用于自动化蛋白质组学处理的数字微流控技术

临床蛋白质组学是一门重要的新兴学科，有望发现可用于疾病早期诊断和预后的生物标志物。本文报道一种新的数字微流控（DMF）方法，该方法整合了临床蛋白质组学中常用的多个处理步骤，包括蛋白质提取、再溶解、还原、烷基化以及酶解消化。DMF利用位于电极阵列上的离散微液滴来处理样品蛋白，可在室温下运行，实现样品的并行自动化分析。

该方法相较于传统方法具有显著进步，有望成为临床蛋白质组学中一种有用的新工具。大家好，我是来自多伦多大学化学系及生物材料与生物医学工程研究所Wheeler教授实验室的Steve Sche。大家好，我是多伦多大学Wheeler实验室的Gabriel。

我是Vivian Luke，同样来自多伦多大学的Wearer实验室。我是Erin Wheeler。我有幸与Steve Mace和Vivian共事。

今天，我们将向您展示一种使用数字微流控技术进行蛋白质组学处理的实验方法。我们在实验室中采用该方法来研究蛋白质和生物样本。现在，让我们开始吧。

在通风橱中开始实验操作，使用 piranha 溶液清洗玻璃基底。在穿戴适当防护装备的情况下，piranha 溶液由三份浓硫酸与一份30%过氧化氢组成。因此，操作时应格外小心。

将玻璃基底在piranha溶液中孵育10分钟，清洗后用去离子水或纯水冲洗，并用氮气吹干。将基底放入电子束蒸发镀膜腔中，沉积铬层至厚度为250纳米。达到该厚度后，将基底从腔体中取出，用异丙醇冲洗，然后在115摄氏度的热板上干燥五分钟。

通过旋涂30秒，使用六甲基二硅氮烷（HMDS）对干燥的基底进行预处理。随后以相同的参数，使用Shipley S1811光刻胶在3000 RPM转速下再次旋涂。

将基底直接置于加热板上，在100摄氏度下预烘数分钟。然后通过光掩模对光刻胶进行紫外光（UV）照射曝光，持续五秒。接着，将经紫外光曝光的基底浸入Shipley MF 321显影液中显影，时间三分钟，显影液量需足以完全浸没基底。

用去离子水冲洗基底。将基底直接置于加热板上，在 100 °C 下烘烤 1 分钟。将基底浸入足量的铬刻蚀液中 30 秒，以完全覆盖暴露的铬层，进行刻蚀。

用去离子水冲洗基底，并将其浸入足量的Z 300 T剥离液中，确保基底完全浸没，持续10分钟，以去除残留的光刻胶。随后用去离子水冲洗，并用氮气吹干。

在此沉积之后，通过化学气相沉积在基底上沉积2至5微米的Paraline C绝缘聚合物，再通过旋涂法在基底上涂覆溶液，以沉积50纳米的聚四氟乙烯AF，使表面具有疏水性。溶液为1%（质量分数）的Fluorinert FC 40，旋涂条件为2000 RPM，持续60秒。

使用未经处理的氧化铟锡（ITO）玻璃基板重复上述步骤，以制备顶部电极板。将两块基板置于加热板上，在 160 摄氏度下烘烤 10 分钟，以完成数字微流控装置的制备。

使用手术刀刮除底部基板接触焊盘上的聚合物涂层。将底部基板暴露的焊盘与40针连接器耦合，并启动运行LabVIEW的计算机。我们使用一个自制的控制箱，其中包含由DPAD控制信号的继电器。

计算机控制箱通过40针连接器，使用户能够控制向装置施加每18千赫兹100伏均方根电压的信号。同时打开函数发生器和放大器电源。通过在底部基板边缘放置两层总厚度为140微米的双面胶带，组装该装置。

用移液器将四微升去离子水加入其中一个储液池中，并将未图案化的氧化铟锡载玻片放置在装置顶部，使特氟龙涂层面向下，从而封闭装置。将接地连接器连接到顶板电路。使用实验室开发的LabVIEW初始化程序进行校准以实现反馈控制，此时装置已准备好进行实验。

在本实验方案中，我们将使用牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质样品，以演示数字微流控芯片的设计与使用方法。BSA 使用工作缓冲液（WB）稀释，该缓冲液由 100 毫摩尔/升 Tris-HCl（pH 7.8）和 0.08%（重量/体积）的吐温 F127 组成。每种样品和试剂溶液各配制 1 毫升，并标记其将被加入的储液区。

完成试剂配制后，取下装置的顶板，将四微升溶液用移液器加入指定的储液池中。填充完所有储液池后，将顶板重新安装到装置上。使用实验室内部的查看程序执行以下步骤。

请注意，计算机界面允许用户从储液池中分配约600纳升的液滴，并在电极阵列上操控这些液滴。首先，从R1中分配一滴含有蛋白质的样品，再从R2中分配一滴沉淀剂。将这两滴液滴合并，并让合并后的液滴孵育五分钟，使蛋白质沉淀到表面。

将上清液从沉淀的蛋白质处移至废液储槽。为洗涤沉淀的蛋白质，从 R 四中加入三滴洗涤缓冲液，使其流经沉淀的蛋白质并进入废液储槽。让沉淀物干燥，然后从 R 五中加入一滴重悬缓冲液至蛋白质上。

让缓冲液孵育20分钟，直至沉淀完全溶解。接着，从R六中加入一滴还原剂，并与样品液滴合并。通过在六个电极上以环形模式驱动液滴，混合合并后的液滴。

将液滴在室温下孵育1小时。从R7中加入一滴烷基化试剂，并与样品液滴合并，随后混匀。将液滴避光，在室温下孵育15分钟。

最后，从 R8 处加入一滴胰蛋白酶，并与样品液滴合并，随后混匀。将液滴置于培养皿中，在加热板上 37 摄氏度孵育 3 小时。反应结束时，取下上层板，用移液枪吸取终止消化反应。

将0.6毫升2.5%的三氯乙酸水溶液加入反应液滴中。通过从底部板直接虹吸样品液滴来纯化淬灭后的反应产物。按照生产商说明书，使用C18齐普尖（zip tip），现在可根据需要稀释样品，并通过质谱分析以鉴定该系统中样品所含蛋白质。

随后通过质谱鉴定蛋白质，其概率得分低于1×10⁻³，相当于99.9%的置信区间，且序列覆盖度至少达到30%。因此，数字微流控技术（DMF）是一种用于自动化蛋白质组学样品处理的非常有效的方法。我们今天展示的是如何利用数字微流控技术以自动化方式提取和处理蛋白质。该方法为蛋白质分离与鉴定过程中可能出现的样品损失和污染问题提供了潜在解决方案。

我们希望将来能把这种方法应用于其他生物学领域，包括免疫测定和基于细胞的检测。进行此类实验时，最重要的是要记得享受实验过程。就此结束。

感谢观看，祝您的实验顺利。