Name: 在基于生物发光钙指标GFP的水母体内脑功能成像方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T15:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学习利用GFP-aequorin生物发光成像技术对黑腹果蝇进行深层脑区钙信号长期成像的方法。该技术无需激光激发，可避免光漂白和光毒性，为神经生物学研究提供重要的基础脑活动数据。

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我们衷心感谢美国 Sciences Wares 公司的 E. Karplus 提供的宝贵且富有成效的帮助与建议。感谢 E. Carbognin、A. Avet-Rochex、M. Murmu、P. Pavot、D. Minocci、G. Vinatier 和 J. Stinnakre 为本技术的开发与改进所做出的贡献。我们还感谢美国阿什本霍华德·休斯医学研究所珍利亚农场（Janelia Farm, H.H.M.I.）的 B. Pfeiffer 和 G. Rubin 提供 pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP 品系。本研究得到了美国华盛顿法国大使馆的夏多布里昂奖学金（Chateaubriand Fellowship）对 A. Lark 的资助，美国国家科学基金会（National Science Foundation，项目编号 IOS 1352882）对 T. Kitamoto 的资助，以及法国国家研究局（ANR）（项目 ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin，2005 年，和 FlyBrainImaging，2011 年）、法兰西岛大区议会（Conseil Régional Ile-De France，NeRF 和 DIM 项目）、IFR-144、法国国家科学研究中心（CNRS）物理-化学-生物学交叉项目（2009 年）和法国国家科学研究中心（CNRS）对 JR Martin 的资助。

1. 样品制备
<ol>
	<li>溶液制备与实验装置搭建
	<ol>
		<li>保持所有 黑腹果蝇 24代 &#176;在标准食物培养基上饲养。在试管中以低密度培养和保存果蝇，以获得大小和体重标准化的个体。
		<ol>
			<li>将10只处女雌蝇与10只雄蝇放入一试剂瓶中，让其交配，并每2天转移至新的试剂瓶。10天后，当果蝇开始羽化时，每天收集果蝇。准确记录果蝇的日龄，并保持其良好状态。</li>
			<li>第3天将雄蝇与雌蝇分开，每瓶保留20只雌蝇。在果蝇4至5日龄时进行记录。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制任氏液，其成分为：130 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM MgCl₂2，2 mM CaCl₂2，5 mM HEPES 和 36 mM 蔗糖，并将溶液的 pH 精确调整至 7.3。准备 25 的灌注溶液 &#181;M 尼古丁和 100 mM KCl 的任氏液。</li>
		<li>制备 1,000 &#181;l 移液器吸头：使用剃须刀片将吸头尖端切成斜面（约 35&#176; 从尖端末端开始，去除多余的基部部分 &#189; 尖端以下厘米处</li>
		<li>准备一个用于孵育期间储存样品的盒子（23 cm × 17 cm × 8.5 cm），在盒子底部放置两块吸水后的海绵（12 cm × 8 cm × 3 cm），并在海绵上方放置一个小的支架装置，用于承载已完成制备的样品，以防止样品干燥。</li>
		<li>准备果蝇样品，使其至少含有一份UAS-GFP-aequorin基因和一份驱动GFP-aequorin表达的Gal4品系。在本实验中，使用主要在蘑菇体中驱动表达的OK107 Gal4品系与UAS-GFP-aequorin进行杂交。 
		注意：盒子内部必须防水，外部必须避光，以防止腔肠素在孵育过程中降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>冰麻醉 果蝇 将其转移至玻璃小瓶中，冰上放置2分钟，然后移至预冷的培养皿中进行移液器尖端的定位。在冰上的100 ml培养皿内，将滤纸略微润湿后用于放置移液器尖端，并在解剖显微镜下进行准备。</li>
		<li>用镊子轻轻将果蝇放入移液器吸头内。</li>
		<li>使用毛笔轻轻推动并调整果蝇，使其头部完全越过尖端边缘，且在尖端塑形过程中被切除的部分使果蝇背部区域部分暴露图2B).</li>
		<li>将少量（约3-4） &#181;l) 牙科胶水两种组分的适量部分。将胶水仔细涂抹于头部和颈部的前侧与后侧，向下延伸至移液管尖端边缘并围绕其周围——避免接触头顶冠部。静置干燥 2 分钟。</li>
		<li>将粘有果蝇的移液器尖端穿过记录室的孔洞放入（图 2D）并轻轻按压以固定到位。</li>
		<li>将硅胶的两种组分混合（约3-4 &#181;l). 在腔室扁平侧的边缘处涂抹胶水，该边缘为腔室与移液管尖端接触的位置，以防止任氏液泄漏。让胶水干燥2分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖
	<ol>
		<li>将胶带固定在灌流通道上方，短边覆盖并延伸至腔室背面。</li>
		<li>将装有果蝇的培养室置于解剖板上的显微镜下，打开荧光灯。用移液器向培养室中加入1 ml任氏液。</li>
		<li>使用精细手术刀去除头壳。从头部后方至触角区域做平行切口，然后沿眼睛边缘切割，再在触角上方做一垂直切口，连接先前的切口。最后做一条与头部后方平行的切口。使用精细尖头镊子去除头壳。图2C).</li>
		<li>使用精细的尖头镊子轻轻夹住并清除暴露的呼吸组织，直至大脑和[荧光]蘑菇体清晰可见。</li>
		<li>使用超锐利镊子小心夹住并轻捏覆盖大脑的神经上皮组织，以促进腔肠素的渗透。 
		注意：也可使用木瓜蛋白酶（papain）对神经上皮进行通透化处理9.</li>
		<li>使用移液器用任氏液冲洗两次，以去除解剖过程中产生的任何碎屑，并将样品置于暗盒中。</li>
		<li>用移液器吸取1 ml含有5的任氏液 &#181;将M苯甲基腔肠素加入室中。关闭盒子，于室温下与腔肠素孵育至少2小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 成像
<ol>
	<li>设置
	<ol>
		<li>启动记录系统：打开显微镜、计算机、相机和引流系统，并将室内环境控制设为 25 °C。</li>
		<li>在计算机上打开 Measurement and Automation Explorer 程序。点击“Devices and Interfaces”，然后双击“NI Motion Devices”，最后右键点击“PCI-7334”并选择“initialize device”。</li>
		<li>打开 Photon Imager。创建新文件夹并命名第一个记录文件。相机必须冷却至 -80 °C 后系统方可运行。</li>
		<li>设置灌流系统——将 KCl、尼古丁和任氏液加入储液罐中，并调节使每种溶液以 2 ml/min 的速度流出。实验开始前先用任氏液冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备样品
	<ol>
		<li>将成像固定用的载片置于显微镜载物台上的固定装置中，在 5X 放大倍数下插入灌流管至通道内，通过穿刺完成连接。</li>
		<li>将显微镜设为荧光模式，然后居中并对准蘑菇体（MBs）。切换至 20X 倍数，重新居中并对焦。</li>
		<li>将引流装置置于引流池上方，调节引流管高度，使其尖端刚好位于池上方，并运行任氏液 30 秒以确保引流通畅。</li>
		<li>拉下遮光罩以隔绝光线。使用 Photon Imager 中的自动系统对焦进行微调，并拍摄 MBs 的参考荧光图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录
	<ol>
		<li>将光子采集速度调整至所需记录速度（从 50 毫秒到 1 秒或更长）。选择光子模式并打开快门。在日志中记录基因型、性别、年龄和样品编号。通过点击 ROI 框并按住 control 键拖动，将 ROI 框调整至覆盖髓部（calyx）和细胞体（CCB）以及内侧叶。</li>
		<li>记录约 5 至 10 分钟的基础信号（根据需要设定）。</li>
		<li>施加尼古丁持续 1 分钟。在日志中记录起止时间。随后用任氏液冲洗 5 分钟。</li>
		<li>等待 5 分钟以恢复，并准备 KCl 的日志条目和计时器。</li>
		<li>施加 KCl 持续 1 分钟。在日志中记录起止时间。随后用任氏液冲洗 1 分钟。</li>
		<li>切换至荧光模式，拍摄最终荧光图像，并关闭任氏液灌流。</li>
		<li>点击“Stop”。弹出对话框询问是否关闭系统。选择“No”以继续下一轮记录。</li>
		<li>打开遮光罩，移开引流系统，将物镜切换回 5X，取出灌流管。将样品/记录皿从载物台上取下，用水冲洗并擦拭 20X 物镜两次以清洁镜头。</li>
		<li>点击程序窗口顶部的白色播放按钮，启动下一次记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分析与视频制作
<ol>
	<li>提取光子值
	<ol>
		<li>打开光子分析程序（例如，光子查看器）并打开第一个样本电子表格文件。</li>
		<li>选择显示控制选项卡。按住 Control 键并点击目标区域以选择感兴趣区域（ROI）。调整感兴趣区域的大小、方向和形状，使其包含 GFP 照亮的 CCB 和内侧叶。</li>
		<li>通过点击“Define ROI”并在屏幕上点击并拖动来创建新的ROI，以添加额外的感兴趣区域。</li>
		<li>选择“Movie”标签以播放光子视频。根据需要调整“sec width”和“sec steps”。必要时重新调整ROI的位置。</li>
		<li>选取具有代表性的GFP荧光、尼古丁反应和KCl反应的屏幕截图。裁剪截图后将其粘贴至演示文稿幻灯片中，用于后续分析与比较。</li>
		<li>将“sec width”和“sec step”均调整为以秒为单位的记录速度。通过移动上方面板的灰色标记，选择分析区间，范围应涵盖刺激开始前至反应结束后的区域。</li>
		<li>选择“播放时暂停视图”并按下 &#8220;&#60;&#60;“REW”并按“PLAY”&#62;&#8221;选择“计数率图表”选项卡，根据需要调整单位和线条颜色，使其与感兴趣区域（ROI）的颜色相匹配。</li>
		<li>分析完成后，点击“导出计数率数据”。从两侧分别选取组合记录 CCB 及内侧叶感兴趣区域的屏幕截图。裁剪截图后，将图像粘贴至包含反应图像的幻灯片中。该幻灯片将在最终分析中使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>示例分析：一种用于分析提取的光子数据的详细方法
	<ol>
		<li>打开“Count Rate Exports”文件夹中的电子表格文件。</li>
		<li>将第一列标记为“时间”的单元格重新格式化，以小时和分钟显示时间。</li>
		<li>参照对应幻灯片中的样本，保留时间及两个代表性感兴趣区域（ROI）的列，删除其他所有数值。</li>
		<li>确定尼古丁刺激开始时间&#160;&#8212; 主文件夹中的日志条目文件内有数据——开始前请删除额外数据或标出有效值。</li>
		<li>标记并高亮显示CCB和内侧叶的最高值/峰值。</li>
		<li>通过参考幻灯片上相应图形化反应的时间点来估算CCB和内侧叶的反应起始与终止时间，并根据这些时间点附近数值的变化选择实际值。在CCB和内侧叶的曲线上均高亮显示这两个时间点之间的区域。或者，可使用宏程序完成该操作。9.</li>
		<li>将同一实验组的所有样本合并到一个新的电子表格中。</li>
		<li>通过确定每个 CCB 峰值对应的行数值来对齐峰值。用最高行数值减去较低的行数值，以确定该样本数据需重新复制到的近似行数值。验证所有峰值是否已对齐。</li>
		<li>复制该工作表两次，然后分别删除内侧叶列或CCB列，生成仅包含CCB值或仅包含内侧叶值的页面。</li>
		<li>在所有 CCB 反应结束后移除数据。创建四行，分别标记为总光子数、反应时长（持续时间）、峰值振幅和反应潜伏期。将此内容再次复制并粘贴到原始行下方。</li>
		<li>使用 SUM 函数确定响应期间的总光子数。使用 COUNT 函数确定响应持续时间。复制并链接最大值单元格以确定峰值幅度值。使用 COUNT 函数&#160;&#8212; 从尼古丁灌注开始至反应起始点进行选择&#160;&#8212; 以确定反应潜伏期。</li>
		<li>使用链接功能复制数值，并将所有数值（峰值振幅除外）乘以记录速度（单位：秒）。</li>
		<li>如果需要，可以针对计算出的参数（如总光子数、峰值幅度和反应时长）创建柱状图/箱线图（例如： 图5B、C、D).</li>
		<li>在原始数据光子响应列之后，使用平均值函数对每个时间点的原始数据点进行平均。如有需要，可接着添加一列，用于计算每个时间点平均光子值的标准误（SEM）。</li>
		<li>使用平均值列构建 CCB 样本组的平均响应曲线图 [Graph]。具体操作为：选择指定时间的列作为 x 轴数值，选择平均光子值的列作为 y 轴数值，最后选择散点图绘图工具生成图表。</li>
		<li>用内侧叶的数据重复此分析流程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制作视频用图像
	<ol>
		<li>打开光子成像仪。</li>
		<li>选择显示控制选项卡。按住控制键并点击感兴趣区域（ROI）以选择、移除和/或最小化该区域。</li>
		<li>根据需要调整“sec width”（累积时间）以确定每一帧的内容。</li>
		<li>将“sec step”修改为定义每帧之间的重叠部分。</li>
		<li>选择“播放时导出视图”并按下 &#8220;&#60;&#60;“REW” 然后 “PLAY”&#62;&#8221;视频的图像将作为一系列 .png 文件导出至“view exports”文件夹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Virtual Dub 制作视频：一种详细的视频创建方法
	<ol>
		<li>在包含图像的视图导出文件夹中创建一个名为“resultats”的新文件夹。</li>
		<li>将脚本（renommer.VBS）放入图像文件夹中。</li>
		<li>双击 renommer.VBS 以运行。</li>
		<li>图像将自动按数字重命名并复制到“resultats”文件夹。</li>
		<li>打开 VirtualDub.exe。</li>
		<li>选择打开视频文件 — 选择第一帧图像（后续图像将自动加载）。</li>
		<li>选择视频——根据需要调整帧率。</li>
		<li>选择视频 — 选择压缩，选取由 Radius 开发的 Cinepak Codec。</li>
		<li>在文件中选择“另存为 AVI”，视频将自动生成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Martin, J. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging%3A+fluorescence+or+bioluminescence%2C+which+to+choose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose.</a> J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍的基于生物发光的GFP-aequorin方法最近得到发展，可实现对不同神经元中Ca2+活性的体内功能记录，也可根据需要用于其他类型细胞（如Cabrero et al., 20135中报道的肾星状细胞）的记录。
修改步骤、故障排除、附加组件及关键步骤
Drosophila 饲养管理
将GFP-aequorin转基因（pG5A）4插入pUAST载体中，构建了三个独立的转基因品系6。对所有品系均检测了其生物发光特性，结果表明它们均能响应体内的Ca2+活性6。然而，近期实验发现，插入第三号染色体的GA2品系所产生的信号比插入第二号染色体的GA1品系更为强烈。本文所示代表性结果系通过将UA...

大脑及其离散结构内活动的基本图式与功能长期以来一直是神经科学领域深入研究的重点。或许最早成功解决这一问题的方法之一是直接进行生理学测量，即检测电活动的变化；然而，其他能够实时成像电压、pH值或钙离子浓度变化（作为神经活动的间接指标）的方法为神经元活动的研究提供了更多能力1。成像技术具有多种优势，例如侵入性更小，并能够监测整个脑结构内的活动。此外，在遗传操作较为便利的动物中（如果蝇Drosophila），研究人员已开发出基因编码的钙离子指示剂（如cameleon、GCaMPs等）1，使得单个神经元、神经元群体乃至整个脑结构的活动监测成为可能。尽管传统的基于GCaMPs（绿色荧光蛋白GFP与钙调蛋白融合）或FRET技术（CFP和YFP与钙调蛋白融合）的荧光钙成像方法已被证明是有效的，并具有良好的空间和时间分辨率，但其依赖光激发的基本机制也带来了一些实验应用上的限制。由于光激发的特性，不可避免地会产生自发荧光、光漂白和光毒性，从而限制了可成像结构的深度、记录的持续时间以及记录的实时连续性。换句话说，为避免这些不良副作用，记录通常必须间歇性地进行。
由于这些挑战，人们已开发出其他替代性的钙成像方法。其中最有前景的方法之一是生物发光成像，该方法依赖于钙结合后通过酶促反应产生的光。生物发光成像不需要激发光，因此不会遇到传统钙成像所面临的相同困难。生物发光报告分子Aequorin来源于Aequorea victoria（与绿色荧光蛋白GFP相同的水母物种），通过其三个EF手结构域结合钙离子，并发生构象变化，导致辅因子腔肠素（coelenterazine）被氧化并释放蓝光（λ=469 nm）2,3。Aequorin对钙离子的亲和力非常低（Kd = 10 µM），这使其非常适合监测钙瞬变，因为它产生的背景噪声极小，且不会干扰细胞内钙缓冲系统4。尽管Aequorin此前已被用于监测非洲爪蟾（Xenopus）卵细胞中神经诱导过程5，但其产生的光过于微弱，无法用于神经元活动的实时成像。为应对这一挑战，法国巴斯德研究所的Philippe Brûlet及其同事构建了一种将GFP与Aequorin基因融合的遗传载体，模拟了水母体内的天然状态4。该融合基因产物仍通过Aequorin的三个EF手结构域结合钙离子，引发构象变化，导致腔肠素氧化，并将能量以非辐射方式转移至GFP。这种能量转移使得GFP释放出绿光（λ=509 nm），而非Aequorin原本的蓝光。GFP与Aequorin的融合还提高了蛋白质的稳定性，使融合蛋白产生的光强达到单独Aequorin的19至65倍4。在脑组织中采用生物发光成像方法，扩展了钙成像技术当前的实验应用范围，无论是在连续记录的持续时间上，还是在可记录脑区结构的数量上均有提升。从更广泛的研究背景来看，这意味着可以通过钙瞬变这一间接指标，监测大脑更广泛的全局性以及更多样化的区域性“活动”。更重要的是，这种技术能够实现长时间、实时且连续的活动监测，为全面理解大脑基础功能提供了有力支持。
近年来，我们实验室及其他研究团队已开发出在双元表达系统（GAL4/UAS-GFP-水母发光蛋白）控制下表达GFP-水母发光蛋白的转基因果蝇5,6。我们利用GFP-水母发光蛋白的生物发光特性，记录了气味等自然刺激所引发的神经活动7,8，并研究了烟碱直接激活乙酰胆碱受体后，调控蘑菇体中Ca2+活性的细胞组分9。此外，我们还应用GFP-水母发光蛋白解决了若干以往难以探究的实验问题，例如自发性钙瞬变的长期成像以及对脑深层结构的可视化观察10。最近，我们利用GAL4/UAS系统在投射神经元（PNs）中表达哺乳动物ATP受体P2X211（一种阳离子通道），同时使用LexA系统在蘑菇体中表达GFP-水母发光蛋白（MB247-LexA,13XLexAop2-IVS-G5A-BP）（由美国霍华德·休斯医学研究所珍利亚农场研究中心B. Pfeiffer惠赠）。该策略使我们能够通过施加ATP来激活投射神经元，继而激活蘑菇体（PNs的下游靶区），从而模拟更接近自然条件的神经响应，例如对气味刺激的反应。总体而言，P2X2与GFP-水母发光蛋白相结合的技术拓展了实验研究的可能性，广泛地为深入理解脑内活动模式提供了新途径，并推动了关于不同刺激和干扰如何改变基础活动模式的新研究。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1023911000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>prolabo</td><td>26 764.298</td><td>normapur</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>prolabo</td><td>25 108.295</td><td>normapur</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>尼古丁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>腺苷-5&amp;prime;-三磷酸二钠盐水合物</td></tr><tr><td>苄基腔肠素</td><td>Prolume, nanolight&amp;nbsp;</td><td>Cat #301 Coelenterazine h</td><td>http://www.prolume.com/</td></tr><tr><td>牙科胶</td><td>3M ESPE&amp;trade;</td><td>46954</td><td>Protemp IV</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>3M ESPE&amp;trade;</td><td>36958</td><td>Express 2 Regular Body Quick</td></tr><tr><td>胶带</td><td>3M Scotch</td><td>122s</td><td>3M Scotch Magic Tape</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Corning Incorporated</td><td>4868</td><td>100–1,000 &amp;micro;l 通用移液器吸头</td></tr><tr><td>灌流室及支架（载物台）</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>孵育盒</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>镊子（5号）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>显微解剖镊</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>显微解剖镊</td></tr><tr><td>胶水涂布器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>自制&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10316-14</td><td>5 mm 深度 15&amp;deg; 刺切刀</td></tr><tr><td>EM-CCD 相机&amp;nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td>iXon（冷却至 -80 &amp;deg;C）</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse-E800</td></tr><tr><td>浸油物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X Fluor .5w</td></tr><tr><td>带荧光功能的解剖显微镜</td><td>Leica MZ Fl III</td><td></td><td>Leica 解剖显微镜及荧光灯</td></tr><tr><td>密闭暗箱</td><td>Science Wares</td><td></td><td>由 Science Wares 定制制作</td></tr><tr><td>蠕动泵&amp;nbsp;</td><td>Gilson</td><td></td><td>Minipuls 2</td></tr><tr><td>管路</td><td>Fisher Scientific</td><td>取决于厚度</td><td>Tygon R3603, St-Gobain</td></tr><tr><td>灌流系统</td><td>Warner</td><td>64-0135 &amp;nbsp;(VC-66CS)</td><td>灌流阀控制系统，完整配置，带夹管阀，6通道</td></tr><tr><td>灌流调节器</td><td>Leventon</td><td>201108</td><td>Dosi-flow 3</td></tr><tr><td>测量与自动化管理器</td><td>Sciences Wares &amp; National Instruments</td><td>N/A</td><td>软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>光子成像软件&amp;nbsp;</td><td>Science Wares &amp; National Instruments</td><td>N/A</td><td>软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>光子查看器</td><td>Science Wares &amp; National Instuments</td><td>N/A</td><td>软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>软件 https://www.microsoft.com</td></tr><tr><td>VirtualDub</td><td>开源软件&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>软件 http://virtualdub.sourceforge.net/</td></tr><tr><td>UAS-GA2</td><td>Martin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2007, 参考文献 1&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>目前无公开品系&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn 美国&amp;nbsp;</td><td>(STOCK #1117340)</td><td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td></tr><tr><td>P2X&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Lima 和 Misenboeck，参考文献 11&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>目前无公开品系&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>OK107</td><td>Bloomington 果蝇品系中心</td><td>854</td><td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td></tr></tbody></table>

在体实验 基于生物发光钙指示剂gfp-aequorin的功能性脑成像方法

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

功能性 在体内 成像已成为研究脑细胞及特定脑结构功能与生理学的有力手段。近年来，一种新的Ca2+- 利用生物发光报告基因GFP-aequorin（GA）的成像技术已经建立。该新技术依赖于GFP基因与aequorin基因的融合，产生一种能够结合钙离子的分子，并在加入其辅因子腔肠素（coelenterazine）后发出强光，可通过光子收集器进行监测。目前已构建出携带GFP-aequorin基因的转基因小鼠品系 果蝇 在 果蝇，绿色荧光蛋白-水母素（GFP-aequorin）基因已被置于GAL4/UAS双元表达系统的调控之下，从而实现脑内特定区域的靶向表达与成像。后续研究证实，该方法能够检测到内向钙离子（Ca²⁺）信号2+-瞬变和Ca2+-从细胞内储存库中释放。最重要的是，该方法能够实现更长时间的连续记录，对大脑更深层区域进行成像，并以高时间分辨率（高达8.3毫秒）进行记录。本文介绍了利用生物发光成像记录和分析Ca2+-果蝇脑中与学习和记忆相关的核心结构——蘑菇体内的活动。

将GFP与aequorin融合，使我们能够在显微镜的荧光模式下激发GFP，从而在进行生物发光成像之前可视化我们的目标区域（图3A、4A、6A、6E）。刺激蘑菇体的最简单方法之一是激活离子型烟碱型乙酰胆碱受体。尽管乙酰胆碱是该受体的内源性配体，但我们发现尼古丁在蘑菇体中能产生更可重复的反应。部分原因是蘑菇体特异性表达烟碱型乙酰胆碱受体，因此使用尼古丁可避免激活脑内其他区域表达的毒蕈碱型乙酰胆碱受体。此外，尼古丁比乙酰胆碱更稳定，因而能够实现更佳且更可靠的刺激控制。典型的反应首先表现为萼区、细胞体（CCB）和内侧叶（ML）的快速激活（参见图4A中标注的图像）。通常情况下，CCB的反应持续时间更长，且生物发光信号强于叶区，如反应的连续图像面板所示（图3C-H）。图4B显示了在25 µM尼古丁灌注1分钟的反应峰值期间，以100毫秒（10 Hz）时间分辨率记录的10秒光子累积情况。在经过10分钟的洗脱和恢复期后，开始第二次刺激，即灌注100 mM KCl持续1分钟（图4C、E），...

本文介绍了一种利用生物发光报告基因的新型 Ca2+ 成像方法。该方法采用 GFP-aequorin 融合蛋白，该蛋白可结合 Ca2+ 并发光，无需外源光激发。该技术显著实现了长时间连续成像、深部脑结构的观测以及高时间分辨率。

在体实验 基于生物发光钙指示剂GFP-aequorin的功能性脑成像方法

功能性活体成像已成为研究目标脑细胞及脑结构功能与生理特性的一种强大方法。近年来，一种新型……

生物发光成像的总体目标是对体内功能性的钙瞬变（作为神经活动的指标）进行长时间、深部脑区的成像。该方法有助于回答神经生物学领域的一些关键问题，例如果蝇大脑在睡眠期间的基础活动状态。该技术的主要优势在于无需使用激光进行激发。这使得人们能够在不产生光漂白和毒性的情况下，对组织更深层的钙瞬变进行更长时间的成像，相较于传统的钙成像方法具有优势。该方法可揭示黑腹果蝇的基础脑活动，也可应用于其他模式生物，例如小鼠。首先，按照随附的文字版实验方案，准备所需的黑腹果蝇品系及实验用溶液。然后，将一只果蝇转移至置于冰上的玻璃小瓶中，冰上麻醉两分钟。接着，将果蝇移至预冷的培养皿中，用一对镊子轻轻将其放入已修剪过的1000微升移液枪头内，修剪时使枪头末端呈约35度角。使用毛刷轻轻推动并调整每只果蝇，使其头部完全越过枪头边缘，且背部区域部分暴露。然后，从头部开始沿移液管尖端边缘涂抹已准备好的牙科胶。需格外小心，避免接触头部的冠部。头部的粘附至关重要，因为将其固定在正确位置对于成功进行解剖和成像十分关键。此外，粘合不良会导致林格溶液泄漏，并在成像前造成样品死亡。接下来，将带有果蝇的移液管尖端从记录室的孔中穿过，并轻轻按压以固定到位。然后使用预先准备好的硅胶将记录室的平面侧与移液管尖端接触处密封，以防止任何泄漏。将一段胶带贴在灌注通道上，覆盖短边并延伸至腔室背面。接着，将带有果蝇的腔室置于显微镜下，并打开荧光灯。然后，用移液器向腔室内加入一毫升任氏液。使用精细的手术刀，从果蝇头部后端向两侧的触角区域做平行切口。然后沿眼睛边缘切割，并在触角上方做一个垂直切口，连接先前的两条切口。最后在头部后方再做一次切口，随后使用一对精细且锋利的镊子去除已切开的角质层。轻轻夹住并清除暴露的呼吸组织，直至清晰看到脑组织和发出荧光的蘑菇体。接下来，使用超锐利镊子小心夹住并捏住覆盖在脑组织上的神经上皮组织，将其移除，以便海肾素能够渗透。用移液器加入一毫升林格溶液，洗涤组织两次，以去除解剖过程中残留的任何碎屑，然后将样品放入暗盒中。接下来，将含有5 µM苯甲基腔肠素的1毫升林格溶液用移液器加入到样品室中。关闭盒子，并在室温下孵育样品至少两小时。首先打开计算机中的显微镜系统。此外，将相机冷却至负80摄氏度。接下来，设置排水系统，并将环境控制调节至20摄氏度。然后，打开光子成像仪，创建一个新文件夹，并命名第一次记录。然后，通过将氯化钾、尼古丁和任氏液分别加入各自的储液槽中来设置灌流系统。调节流速，使每种溶液以每分钟2毫升的速度流出。接着，将样品放置在显微镜下的载物台上，并将放大倍数调节至5倍。然后，通过穿刺处将灌注管插入通道。将显微镜设置为荧光模式，居中并使蘑菇体对焦。一旦蘑菇体对焦清晰，将放大倍数调整为20倍。重新居中图像并调节焦距。接着，将引流装置置于引流池上方，并调节引流管的高度，使管尖刚好位于引流池上方。然后用林格液冲洗样本 30 秒，以检查引流是否充分。最后，拉下遮光罩以屏蔽外部光线对装置的干扰。利用光子成像程序中的自动化系统，精细调节焦距，并对蘑菇体拍摄一张参考荧光图像。将光子采集速度调整至所需的记录速度，范围可设置为每50毫秒至每秒或更长时间采集一幅图像。然后，选择光子模式并打开快门。接下来，在日志条目中输入基因型、性别、年龄和样本编号。通过按住控制键并单击拖动，调整感兴趣区域框的位置，使其覆盖花萼、细胞体和内侧叶。现在，记录大约 5 到 10 分钟的基础值。接下来，打开开关以开始尼古丁的流动。同时，按下回车键并添加备注，以标明尼古丁流动已开始。一分钟后，停止灌流，并在记录本中再次注明灌流已停止。随后用任氏液冲洗样品五分钟。在样品恢复期间，关闭冲洗，将计时器设定为额外五分钟，并准备开始氯化钾溶液的灌流。准备就绪后，开始通入氯化钾溶液，并在样品记录中输入“100 毫摩尔氯化钾开始”。一分钟后，停止溶液流动，并在样品记录中输入“氯化钾关闭”。随后，用任氏液冲洗样品一分钟，并将显微镜切换至荧光模式。拍摄最终的荧光图像，然后关闭灌流液并取出样品。在分析程序中，打开第一个文件，选择“显示控制”选项卡，然后点击 ROI。接着按住 Control 键并选择一个感兴趣区域。接下来，调整感兴趣区域（ROI）的大小、方向和形状，以覆盖GFP荧光标记的壶腹和细胞体，以及内侧叶。当所有感兴趣区域添加完毕后，选择“视频”标签页以播放光子视频。根据需要调整第二宽度和第二步长。然后根据需要重新调整感兴趣区域（ROI）的位置，确保其始终位于视频中的活性区域范围内。选取一些具有代表性的GFP荧光、尼古丁反应以及氯化钾反应的截图。随后裁剪这些截图，并将代表性图像粘贴至演示文稿幻灯片中，用于后续分析与比较。将第二个宽度和第二步均调整为以秒为单位的录制速度。然后，通过移动上方面板中的灰色标记，选择分析区间，使其位于刺激开始前以及反应结束后的括号区域内。接着，选择播放时“暂停视图”，然后按下 rewind 按钮将视频回放重置到起始位置，再按下播放按钮。然后，选择“计数率图表”选项卡，以调整单位，并根据需要调整感兴趣区域的颜色以及线条颜色。分析完成后，选择导出计数率数据。接着，选择壶腹和细胞体的合并记录，以及两侧内侧叶区域的记录，将这些图像粘贴到包含反应图像的幻灯片中。刺激蘑菇体最简单的方法之一是通过激活离子型烟碱乙酰胆碱受体。此处显示的是对25微摩尔尼古丁的典型反应，该反应首先快速激活萼区和细胞体以及内侧叶，实验中使用了融合的GFP-水母发光蛋白（GFP-aequorin）构建体，该蛋白可结合钙离子并发光。通常情况下，萼区和细胞体的反应持续时间更长，且生物发光反应强度高于叶部，如反应序列图中所示。该图描述了随时间变化的烟碱激活引起的生物发光反应的一个示例记录，其中包含卡氏体和细胞体的兴趣区域内的光子数以黑色表示，内侧叶区域内的光子数以红色表示。从该图中可以确定反应持续时间、反应期间的峰值光子数以及每条曲线下方的总面积。一旦熟练掌握，根据果蝇数量的不同，孵育前的制备阶段仅需两个小时。此外，如果操作得当，每次记录可在短短二十分钟内完成。在进行该实验步骤时，重要的是要正确地饲养并维持果蝇品系的代数，以确保样品间的可重复性。在完成该步骤后，可进一步开展其他行为学实验，以回答更多问题，例如该结构的活动对特定行为会产生何种影响。该技术的发展为神经生物学领域的研究人员探索果蝇大脑中的长期神经活动铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何为果蝇大脑的生物发光成像准备样品。请务必注意，尼古丁可能危害您的健康。配制溶液或清理本实验操作时，应采取戴手套等防护措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在基于生物发光钙指标GFP的水母体内脑功能成像方法

利用钙离子敏感型指示剂染料的AM酯形式，可检测发育中神经元网络的自发活动。通过单光子或双光子成像技术，可观察到指示剂荧光的瞬时变化，从而反映细胞内钙离子浓度的改变，指示神经元的激活状态。该方案可适用于多种依赖发育阶段的神经元网络研究。 体外.

发育中皮层网络的功能性钙成像

在本方案中，我们介绍了利用红色荧光Ca2+指示剂染料对脑组织切片中GFP标记的神经元进行Ca2+信号成像的最新进展。...

对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

来源： Lark, A. R., et. al.，基于生物发光钙指示剂GFP-aequorin的活体功能脑成像方法。 J. Vis. Exp.

用于研究钙瞬变的生物发光成像 果蝇 脑结构

凭借其微小透明的身体、详尽记录的神经解剖结构，以及一系列适用的遗传学技术和试剂， 秀丽隐杆线虫 是理想的模式生物 体内...

体内 神经元钙成像在 C. elegans 中的应用

衰老过程中细胞内 Ca2+ 重塑可能引起兴奋性毒性及神经元损伤，这些过程由 Ca2+ 超载介导。本研究旨在利用荧光和生物发光成像技术，对大鼠海马神经元长期培养模型（一种神经元衰老模型）中胞质和线粒体 Ca2+ 的动态变化进行检测，以探究衰老脑组织中的 Ca2+...

衰老海马神经元中亚细胞钙离子（Ca2+）的荧光与生物发光成像

本文描述了一种实验方案 离体 钙成像 果蝇...

离体 用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像 果蝇

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。...

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

本方案详细介绍了如何实施和进行多光纤光度记录，如何校正钙离子非依赖性伪影，以及双色光度成像的重要注意事项。...

用于记录自由活动动物神经活动的多光纤光度法

本方案介绍了在麻醉小鼠中获取和分析脑包被周细胞的荧光钙成像以及邻近血管血流数据的步骤。这些技术可用于壁细胞生理学研究，并可调整用于研究任何细胞类型的钙瞬变。...

转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本文介绍了一种详细的实验方案，利用共聚焦显微镜检测表达GCaMP钙指示剂的转基因斑马鱼脑区中神经活动的方法。...

体内 共聚焦荧光成像技术用于观察部分固定幼年斑马鱼在感觉刺激下诱导的神经活动

学习利用GFP-aequorin生物发光成像技术对黑腹果蝇进行深层脑区钙信号长期成像的方法。该技术无需激光激发，可避免光漂白和光毒性，为神经生物学研究提供重要的基础脑活动数据。

在体实验基于生物发光钙指示剂GFP-aequorin的功能性脑成像方法

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