数字微流体进行自动蛋白质组学处理

临床蛋白质组学是一门重要的新学科，有望发现有助于疾病早期诊断和预后的生物标志物。在这里，我们报道了一种新的数字微流体或 DMF 方法，该方法集成了临床蛋白质组学中使用的多个加工步骤，包括蛋白质提取、再增溶还原、烷基化和酶消化。DMF 在电极阵列上使用样品蛋白质的离散微滴，并且可以在室温下运行，从而允许对样品进行平行自动分析。

这种方法代表了传统方法的重大进步，并有可能成为临床蛋白质组学中有用的新工具。大家好，我是多伦多大学化学系和生物材料与生物医学工程研究所实验室教授 Erin Wheeler 的 Steve Sche。嗨，我是来自多伦多大学 Wheeler 实验室的 Gabriel。

我是 Vivian Luke，也来自多伦多大学的 Wearer 实验室。我是 Erin Wheeler。我很幸运能与 Steve Mace 和 Vivian 合作。

今天，我们将向您展示使用数字微流体进行蛋白质组学处理的程序。我们在实验室中使用该程序来研究蛋白质和生物样品。那么让我们开始吧。

通过在 Piranha 溶液中清洁玻璃基板，在通风橱中开始该程序。在佩戴足够的保护装置时，食人鱼溶液由三比一的浓硫酸与 30% 过氧化氢组成。因此，在使用它时应小心。

将玻璃基板在食人鱼中孵育 10 分钟，清洁后，冲洗并去离子或去水，然后用氮气干燥基板。将衬底放入电子束蒸发室内，使铬沉积至 250 纳米的厚度。达到此厚度后，从腔室中取出基材，用异丙醇冲洗，然后在 115 摄氏度的热板上干燥 5 分钟。

在 30 秒内通过旋涂用六甲基甲苯噻嗪或 HMDS 灌注干燥的基材。3000 RPM 旋转代码再次带有 Shipley S 1811 照片。抵制使用相同的参数。

将基材直接在热板上以 100 摄氏度预烤。然后通过光掩模暴露在紫外线或紫外线照射下 5 秒钟来塑造光刻胶图案。接下来，在 Shipley MF 3 21 显影剂中显影 UV 暴露的底物足以将底物浸没三分钟。

在 DI 水柱中冲洗基材。直接在 100 摄氏度的热板上烘烤一分钟。通过将基板浸入刚好足以完全覆盖它们的铬蚀刻中 30 秒来蚀刻暴露的铬。

用去离子水冲洗基材，然后浸入 Z 300 T 剥离剂中，足以将基材浸入水中 10 分钟。去除剩余的光刻胶。用去离子水冲洗，用氮气干燥。

在此沉积之后，通过化学气相沉积将 2 到 5 微米的 Paraline C.An 绝缘聚合物沉积到基材上，沉积 50 纳米的特氟龙 AF，通过旋涂溶液使表面疏水。1% 菌群神经 FC 40 中每砝码的重量为 2000%，持续 60 秒。到基材上。

使用未通过的氧化铟锡或 ITO 玻璃基板重复此作，以创建顶板柱。在 160 摄氏度的热板上烘烤两种基板。10 分钟设置数字微流体设备。

用手术刀刮擦，从底部基材的接触垫上去除聚合物涂层。将底部基板的裸露焊盘与 40 针连接器耦合，为运行 lab view 的计算机供电。我们使用一个自制的控制箱，其中包含由 dpad 控制的信号的继电器。

计算机控制盒便于用户控制通过 40 针连接器向设备施加每 18 kHz 100 伏 RMS 信号。同时打开函数发生器和放大器的电源。通过在底部基板的边缘放置两块总厚度为 140 微米的双面胶带来组装设备。

4 微升去离子水移液到其中一个储液器中，然后将无图案的氧化铟锡载玻片放在设备顶部，使特氟龙涂层面朝下，从而封闭设备。将接地连接器连接到顶板走线。实验室在实验室视图中创建了初始化程序，用于校准反馈控制设备现在已准备好进行实验。

在该协议中，我们将使用牛血清白蛋白或 BSA 作为蛋白质样品来演示我们的数字微流体设计和使用。BSA 在工作缓冲液或 WB 中稀释，该缓冲液由 100 毫摩尔 tris HCL pH 7.8 制成，每体积重量为 0.08%onic F1 27。每种样品和试剂溶液制备 1 毫升，并注明将添加的储液槽。

试剂制备后，从装置中取出顶板，将 4 微升溶液移液到其指定的储液槽中。填充储液槽后，将顶板装回设备上。使用内部实验室视图程序执行以下步骤。

请记住，计算机界面允许用户从储液槽中分配大约 600 纳升液滴，并纵电极阵列上的液滴。首先，从 R 1 分配一滴含有蛋白质样品的样品，从 R 2 分配一滴沉淀剂。合并两个液滴，让合并的液滴孵育 5 分钟，使蛋白质沉淀到表面。

将上清液从沉淀的蛋白质驱动到废液库。R 3，为了洗涤沉淀的蛋白质，从 R 4 中分配三滴洗涤缓冲液，并驱使它们穿过沉淀的蛋白质并进入废液储存器。让沉淀物干燥，并从 R 5 中分配一滴再溶解缓冲液到蛋白质上。

让缓冲液孵育 20 分钟，直到沉淀物溶解。接下来，从 R six 中分配一滴还原剂，并将其与样品液滴合并。通过以圆形模式将组合的液滴驱动到六个电极上来混合混合。

让液滴在室温下孵育 1 小时。从 R 7 分配一滴烷基化剂，并将其与样品液滴混合，然后混合。让液滴在室温下避光孵育 15 分钟。

最后，从 R 8 中分配一滴胰蛋白酶，并将其与样品液滴混合，然后混合。让液滴在 37 摄氏度的培养皿中，在热板上的培养皿中孵育 3 小时。要结束反应，请取下顶板并通过移液淬灭消化。

将 6 毫升 2.5% 三氯乙酸的水中点到反应液滴上。通过直接从底板吸取样品液滴来纯化淬灭的反应产物。根据制造商的说明，使用 C 18 拉链尖端，现在可以根据需要稀释样品并通过质谱进行评估，以鉴定样品中的蛋白质使用该系统。

其次是质谱蛋白质的鉴定，其概率分数小于 E 的 1 倍 E 到负 3，相当于 99.9% 的置信区间和至少 30% 的序列覆盖率因此，DMF 是一种非常有用的自动化蛋白质组学样品处理方法。因此，我们今天刚刚展示了我们如何利用数字微流体以自动化方式提取和加工蛋白质。该方法为蛋白质分离和鉴定过程中的样品损失和污染提供了一种潜在的解决方案。

我们希望将来将这种方法应用于其他生物应用，包括免疫测定和基于细胞的测定。在做这种类型的实验时，最重要的是记住要享受它。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。