Name: 使用Tomoauto:一个协议，用于高通量自动化低温电子断层扫描 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 学习高通量自动化冷冻电子断层扫描技术，用于原位分子机器高分辨率结构研究。该方法整合多软件包实现自动化倾斜序列处理，简化繁琐步骤，使研究人员能专注于生物学问题分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 William Margolin 博士的评论意见。感谢 David Mastronarde 博士和 Chen Xu 博士在 SerialEM 方面提供的支持。D.M.、B.H. 和 J.L. 的研究得到了美国国家过敏与传染病研究所资助项目 R01AI087946、美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助项目 R01GM110243 和 R01GM107629，以及 Welch 基金会资助项目 AU-1714 的支持。直接电子探测器由美国国立卫生研究院资助项目 S10OD016279 提供经费支持。

1. 微细胞制备
<ol>
	<li>为了制备 S. flexneri 微细胞，转化1 µl质粒pBS58，该质粒组成型表达 大肠杆菌 细胞分裂基因 ftsQ，ftsA 和 ftsZ 通过电穿孔法将低拷贝的链霉素抗性质粒转入5 µl电感受态的链霉素抗性5a血清型（M90T-Sm）细胞中，使用1 mm比色皿，2.5 kV电压，持续5毫秒。</li>
	<li>将微细胞样品加入15%甘油，于1.5 ml 冻存管中，-80 °C保存。使用时，用移液器吸头从未经解冻的冻存管中刮取约5 μl细胞，悬浮于4 ml含100 μg/ml链霉素的胰蛋白胨大豆肉汤中。37 °C过夜培养。</li>
	<li>将1.2中的2 ml培养物移入含100 μg/ml链霉素的200 ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37 °C培养至对数生长后期。</li>
	<li>为富集微细胞，将1.3步骤中200 ml培养液在1,000 × g离心5分钟。小心将上清液倒入新的离心管中，在20,000 × g离心10分钟。小心倾去并弃除上清液，用移液器吸头轻轻混匀沉淀物与残留液体，转移约100 μl沉淀混合物至1.5 ml微量离心管中。</li>
</ol>
2. 电镜载网制备
<ol>
	<li>将R2/2型有孔碳膜200目铜网碳膜面朝上置于玻璃载片上。 
	注意：选择 R2/2 200 目网格以最大化可在单个网格方格内设置采集的倾转系列数量，同时仍能有效支撑样品，并在目标放大倍数下使碳膜边缘位于相机视野范围内。对于在更高放大倍数下成像的样品，可使用更细密的网格和更小孔洞的碳膜，例如 R1.2/1.3 400 目；对于在较低放大倍数下成像的样品，或当显微照片中不应包含碳膜边缘时，可使用孔洞间距更大的碳膜，例如 R3.5/1 200 目；此外，若需辅助对齐载物台至目标区域，或在聚焦和追踪过程中保护特定区域免受过度曝光，可使用孔洞间距更大的 R1/4 200 目碳膜。</li>
	<li>将载玻片放置在辉光放电装置的平台上。 
	注意：我们使用一种自制装置，该装置将阳极和平台加工于真空干燥器内，并由高频发生器供电。创建真空后，将高频发生器探头连接至阳极，开启探头电源进行1分钟辉光放电处理载网。辉光放电所需时间可在数秒至一分钟之间调整。通过改变辉光放电时间，可用于诊断样品浓度过高或载网上无玻璃态冰、呈现干燥状态等问题。</li>
	<li>用镊子取下网格，并用橡皮筋将镊子锁紧。</li>
	<li>向1.4中制备的微细胞样品管中加入100 μl 10 nm胶体金溶液，并用手指轻弹管壁混匀。用新的移液枪吸取4 μl上述混合液，滴加到2.2中制备的载网上。 
	注意：胶体金有多种尺寸可供选择，在选择时需确保金颗粒的尺寸大于待处理显微照片在相应放大倍数下的5个像素大小，同时又不能过大而遮蔽感兴趣的结构特征。</li>
	<li>准备冷冻固定装置；将外层冷冻容器中装满液氮，然后向内层腔室中装入液态乙烷。将带有载网的镊子固定在冲杆上，并将冲杆锁定在抬起的位置。 
	注意：参见 Iancu 等20 用于描述商用 plunge-freeze 装置使用方法的实验方案。</li>
	<li>用滤纸轻轻接触样品液滴，进行吸水处理，直至网格与滤纸之间的弯月面分离且滤纸的毛细吸水停止，然后立即松开推杆，使网格迅速固定。小心将镊子从推杆上取下，并将网格放入网格盒中。</li>
	<li>通过向装载区域和吸收泵容器中加入液氮来准备冷冻电镜转移站。当装载区域达到液氮温度后，将网格支架和显微镜样品盒放入装载区域中。</li>
	<li>小心取下锁环，早期 Polara 显微镜上为小型螺纹锁环，后期型号则为 C 型卡扣环；用镊子将电镜载网放入卡盒中，然后轻轻将锁环重新安装回卡盒上，以固定载网。</li>
	<li>从显微镜上取下多标本架，并将其连接到转移站。使用卡盒镊子将标本卡盒放入标本架中，然后将标本架从装载区域移出，并将多标本架重新放回显微镜上。 
	注意：参见 Chen 等21 有关详细步骤2.1-2.9的可视化实验方案。</li>
</ol>
3. 高通量自动化倾斜系列图像采集
<ol>
	<li>低倍率图谱的采集
	<ol>
		<li>在 SerialEM10（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM）的“Navigator”菜单中点击“Open”，打开一个新的 Navigator 窗口</li>
		<li>在低倍率下（例如，对于微细胞样品约为 2,300X）使用荧光屏查找包含合适成像条件的网格区域（即&#160;冰层较薄、无污染、含有目标结构）。 
		注意：[可选：可通过 SerialEM 对整个网格进行拼接图采集以实现该步骤的自动化，但手动选择若干区域可能更快。]</li>
		<li>将样品台倾斜至 50°，然后调节 Z 轴高度，使样品在倾斜与未倾斜状态下的 X-Y 平移最小，从而将样品台调整至同心高度。</li>
		<li>移动至网格区域中心，在 Navigator 窗口中点击“Add Stage Pos”按钮，以保存当前的样品台位置。</li>
		<li>重复上述步骤 3.1.1–4，直至所有符合条件的网格区域位置均已保存。</li>
		<li>在“File”菜单中点击“New montage”，打开一个新的拼接图 MRC 文件。在弹出的“Montage Setup Dialog”中，选择 X 和 Y 方向上的图像块数量，以覆盖整个网格区域（例如&#160;标准 200 目网格可选 10 × 10）。使用较高的 binning 值（如 8），并选中“Move Stage Instead of Shifting Image”和“Skip correlations used to align pieces”单选按钮。</li>
		<li>在 Navigator 窗口中点击第一个样品台位置，并勾选“Acquire”复选框以设定其为待采集位置。对 Navigator 窗口中的每个位置重复此操作。</li>
		<li>在“Navigator”菜单中点击“Acquire at Points”，打开 Navigator 采集对话框。勾选“Acquire map image”和“Rough eucentricity”复选框，并确保其他所有复选框均未勾选。点击“Proceed”，在每个样品台位置采集一幅拼接图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>倾转系列图像的采集
	<ol>
		<li>在 Navigator 窗口中选择一幅已采集的图谱，点击“Load map”按钮。</li>
		<li>在 Navigator 窗口中点击“Add Points”按钮，在图谱上选择需要采集倾转系列图像的位置，然后点击“Stop Adding Points”按钮。对每幅采集的图谱重复此操作。</li>
		<li>在“Camera”菜单中选择“Parameters”，并为聚焦（Focus）、试拍（Trial）和记录（Record）模式设定相应参数。[可选：可在 Record 模式的参数中设定剂量分割数据采集。]</li>
		<li>在 Navigator 窗口中选择一个点，并勾选“Tilt-Series”复选框。在弹出的“Tilt-Series Setup”对话框中，设置所需的倾转系列采集参数。对 Navigator 窗口中其余选定的点重复此操作，但不要选择图谱本身。</li>
		<li>再次在“Navigator”菜单中选择“Acquire at Points”。在 Navigator 采集对话框中，选择“Realign to item”、“Autofocus”和“Rough eucentricity”作为初步任务，选择“Acquire tilt series”作为主要任务，并选择“Close column valves at end”，以便在所有点采集完成后关闭镜筒阀门。点击“Proceed”后，将在每幅图谱的每个选定位置采集倾转系列图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用 Tomoauto 进行高通量自动化倾斜系列数据处理与重构
<ol>
	<li>剂量分帧数据中电子束诱导运动的校正 [可选] 
	注意：Tomoauto 使用 MOTIONCORR22（http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html）去除剂量分帧显微照片中的电子束诱导运动。系统中必须已安装 NOTIONCORR16。
	<ol>
		<li>将原始倾转系列、SerialEM10 的输出日志以及各个剂量分帧图像均置于当前工作目录中，在终端执行以下命令： 
		          dose_fractioned_to_stack &#60;filename.st&#62; 
		&#60;filename.st&#62; 是待处理的倾转系列文件名。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>倾转系列的对齐与重构 
	注意：Tomoauto 默认使用 IMOD13（http://bio3d.colorado.edu/imod/）自动完成倾转系列的标志点模型生成、对齐、对比度传递函数（CTF）测定、CTF 校正23 及重构。用户也可选择在 tomoauto 中使用 RAPTOR24（包含于 IMOD 中）进行自动标志点模型生成，使用 CTFFIND425（http://grigoriefflab.janelia.org/ctf）测定 CTF，使用 tomo3d26（https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d）进行重构，或通过配置任意组合使用上述软件包。&#160; 此类配置以及各软件包中可用的参数均由一个全局配置文件管理，该文件可编辑以适应实验室中最常用的参数设置；同时也可以创建局部配置文件，用于指定特定样本、采集集或单个倾转系列所用的参数。所有拟使用的软件包必须预先安装在系统中。
	<ol>
		<li>将倾转系列置于当前工作目录中，在终端执行以下命令： 
		          tomoauto --CTF --mode=align &#60;filename.st&#62; &#60;fid_diam&#62; 
		&#60;filename.st&#62; 是待处理的倾转系列文件名，&#60;fid_diam&#62; 是标志点标记的直径（单位为纳米）。该命令将自动完成倾转系列的对齐及 CTF 估计。可通过移除命令中的 --CTF 选项跳过 CTF 处理步骤。</li>
		<li>目视检查对齐后的倾转系列，确认对齐过程中是否存在明显错误，并通过执行以下命令检查估计的 CTF： 
		          3dmod &#60;filename&#62;.ali 
		          submfg &#60;filename&#62;_ctfplotter.com 
		其中 &#60;filename&#62; 为不带后缀的倾转系列文件名。同时检查 tomoauto 命令的输出结果，查看对齐生成的平均残差误差，该数值是对齐质量的定量指标。</li>
		<li>若对齐结果可接受，则继续执行以下命令进行处理： 
		          tomoauto --CTF --mode=reconstruct &#60;filename.st&#62; &#60;fid_diam&#62; 
		参数替换方式与步骤 4.2.1 相同。该命令将完成 CTF 校正，从倾转系列中擦除标志点标记，并计算重构结果。同样，可如 4.2.1 所述跳过 CTF 处理。</li>
		<li>[可选] 若要跳过目视检查步骤，实现全流程自动化处理与重构，请执行以下命令： 
		          tomoauto --CTF &#60;filename.st&#62; &#60;fid_diam&#62;</li>
		<li>[可选] 若要使用特定的局部配置，请参考 tomoauto 文档了解如何生成局部配置文件，然后执行以下命令： 
		          tomoauto [options]-L &#60;local_config&#62; &#60;filename.st&#62; &#60;fid_diam&#62; 
		其中 &#60;local_config&#62; 为局部配置文件的名称。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 亚断层图平均化
注意：我们使用 i3 软件包15（http://www.electrontomography.org/）来处理亚断层平均化实验，但本文所述方案通常适用于大多数现有的亚断层平均化软件包16-18。
<ol>
	<li>在当前工作目录中打开重建的断层图，执行以下命令以进行颗粒挑选： 
	          tomopick &#60;filename&#62;.rec 
	其中 &#60;filename&#62; 含义同 4.2.2。在打开的窗口中，使用鼠标左键先点击基体，再点击针尖，以选择一个注射装置，并使用上下箭头键浏览断层图的各个切片。以这种方式选择所有可见的注射装置。此操作会将坐标存储在一个文本文件中，定义结构的长轴，并估计描述结构取向的三个欧拉角中的两个。</li>
	<li>通过执行以下命令，从断层图中以定义的长轴中点为中心，计算提取 4003 体素的立方体： 
	          clip resize -cx &#60;x&#62; -cy &#60;y&#62; -cz &#60;z&#62; -ix 400 -iy 400 -iz 400 \ 
	          &#60;filename&#62;.rec &#60;filename&#62;_001.mrc 
	其中 &#60;x&#62;、&#60;y&#62;、&#60;z&#62; 为结构的中点坐标，&#60;filename&#62; 含义同 4.2.2。所提取立方体的尺寸应根据结构和所用放大倍数进行调整，应足够大以充分包裹目标结构，本样品中为 4003 体素。</li>
	<li>将子断层图下采样（bin）四倍，以减少初始对齐的计算时间，执行以下命令： 
	          binvol -b 4 &#60;filename&#62;_001.mrc &#60;filename&#62;_001.bin4.mrc 
	其中 &#60;filename&#62; 含义同 5.2。</li>
	<li>将确定的欧拉角应用于子断层图，并计算全局平均值以生成初始模板，执行以下命令： 
	          I3totsum.sh</li>
	<li>使用细胞质区域的二值分类掩模对下采样的子断层图进行对齐和分类。在傅里叶空间中执行子断层图平均，以最小化断层扫描中典型的缺失楔形伪影。对于下采样 4 倍的数据，请使用 SAMPFACT=&#34;4 4 4&#34;。 
	          i3mramsacls.sh</li>
	<li>使用下采样两倍的子断层图（SAMPFACT=&#34;2 2 2&#34;）重复步骤 5.5，然后使用原始数据（SAMPFACT=&#34;1 1 1&#34;）再执行一次。 
	          i3mramsacls.sh</li>
</ol>

<ol><li>Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+III+secretion+injectisome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The type III secretion injectisome.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).</li>
<li>Galan, J. E., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+into+eukaryotic+cells+by+type+III+secretion+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines.</a> Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).</li>
<li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li>
<li>Schraidt, O., Marlovits, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+Salmonella%27s+needle+complex+at+subnanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of Salmonella's needle complex at subnanometer resolution.</a> Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).</li>
<li>Hodgkinson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+Shigella+T3SS+transmembrane+regions+reveals+12-fold+symmetry+and+novel+features+throughout%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).</li>
<li>Kudryashev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structural+analysis+of+the+Yersinia+enterocolitica+injectisome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome.</a> eLife. 2, e00792(2013).</li>
<li>Kawamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+and+distinct+structural+features+of+Salmonella+injectisome+and+flagellar+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body.</a> Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).</li>
<li>Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ-the+potential+of+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein+structure+at+8.5%C3%85+resolution+using+cryo-electron+tomography+and+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging.</a> J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+tomography%3A+an+integrated+software+suite+for+real-time+electron+microscopic+tomographic+data+collection%2C+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Winkler, H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+marker-free+alignment+with+simultaneous+geometry+determination+and+reconstruction+of+tilt-series+in+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).</li>
<li>Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+subvolume+alignment+and+classification+applied+to+myosin+V+and+SIV+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes.</a> J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).</li>
<li>Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Architecture+of+Axonemes+Revealed+by+Cryoelectron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography.</a> Science. 313 (5789), 944-948 (2006).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Hu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+type+III+secretion+sorting+platform+of+Shigella+flexneri%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).</li>
<li>Iancu, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Cryoelectrontomography+of+Bacterial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTF+determination+and+correction+for+low+dose+tomographic+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series.</a> J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).</li>
<li>Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).</li>
<li>Rouhou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomo3D+2.0+%E2%80%93+Exploitation+of+Advanced+Vector+eXtensions+%28AVX%29+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).</li>
<li>Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-Electron+Tomography+Reveals+the+Sequential+Assembly+of+Bacterial+Flagella+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).</li>
<li>Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacteriophage+T7+Virion+Undergoes+Extensive+Structural+Remodeling+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection.</a> Science. 339 (6119), 576-579 (2013).</li>
<li>Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W%3A+Molecular+architecture+of+chemoreceptor+arrays+revealed+by+cryoelectron+tomography+of+Escherichia+coli+minicells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此处描述的高通量方法使我们能够处理 1,917 套冷冻倾斜系列数据，并生成超过 4,500 个完整结构的子断层图 S. flexneri 注射装置19. 所收集的数据实现了对 原位 注射装置，包括细胞质分选复合物。该方法还被用于观察若干特定蛋白组分缺失的突变细胞，有助于阐明注射装置分选平台的组成。我们的方法为研究注射装置的结构与功能关系提供了新的途径。由此，为深入解析III型分泌系统介导的分泌机制及致病机理奠定了新的基础。
本文所述方案介绍了对完整的S. flexneri进行高通量冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的方法，但该方法同样适用于任何适合开展cryo-ET研究的项目。该方法已被用于Borrelia burgdorferi鞭毛马达的结构表征27、噬菌体T7感染E. coli微型细胞28，以及E. coli中趋化受体阵列的研究29。通过促进大规模数据集的获取，研究人...

III型分泌系统（T3SS）是多种革兰氏阴性病原菌的关键毒力决定因子。注射器装置，亦称作针状复合物，是T3SS的核心机器，负责将效应蛋白直接从细菌转运至真核宿主细胞内。1, 2注射装置包括一个胞外针状结构、一个基底体以及一个胞质复合物，后者也称为分选复合物。3先前的研究已阐明了从纯化的注射装置中获得的三维结构 沙门氏菌 和 志贺氏菌，以及主要基体蛋白的原子结构4, 5近期 原位 来自注射装置的结构 沙门氏菌, 志贺氏菌，以及 耶尔森菌 通过冷冻电子断层扫描技术揭示6, 7然而，那些结构中尚未观察到对效应蛋白筛选和针状结构组装至关重要的胞质复合物。
冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET）是在天然细胞环境中以纳米级分辨率对分子机器进行成像的最合适技术原位）。然而，冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）的可达到分辨率受限于样品厚度。为克服这一局限，我们对一种具有毒力的完整注射装置（injectisome）进行了成像 福氏志贺菌 一种经过基因改造以产生足够薄的微细胞用于冷冻电子断层扫描的菌株。冷冻电子断层扫描的另一局限性在于样品对电子束所诱导辐射的高度敏感性，这种辐射会迅速破坏样品中的高分辨率信息。因此，单个倾斜图像需使用极低剂量，以便将合适的总剂量分配至整个倾斜系列。这显著降低了最终重构图像的信噪比（SNR），使得难以从断层图大量的噪声中分辨出目标结构特征，并限制了冷冻电子断层扫描所能达到的分辨率。传统的图像处理方法，如傅里叶滤波和实空间滤波以及降采样，虽可提高对比度，但会以滤除大量高分辨率信息为代价。近年来，子断层图平均技术的引入显著提高了信噪比，使最终分辨率在某些情况下达到亚纳米水平。8, 9通过从原始断层图像中计算提取出包含感兴趣区域的数千个子断层图像，并对这些子断层图像进行对齐和平均，从而实现对复合物更详细的分析 原位 具有更高信噪比和更高分辨率的复杂结构。这些方法可与遗传学手段相结合，进一步揭示大分子复合物在天然细胞环境中的动态构象。
通常，为了在原位（in situ）解析高分辨率结构，需要对数万甚至数十万张子断层图进行平均。获取足够数量的倾转系列以生成如此大量的子断层图，很快会成为瓶颈。所获得的倾转系列常受到电子束诱导位移、样品台回程误差以及放大倍数、旋转和扭曲缺陷的影响，因此在重建之前必须解决这些问题，以实现倾转系列的对齐。通常通过追踪金标记物（fiducial markers）来对倾转系列进行对齐，而这些标记物传统上需通过人工检查倾转系列图像进行选择，这又造成了另一个瓶颈。目前已开发出许多软件包，用于通过计算机控制的电子显微镜实现倾转系列的自动采集10, 11, 12、倾转系列对齐与重建13, 14以及子断层图平均15-18。由于这些软件包仅处理冷冻电子断层扫描（cryo-ET）工作流程中的离散步骤，因此有必要在流程中构建更高层次的抽象，以系统性地将整个流程整合为单一的处理管线。为此，我们开发了一个名为 &#34;tomoauto&#34; 的软件封装库，旨在将多个现有软件整合为一个半自动化的统一系统，既允许用户简便操作，又能以集中化的方式完全配置每个组件。该库为开源软件，文档齐全，持续更新，并通过在线远程源代码仓库（http://github.com/DustinMorado/tomoauto）免费提供使用，支持定制开发或进一步集成。
这一高通量冷冻电子断层扫描流程已被用于可视化完整注射装置 S. flexneri 微细胞。采用该方法共生成了1,917张断层图像，揭示了高分辨率的结构细节 原位 通过亚断层图平均法确定的完整机器结构及其胞质分选平台19结合对野生型和突变型装置的分子建模，我们的高通量分析流程为在天然细胞环境中理解完整注射装置的结构与功能提供了新途径。

<table><tbody><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>壮观霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0692</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Bio-rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 电穿孔杯</td><td>BTX</td><td>45-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 冻存管</td><td>Thermoscientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>带孔碳支持膜载网</td><td>Quantifoil&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>Q2100CR2</td><td>R2/2 200 Cu</td></tr><tr><td>辉光放电装置</td><td>自制</td><td></td><td>有商用替代品</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016&amp;nbsp;</td><td>用于自制辉光放电装置</td></tr><tr><td>高频发生器</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-10A</td><td>用于自制辉光放电装置。&amp;nbsp; 警告：该设备产生高电压。</td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont&lt;br/&gt; (Electron Microscopy Sciences)</td><td>72705-D</td><td>5号型抗磁镊</td></tr><tr><td>胶体金</td><td>Aurion</td><td></td><td>BSA 10nm</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td></td><td>#2</td></tr><tr><td>乙烷&amp;nbsp;</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>冷冻固定压片装置</td><td>自制</td><td></td><td>有商用替代品</td></tr><tr><td>冷冻载网储存盒</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71166-30</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai Polara F30&lt;br/&gt; (300 KeV)</td></tr><tr><td>直接电子探测器相机</td><td>Gatan</td><td></td><td>K2 Summit</td></tr><tr><td>断层图像采集软件</td><td>SerialEM</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.eud/SerialEM 替代方案：UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography</td></tr><tr><td>电子束诱导运动校正软件</td><td>MOTIONCORR</td><td></td><td>http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html 需配备 &gt;2GB Nvidia GPU</td></tr><tr><td>倾斜系列图像对齐软件</td><td>IMOD</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/IMOD 替代方案：XMIPP, Protomo</td></tr><tr><td>自动标记物建模软件</td><td>IMOD</td><td></td><td>替代方案：RAPTOR (包含于 IMOD0&lt;br/&gt; (可在 tomoauto 中使用)</td></tr><tr><td>CTF 测定软件</td><td>IMOD</td><td></td><td>替代方案：CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf&lt;br/&gt; (可在 tomoauto 中使用)</td></tr><tr><td>倾斜系列图像重构软件</td><td>tomo3d</td><td></td><td>https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d 替代方案：IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo</td></tr><tr><td>倾斜系列图像自动化处理软件</td><td>tomoauto</td><td></td><td>https://github.com/DustinMorado/tomoauto</td></tr><tr><td>颗粒挑选软件</td><td>i3</td><td></td><td>http://www.electrontomography.org 替代方案：IMOD</td></tr><tr><td>子断层平均软件</td><td>i3</td><td></td><td>替代方案：PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org</td></tr></tbody></table>

使用 tomoauto：高通量自动化冷冻电子断层成像实验方案

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）是一种强大的三维（3-D）成像技术，可在分子水平上以天然状态可视化大分子复合物。该技术首先通过将样品快速冷冻在玻璃态冰中以保持其天然状态，随后在高倍率下从不同角度采集一系列显微图像，最后通过计算重建出三维密度图。由于冷冻水合样品对电子束极为敏感，因此需在极低电子剂量下采集显微图像，以减少辐射损伤。因此，原始的冷冻电子断层图信噪比极低，图像本身具有固有的噪声特征。为了更清晰地观察目标结构，通常采用传统的图像分析方法及子断层平均技术（sub-tomogram averaging），即从初始断层图中提取目标结构的子断层图，进行对齐并平均，以提高对比度和分辨率。大量倾斜系列数据集对于理解并解析不同状态、条件或突变下的复合物结构至关重要，同时也是获得足够数量子断层图用于平均和分类的基础。然而，这些数据的采集与处理可能成为进一步分析的主要障碍。本文介绍了一种高通量冷冻电子断层扫描实验方案，该方案基于计算机控制的300 kV冷冻透射电子显微镜、直接电子探测器（DDD）相机，以及本实验室开发的高效半自动化图像处理流程软件封装库 tomoauto。该方案已成功应用于可视化志贺氏痢疾杆菌（Shigella flexneri）微型细胞中完整的III型分泌系统（T3SS），并可推广至任何适用于冷冻电子断层扫描的研究项目。

微细胞样品 S. flexneri 按照示意图所示进行收集和处理 图1 使用 tomoauto，按照详细说明的流程进行 图2. 使用 SerialEM 采集倾转系列图像10，可在用户于低倍率拼接图上指定的位置实现高通量倾转系列的采集（图3）。采用直接检测装置相机以剂量分段模式采集显微照片，以减少电子束诱导的运动22 (图4）。Tomoauto 协调运动校正，对一系列剂量分馏的显微图像进行处理，并使用 MOTIONCORR 对每幅图像进行校正22 并将结果组装成一个倾斜系列以进行后续处理（视频 1).
tomoauto 最普遍的应用是自动对齐初始倾转系列图像。tomoau...

我们介绍了一种利用高通量冷冻电子断层扫描技术测定高分辨率结构的实验方案 原位 分子机器的结构。该方案支持大量数据的处理，避免了常见瓶颈，减少了资源停机时间，使用户能够专注于重要的生物学问题。

使用 Tomoauto：高通量自动化冷冻电子断层成像实验方案

冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET）是一种强大的三维（3-D）成像技术，用于在天然状态下观察大分子复合物……

本实验方案的总体目标是帮助用户建立一个高通量的冷冻电子断层成像样品收集与处理流程。该方法可解决冷冻电子断层成像领域中的一些关键问题，例如：如何处理使用新一代探测器采集的数据，以及如何分析自动化倾转系列采集软件产生的大量数据？该技术的主要优势在于，用户能够以统一的方式配置多个软件包，从而建立高效的自动化倾转系列数据处理流程，使研究人员能够将更多时间用于断层图像的分析工作。通常，刚接触冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的研究人员会面临困难，因为需要处理电子显微镜产生的大量数据，且涉及许多繁琐的步骤。五年前，我们首次萌生了开发此方法的想法，当时为了获得一个细菌的三维重构图像，不得不手动完成数百个步骤。在此之前，请先查阅关于制备志贺氏菌（Shigella flexneri）微型细胞的文本实验方案。然后，按照已有的 JoVE 文章所述方法以及文本方案中的说明制备透射电镜载网。将嵌有冷冻玻璃态冰中微细胞的样品装载到电镜样品台上后，开始采集倾斜系列的低倍率图像图谱。在低倍率（约 2300×）下观察荧光屏时，寻找适合成像的载网方格区域。该位置应含有薄冰且目标物无污染。接下来，将视野调整至网格方格的中心，然后点击“添加载物台位置”按钮以保存该位置。随后，重复此过程，直到所有符合条件的网格方格位置均已保存。下一步从打开一个新的拼接文件开始。在设置对话框中，调整 X 和 Y 参数，以确保捕获整个网格方格。对于标准的 200 目网格，设置一个 10×10 的区域，并使用较高的像素合并值（如 8）。同时切换移动载物台而非移动图像的选项，以及跳过用于对齐图块的相关性计算选项。现在，在导航器窗口中，使用“采集”切换按钮选择要采集的第一个载物台位置。对每个载物台位置继续执行此操作。接下来，在 Navigator 菜单下，点击“Acquire at Points”。在弹出的对话框中，选中“acquire map image”和“rough eucentricity”选项，取消选中所有其他选项。然后，点击继续，将为每个阶段位置生成一个拼接图像。继续使用 SerialEM 软件，在导航器中选择已获取的地图，然后点击加载地图。然后，单击“添加点”，并在地图上选择应采集倾转系列的位置。完成选择后，单击“停止添加点”，并对每张采集的地图重复此过程。接下来，打开“相机”菜单下的参数，设置聚焦、试拍和记录模式。记录分剂量数据的选项可能具有特殊意义，该选项可在“记录选项”下进行设置。要继续操作，请在当前查看的地图中选择一个点，然后在“导航器”窗口中切换倾斜系列选项。在打开的对话框中，选择倾斜系列的参数。然后，对地图中选定的每个点重复切换倾转系列选项的操作。接下来，在 Navigator 中启动“在指定点采集”选项。在对话框中，勾选初步任务、重新对齐至目标、自动对焦以及粗略齐焦功能。然后，将主任务设置为获取倾转系列图像，并选择在所有点数据采集完成后关闭透镜柱。当执行该流程时，系统将在每个地图中已启用倾转系列采集的每个点上收集倾转系列图像。将原始倾转系列图像、SerialEM 输出的日志文件以及各剂量分帧图像均保存在当前工作目录下后，在终端中执行以下命令以消除电子束诱导的运动伪影。继续进行倾转系列图像的对齐与重构。在终端中输入以下 tomoauto 命令。在命令后附加待处理倾转系列图像的文件名，然后输入标记物直径（单位为纳米）。如果不需要进行 CTF 处理，只需从命令中省略该选项即可。此命令是 tomoauto 的主要用途，允许用户通过单条命令执行与倾斜系列图像对齐相关的所有处理步骤（这些步骤原本需要手动干预），从而实现快速编写批量处理脚本。现在，使用 3dmod 命令检查对齐后的倾斜系列图像中是否存在明显错误。此处 filename 为无后缀的倾斜系列图像名称。然后，使用此处所示命令检查估计的 CTF。同样，filename 为无后缀的倾斜系列图像名称。此外，在 tomoauto 命令生成的输出日志中，检查对齐的残差误差。这是衡量对齐整体质量的定量指标。如果对齐结果可接受，则继续进行重构计算。此命令用于校正CTF，并从倾斜系列图像中清除用于对齐的标记点。若要跳过视觉检查并直接进行重建，请使用此命令。tomoauto 具有许多可访问的选项。其中一个特别的功能是，根据 tomoauto 的文档，可以包含由辅助文件描述的本地配置。在命令行对话框中，使用本地配置选项，将该文件的名称置于倾转系列文件名之前。创建本地配置文件的能力是 tomoauto 最强大的功能，允许用户完全配置所使用的所有命令，针对特定或困难的数据集调整执行过程，同时保持自动化处理的优势。测试协议中包含了如何执行子断层平均化的额外说明。根据所述协议，使用 tomoauto 生成了两个对齐的倾转系列。精细对齐是基于一个理想定义了标记物坐标的模型计算得出的。在50度时，一个倾转系列能够正确追踪金颗粒，表明达到了可接受的对齐效果；而第二个倾转系列中，若干显示为红色的模型点偏离了对应的金标记，说明该模型未能实现合适的对齐。在倾转系列采集过程中，tomoauto能够成功对齐所采集倾转系列的80%至90%。重建完成后，最终的断层图像为样品的三维体数据。该数据可用于通过分割进行细胞结构注释，或进行子断层图像平均以获取样品内分子机器的更高分辨率信息。EMDB 中收录的志贺氏菌（Shigella flexneri）附着菌的 2.7 纳米子断层图像平均结果，展示了该技术相较于在单个断层图中观察注射装置（injectisome）所实现的显著提升。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用 SerialEM 和 tomoauto 以自动化、高通量的方式采集和处理冷冻电子断层扫描数据。一旦掌握该技术，若操作得当，每天可采集近 100 个倾转系列，并在 20 分钟内完成一个倾转系列的对齐。在执行该操作过程中，务必始终检查倾转系列对齐的质量。如果一组倾斜系列图像未能良好对齐，可尝试手动对齐，并将参数传递到本地配置中。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如亚断层平均法），以回答更多科学问题，例如确定大分子复合物的高分辨率结构。该技术发展之后，为冷冻电镜领域的研究人员探索细菌、病毒及其他生物体中原位高分辨率结构开辟了道路。

using-tomoauto-protocol-for-high-throughput-automated-cryo-electron

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用Tomoauto：一个协议，用于高通量自动化低温电子断层扫描

本文展示了如何利用电子冷冻断层扫描技术（ECT）在接近天然的状态下研究细菌细胞的超微结构，分辨率可达“大分子”级别（约4...

细菌细胞的电子冷冻断层扫描技术

我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。...

动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

我们介绍了一种收集和处理完整线粒体冷冻电子断层成像图的方法。该技术可提供关于天然生物膜中大型膜蛋白复合物的结构、功能和组织的详细信息。...

通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的ATP合酶二聚体

低温电子断层扫描中对大规模数据采集日益增长的需求，要求具备高通量的成像采集流程。本文所述方案实现了先进的采集策略的最新进展，旨在最大限度地提高断层扫描数据采集的时间效率和通量。...

冷冻电子断层扫描数据采集优化策略

本方案介绍了一种在结构保持完整的染色质中对复制位点进行高分辨率定位的技术 原位...

通过电子断层扫描技术在超微结构保存的染色质中成像复制结构域

单颗粒冷冻电子显微镜技术需要合适的软件包和用户友好的流程，以实现高通量的自动数据采集。本文介绍了完全自动化的图像采集软件包Latitude-S及其在低剂量条件下收集玻璃态生物大分子数据的实际操作流程。...

适用于单颗粒冷冻电镜的用户友好、高通量、全自动数据采集软件

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å...

冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1...

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位...

厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

介绍一种采用芯片内光聚合技术制备聚合物微阵列的方法。同时描述了利用原子力显微镜、水接触角测量、X射线光电子能谱、飞行时间二次离子质谱以及细胞黏附实验对表面进行高通量表征的过程。...

用于生物材料高通量发现的聚合物微阵列

学习高通量自动化冷冻电子断层扫描技术，用于原位分子机器高分辨率结构研究。该方法整合多软件包实现自动化倾斜序列处理，简化繁琐步骤，使研究人员能专注于生物学问题分析。

使用 Tomoauto：高通量自动化冷冻电子断层成像实验方案

探索更多视频