使用 Tomoauto：高通量自动化冷冻电子断层成像实验方案

本实验方案的总体目标是帮助用户建立一个高通量的冷冻电子断层成像样品采集与处理流程。该方法可解决冷冻电子断层成像领域中的一些关键问题，例如：如何处理使用新一代探测器采集的数据，以及如何高效处理自动化倾转系列采集软件产生的大量数据？该技术的主要优势在于，用户能够以统一的方式配置多个软件包，从而建立高效的自动化倾转系列数据处理流程，使研究人员能够将更多时间用于断层图的分析工作。

通常，刚接触冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的研究人员会面临困难，因为需要处理电子显微镜产生的大量数据，且涉及许多繁琐的步骤。五年前，我们首次萌生了开发此技术的想法，当时为了获得一个细菌的三维重建结构，不得不手动完成数百个步骤。请提前查阅关于制备志贺氏 flexneri 微细胞的文本实验方案。

然后，按照已有的 JoVE 文章所述方法，并结合文本方案中的说明，制备透射电子显微镜载网。将含有玻璃态冰中包埋的微细胞样品的载网装入电镜样品台后，开始采集用于倾转系列的低倍率图像图谱。在低倍率（约 2300×）下观察荧光屏时，寻找适合成像的载网方格区域。

该位置应含有薄冰，且目标区域无任何污染物。接下来，将视野调整至网格中央，点击“添加载物台位置”按钮以保存该位置。随后，重复此过程，直至所有符合条件的网格位置均已保存。

下一步从打开一个新的拼接文件开始。在设置对话框中，调整 X 和 Y 参数，以确保捕获整个网格方格。对于标准的 200 目网格，设置为 10×10 的区域，并使用较高的 binning 值（例如 8）。

同时切换移动载物台而非移动图像的选项，以及跳过用于对齐图像片段的相关性计算选项。现在，在导航器窗口中，使用“采集”切换按钮选择要采集的第一个载物台位置。对每个载物台位置继续执行此操作。

接下来，在“导航器”菜单下，点击“在点位获取”。在打开的对话框中，勾选“获取地图图像”和“粗略对中”选项，取消勾选所有其他选项。

然后，单击继续，将为每个阶段位置生成一个拼接图像。继续使用 SerialEM 软件。在导航器中，选择已获取的地图，然后单击加载地图。

然后，单击“添加点”，并在地图上选择应采集倾转系列的位置。完成选择后，单击“停止添加点”，并对每张采集的地图重复此过程。接下来，打开“相机”菜单下的参数，设置聚焦、试拍和记录模式。

记录分剂量数据的选项可能具有特殊意义，该选项可在“记录选项”下进行设置。要继续操作，请在当前查看的地图中选择一个点，然后在“导航器”窗口中切换倾斜系列选项。在打开的对话框中，选择倾斜系列的参数。

然后，对地图中选定的每个点重复切换倾转系列选项的操作。接下来，在导航器中启动“在点处采集”选项。在对话框中，依次启用初步任务、重新对齐至目标、自动对焦以及粗略齐焦功能。

然后，将主任务设置为采集倾转系列图像，并选择在所有点采集完成后关闭透射电镜的光阑。当执行该流程时，系统将在每个地图中已启用倾转系列采集的每个点上采集倾转系列图像。在当前工作目录中包含原始倾转系列图像、SerialEM 输出的日志文件以及各剂量分帧图像的情况下，在终端中执行以下命令以去除束流诱导的运动伪影。

继续进行倾转系列图像的配准与重构。在终端中输入 tomoauto 命令，具体格式如下：在命令后附加待处理倾转系列图像的文件名，随后输入标记物直径（单位为纳米）。

如果不需要进行 CTF 处理，只需在命令中省略该选项即可。此命令是 tomoauto 的主要用途，允许用户通过单条命令执行对倾转系列图像进行对齐所需的全部流程，而这些流程原本需要手动干预，从而使得用户能够快速编写批量处理脚本。现在，使用 3dmod 命令，仔细检查对齐后的倾转系列图像是否存在明显错误。

此处 filename 为无后缀的倾斜系列文件名。然后，使用此处显示的命令检查估计的 CTF。同样，filename 为无后缀的倾斜系列文件名。

此外，在 tomoauto 命令生成的输出日志中，检查对齐的残差误差。这是对对齐整体质量的定量衡量。如果对齐结果可接受，则继续进行重建计算。

该命令用于校正CTF，并从倾斜系列图像中去除用于对齐的标记点。若要跳过视觉检查而直接进行重构，请使用此命令。tomoauto 具有多种可访问的选项。

其中一个功能是根据 tomoauto 文档，能够通过辅助文件包含本地配置。在命令行对话框中，使用本地配置选项，于附加倾转系列文件名之前，包含该文件的名称。创建本地配置文件的功能是 tomoauto 最强大的特性，允许用户完全配置所使用的所有命令，针对特定或复杂的数据集调整执行过程，同时保持自动化处理的优势。

在测试协议中，还包含有关如何执行子断层平均化的附加说明。根据所述协议，使用tomoauto生成了两个对齐的倾斜系列。精细对齐是基于一个理想情况下定义了标记物坐标的模型计算得出的。

在50度时，一个倾转系列能正确追踪金颗粒，表明其配准效果可接受。而第二个倾转系列中，多个显示为红色的模型点偏离了对应的金标记物，说明该模型未能实现合适的配准。在倾转系列采集过程中，tomoauto能够成功配准所采集倾转系列的80%至90%。

重建完成后，最终的断层图像即为样品的三维图像数据。随后可利用该数据通过分割进行细胞结构标注，或进行子断层平均化以获得样品内分子机器的更高分辨率信息。EMDB 中收录的附着态志贺氏菌（Shigella flexneri）的 2.7 纳米子断层平均图显示，相较于在单个断层图中观察分泌装置，该技术具有显著提升。

观看本视频后，您应能够充分理解如何使用 SerialEM 和 tomoauto 以自动化、高通量的方式采集和处理冷冻电子断层扫描数据。一旦掌握该技术，若操作得当，每天可采集近 100 个倾转系列，并在 20 分钟内完成一个倾转系列的对齐。在执行该流程时，务必始终检查倾转系列对齐的质量。

如果一组倾斜系列图像无法良好对齐，可尝试手动对齐，并将参数传递到本地配置中。完成此步骤后，可进一步采用其他方法（如亚断层平均化）来回答更多科学问题，例如确定大分子复合物的高分辨率结构。该技术发展之后，为冷冻电镜领域的研究人员探索细菌、病毒及其他生物体中原位高分辨率结构开辟了道路。