使用Tomoauto:一个协议，用于高通量自动化低温电子断层扫描

该程序的总体目标是帮助用户建立冷冻电子断层扫描的高通量收集和处理管道。这种方法可以帮助回答冷冻电子断层扫描领域的关键问题，例如：如何处理使用新一代检测器收集的数据，并处理自动倾斜系列采集软件产生的大量数据？这种技术的主要优点是用户可以统一配置多个软件包，以找到用于自动倾斜序列处理的有效管道，从而将更多时间花在断层照片分析上。

一般来说，刚接触冷冻电子断层扫描的人会很吃力，因为需要许多繁琐的步骤来处理电子显微镜生成的大量数据。五年前，我们第一次有了这个开发的想法，当时我们必须手动完成数百个步骤才能获得一种细菌的 3D 重建。提前查阅有关准备 Shigella flexneri 微型细胞的文本协议。

然后，按照现有 JoVE 出版物的说明准备电子显微镜网格，并在文本协议中记录。在将嵌入玻璃化冰中的微电池集合加载到 EM 载物台后，开始收集倾斜系列的低放大倍率图。在以约 2300 倍的低放大倍率观察荧光屏时，找到成像可接受的网格方块。

这个位置应该有薄冰和没有污染物的感兴趣对象。接下来，将视图调整到网格方块的中心，然后单击 Add Stage Position 按钮以保存位置。然后，重复该过程，直到所有可接受的网格方块都保存了它们的位置。

下一步从打开一个新的蒙太奇文件开始。在设置对话框中，设置 X 和 Y，以便捕获整个网格方块。对于标准的 200 网格网格，请创建一个具有高像素合并值的 10 x 10 空间，例如 8。

此外，切换 move stage instead not moving image 选项和 skip correlatrelations used to align pieces 选项。现在，在 Navigator 窗口中，使用 Acquire 切换选择要获取的第一阶段位置。继续对每个舞台位置执行此作。

接下来，在 Navigator 菜单下，单击 Acquire at Points。在打开的对话框中，切换 Get map image （获取地图图像） 和 rough eucentricity （粗略的全中心度）。取消切换所有其他选项。

然后，单击 继续，将为每个舞台位置制作蒙太奇。继续使用 SerialEM 软件。在 Navigator 中，选择获取的地图，然后单击 Load Map。

然后，单击 Add Points，并在地图上选择应获取倾斜序列的点。进行选择后，单击 Stop Adding Points，然后对每个采集的地图重复该过程。接下来，打开 Camera 菜单下的参数，然后设置 Focus、Trial 和 Record 模式。

记录剂量分级数据的选项可能特别有趣，可以在 Record 选项下指定。要继续，请在当前查看的地图中选择一个点，然后在 Navigator （导航器） 窗口中切换 tilt-series （倾斜序列） 选项。在打开的对话框中，选择 tilt 序列的参数。

然后，对地图中的每个选定点重复切换 tilt-series 选项的过程。接下来，从 Navigator 中启动 Acquire at Points 选项。在对话框下，切换 Preliminary Tasks、Realign to item、Autofocus 和 rough eucentricity。

然后，将 Primary Task 设置为 acquire tilt-series，并选择 close column vals at end 以在收集所有点后关闭列。执行该过程时，将在每个点收集倾斜序列，并在每个地图中为倾斜序列集合切换。使用原始倾斜序列、SerialEM 的输出日志和单个剂量分次图像都在当前工作目录中，在终端中执行以下命令以消除光束诱导的运动伪影。

继续对齐和重建倾斜序列。在终端中键入 tomoauto 命令，如下所示。在该命令中，附加要处理的倾斜序列的文件名，后跟以纳米为单位的基准直径。

如果不需要 CTF 处理，只需从命令中省略该选项即可。此命令是 tomoauto 的主要用途，允许用户在单个命令中执行对齐倾斜序列所涉及的所有过程，这最初需要用户手动干预，允许用户快速编写批处理脚本。现在，使用 3dmod 命令，查看对齐的倾斜序列是否有任何明显的错误。

这里的 filename 是不带后缀的 tilt 系列的名称。然后，使用此处显示的命令检查估计的 CTF。同样， filename 是不带后缀的 tilt 系列的名称。

此外，在 tomoauto 命令生成的输出日志中，检查对齐的残差。这是对对齐整体质量的定量衡量。如果对齐可以接受，则继续计算重建。

此命令设置为更正 CTF，并从倾斜序列中擦除对齐时使用的基准标记。要跳过目视检查，直接进行重建，请使用此命令。Tomoauto 提供了许多可访问的选项。

根据 tomoauto 文档，其中一项特别之处在于能够包含由辅助文件描述的本地配置。在附加 tilt-series 文件名之前，使用 local configuration 选项将此文件的名称包含在命令行对话框中。创建本地配置文件的能力是 tomoauto 最强大的功能，它允许用户完全配置使用的每个命令，根据特定或困难的数据集调整执行，同时保持自动化处理。

测试协议中提供了有关如何执行子断层扫描平均的附加说明。按照所描述的协议，用 tomoauto 制作了两个对齐的倾斜系列。精细对齐是根据理想情况下定义基准标记坐标的模型计算得出的。

在 50 度时，一个倾斜序列正确跟踪了金颗粒，表明对齐是可接受的。而在第二个倾斜序列的情况下，几个模型点（以红色显示）偏离了相应的金色标记，说明模型没有产生合适的对齐。收集倾斜序列时，tomoauto 成功对齐收集的倾斜序列的 80% 到 90%。

重建后，最终的断层照片是图像样本的 3D 体积。然后，这可用于通过分割进行细胞注释，或进行亚断层扫描平均，以获得样品中分子机制的更高分辨率信息。沉积在 EMDB 中的附着 Shigella flexneri 的 2.7 纳米亚断层图平均值表明，与在单个断层照片中观察注射体相比，该技术有了很大的改进。

观看此视频后，您应该对如何使用 SerialEM 和 tomoauto 以自动化、高通量的方式收集和处理冷冻电子断层扫描数据有很好的了解。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在一天内收集近 100 个倾斜序列，并在 20 分钟内对齐一个倾斜序列。在尝试此过程时，请务必记住始终检查倾斜序列对齐的质量。

如果一组倾斜序列不能很好地对齐，请尝试手动对齐，并将参数传输到本地配置。按照此程序，可以执行其他方法，如亚断层照片平均，以回答其他问题，例如确定大分子复合物的更高分辨率结构。该技术发展后，为冷冻电镜领域的研究人员探索细菌、病毒和其他生物体中的高分辨率原位结构铺平了道路。