学方法多种多样，但其共同特征是需要（i）从高度异质性的体液（如血清、全血等）中提取蛋白质，以及（ii）在分析前进行广泛的生化处理。本文报道了一种基于数字微流控（DMF）的新方法，整合了临床蛋白质组学中常用的多个处理步骤，包括蛋白质提取、再溶解、还原、烷基化和酶解消化。数字微流控是一种微尺度液体操控技术，可在开放表面上操控纳升至微升级别的液滴。液滴位于由介电层包覆的电极阵列上方；当对液滴施加电压时，介电层两侧会积累电荷。这些电荷作为静电“手柄”，可用于控制液滴的位置；通过依次偏置一系列电极，可实现液滴在表面上的分配、移动、合并、混合和分裂。因此，DMF 非常适合执行快速、连续、多步骤、微型化的自动化生化分析。该技术相较于依赖手动移液或机器人系统的传统方法具有显著进步，有望成为临床蛋白质组学中一种有用的新工具。
Mais J. Jebrail、Vivienne N. Luk 和 Steve C. C. Shih 对本研究的贡献相同。
Sergio L. S. Freire 的现地址为宾夕法尼亚州费城南 43 街 600 号费城科学大学，邮编 19104。

数字微流控技术是一种通过施加电场，在电极阵列上操控离散液滴（约纳升至毫升级）的方法。该技术非常适合进行快速、连续、微型化的自动化生化分析。本文报道了一种能够自动化完成多个蛋白质组学处理步骤的平台。

临床蛋白质组学已发展成为一个重要的新兴学科，有望发现可用于早期诊断的生物标志物……

临床蛋白质组学是一门重要的新兴学科，有望发现可用于疾病早期诊断和预后的生物标志物。本文报道一种新的数字微流控（DMF）方法，该方法整合了临床蛋白质组学中常用的多个处理步骤，包括蛋白质提取、再溶解、还原、烷基化以及酶解消化。DMF利用位于电极阵列上的离散微液滴来处理样品蛋白，可在室温下运行，实现样品的并行自动化分析。该方法相较于传统方法具有显著进步，有望成为临床蛋白质组学中一种有用的新工具。大家好，我是来自多伦多大学化学系及生物材料与生物医学工程研究所Wheeler教授实验室的Steve Sche。大家好，我是多伦多大学Wheeler实验室的Gabriel。我是Vivian Luke，同样来自多伦多大学的Wearer实验室。我是Erin Wheeler。我有幸与Steve Mace和Vivian共事。今天，我们将向您展示一种使用数字微流控技术进行蛋白质组学处理的实验方法。我们在实验室中采用该方法来研究蛋白质和生物样本。现在，让我们开始吧。在通风橱中开始实验操作，使用 piranha 溶液清洗玻璃基底。在穿戴适当防护装备的情况下，piranha 溶液由三份浓硫酸与一份30%过氧化氢组成。因此，操作时应格外小心。将玻璃基底在piranha溶液中孵育10分钟，清洗后用去离子水或纯水冲洗，并用氮气吹干。将基底放入电子束蒸发镀膜腔中，沉积铬层至厚度为250纳米。达到该厚度后，将基底从腔体中取出，用异丙醇冲洗，然后在115摄氏度的热板上干燥五分钟。通过旋涂30秒，使用六甲基二硅氮烷（HMDS）对干燥的基底进行预处理。随后以相同的参数，使用Shipley S1811光刻胶在3000 RPM转速下再次旋涂。将基底直接置于加热板上，在100摄氏度下预烘数分钟。然后通过光掩模对光刻胶进行紫外光（UV）照射曝光，持续五秒。接着，将经紫外光曝光的基底浸入Shipley MF 321显影液中显影，时间三分钟，显影液量需足以完全浸没基底。用去离子水冲洗基底。将基底直接置于加热板上，在 100 °C 下烘烤 1 分钟。将基底浸入足量的铬刻蚀液中 30 秒，以完全覆盖暴露的铬层，进行刻蚀。用去离子水冲洗基底，并将其浸入足量的Z 300 T剥离液中，确保基底完全浸没，持续10分钟，以去除残留的光刻胶。随后用去离子水冲洗，并用氮气吹干。在此沉积之后，通过化学气相沉积在基底上沉积2至5微米的Paraline C绝缘聚合物，再通过旋涂法在基底上涂覆溶液，以沉积50纳米的聚四氟乙烯AF，使表面具有疏水性。溶液为1%（质量分数）的Fluorinert FC 40，旋涂条件为2000 RPM，持续60秒。使用未经处理的氧化铟锡（ITO）玻璃基板重复上述步骤，以制备顶部电极板。将两块基板置于加热板上，在 160 摄氏度下烘烤 10 分钟，以完成数字微流控装置的制备。使用手术刀刮除底部基板接触焊盘上的聚合物涂层。将底部基板暴露的焊盘与40针连接器耦合，并启动运行LabVIEW的计算机。我们使用一个自制的控制箱，其中包含由DPAD控制信号的继电器。计算机控制箱通过40针连接器，使用户能够控制向装置施加每18千赫兹100伏均方根电压的信号。同时打开函数发生器和放大器电源。通过在底部基板边缘放置两层总厚度为140微米的双面胶带，组装该装置。用移液器将四微升去离子水加入其中一个储液池中，并将未图案化的氧化铟锡载玻片放置在装置顶部，使特氟龙涂层面向下，从而封闭装置。将接地连接器连接到顶板电路。使用实验室开发的LabVIEW初始化程序进行校准以实现反馈控制，此时装置已准备好进行实验。在本实验方案中，我们将使用牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质样品，以演示数字微流控芯片的设计与使用方法。BSA 使用工作缓冲液（WB）稀释，该缓冲液由 100 毫摩尔/升 Tris-HCl（pH 7.8）和 0.08%（重量/体积）的吐温 F127 组成。每种样品和试剂溶液各配制 1 毫升，并标记其将被加入的储液区。完成试剂配制后，取下装置的顶板，将四微升溶液用移液器加入指定的储液池中。填充完所有储液池后，将顶板重新安装到装置上。使用实验室内部的查看程序执行以下步骤。请注意，计算机界面允许用户从储液池中分配约600纳升的液滴，并在电极阵列上操控这些液滴。首先，从R1中分配一滴含有蛋白质的样品，再从R2中分配一滴沉淀剂。将这两滴液滴合并，并让合并后的液滴孵育五分钟，使蛋白质沉淀到表面。将上清液从沉淀的蛋白质处移至废液储槽。为洗涤沉淀的蛋白质，从 R 四中加入三滴洗涤缓冲液，使其流经沉淀的蛋白质并进入废液储槽。让沉淀物干燥，然后从 R 五中加入一滴重悬缓冲液至蛋白质上。让缓冲液孵育20分钟，直至沉淀完全溶解。接着，从R六中加入一滴还原剂，并与样品液滴合并。通过在六个电极上以环形模式驱动液滴，混合合并后的液滴。将液滴在室温下孵育1小时。从R7中加入一滴烷基化试剂，并与样品液滴合并，随后混匀。将液滴避光，在室温下孵育15分钟。最后，从 R8 处加入一滴胰蛋白酶，并与样品液滴合并，随后混匀。将液滴置于培养皿中，在加热板上 37 摄氏度孵育 3 小时。反应结束时，取下上层板，用移液枪吸取终止消化反应。将0.6毫升2.5%的三氯乙酸水溶液加入反应液滴中。通过从底部板直接虹吸样品液滴来纯化淬灭后的反应产物。按照生产商说明书，使用C18齐普尖（zip tip），现在可根据需要稀释样品，并通过质谱分析以鉴定该系统中样品所含蛋白质。随后通过质谱鉴定蛋白质，其概率得分低于1×10⁻³，相当于99.9%的置信区间，且序列覆盖度至少达到30%。因此，数字微流控技术（DMF）是一种用于自动化蛋白质组学样品处理的非常有效的方法。我们今天展示的是如何利用数字微流控技术以自动化方式提取和处理蛋白质。该方法为蛋白质分离与鉴定过程中可能出现的样品损失和污染问题提供了潜在解决方案。我们希望将来能把这种方法应用于其他生物学领域，包括免疫测定和基于细胞的检测。进行此类实验时，最重要的是要记得享受实验过程。就此结束。感谢观看，祝您的实验顺利。

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