在基于生物发光钙指标GFP的水母体内脑功能成像方法

生物发光成像的总体目标是在更长的时间内对体内功能性钙瞬变（活动的代表）和大脑深部结构进行成像。这种方法可以帮助回答神经生物学领域的关键问题，例如苍蝇大脑在睡眠期间的基础活动是什么样的。这种技术的主要优点是它不需要使用激光激发。

与传统的钙成像相比，这使我们能够对钙瞬变更深地进入组织进行成像，并且持续时间更长，而不会出现光漂白和毒性。这种方法可以深入了解果蝇的基底脑活动，也可以与其他模式生物（如小鼠）一起使用。首先，准备感兴趣的黑腹果蝇系和实验解决方案，如随附的文本协议中所述。

然后，通过将单个果蝇转移到冰上的玻璃瓶中 2 分钟来冰麻醉单个果蝇。接下来，将果蝇移至冷藏的培养皿中，并使用一对镊子轻轻地将果蝇放入 1000 微升移液器吸头内，修剪使吸头呈约 35 度角。使用刷子轻轻推动并对齐每只苍蝇，使头部完全超过尖端边缘，并且背部区域部分暴露。

然后，将准备好的牙科胶水从头部涂抹到移液器吸头边缘。要格外小心，避免头顶。头部的粘合至关重要，因为将其固定在正确的位置对于成功的解剖和成像至关重要。

此外，粘合不良会导致林格溶液泄漏和样品在成像前死亡。接下来，将移液器吸头和附带的门襟穿过记录室的孔，然后轻轻按压以将其固定到位。然后使用准备好的硅胶固定腔室与移液器吸头相接的平坦侧，以防止任何泄漏。

将一根水龙头贴在大量通道、短边缘并延伸到腔室的背面。接下来，将装有苍蝇的腔室放在显微镜下并打开荧光灯。然后，将 1 毫升林格溶液移液到腔室中。

使用细手术刀，从苍蝇的头部后部到两侧的前鼻区域做平行的切口。然后，沿着眼睛的边缘切开，并在连接先前切口的天线上方做一个垂直的切口。在后脑勺做一个最后的切口，然后用一对细而锋利的镊子去除角质层。

轻轻抓住并清除任何暴露的呼吸道组织，直到清楚地看到大脑和荧光蘑菇体。接下来，使用超锋利的镊子小心地抓住并捏住覆盖大脑的神经上皮组织，将其去除，以便腔肠素渗透。使用移液管，用 1 毫升林格溶液洗涤组织两次，以去除解剖留下的任何碎屑，然后将样品放入暗盒中。

接下来，将含有 5 微摩尔苄基腔肠素的 1 毫升林格溶液移液移液到腔室中。盖上盒子，将样品在室温下孵育至少两小时。首先打开计算机中的显微镜。

此外，将相机冷却至负 80 摄氏度。接下来，设置排水系统并将环境控制调整到 20 摄氏度。接下来，打开 Photon 成像器，创建一个新文件夹，并命名第一个记录。

然后，通过将氯化钾、尼古丁和林格溶液添加到各自的储液器中来设置充注系统。调整流量，使每种溶液以每分钟 2 毫升的速度排出。接下来，将样品放在显微镜下方的支架上，并将放大倍数调整至 5 倍。

然后，通过穿刺将 profusion 管插入通道。将显微镜设置为荧光模式，然后将蘑菇体居中并聚焦。蘑菇体聚焦后，将放大倍数更改为 20 倍。

将图像重新居中并调整焦点。接下来，将引流装置放在排水池上方并调整排水分流器的高度，使尖端刚好位于排水池上方。然后，用林格溶液冲洗样品 30 秒，以检查引流是否充分。

最后，拉下防护罩以密封设备免受任何外部光线的影响。使用 Photon Imager 程序中的自动化系统，对焦点进行微调，并拍摄蘑菇体的参考荧光图像。将光子速度调整为所需的录制速度，该速度应为每 50 毫秒一张图像到每秒一张图像，或更高。

然后，选择 photon 模式，并打开快门。接下来，在日志条目中输入基因型、性别、年龄和样本编号。通过单击框并将其拖动到适当的位置，同时按住 Control 键，调整花萼、细胞体和内叶上感兴趣区域框的位置。

现在，记录基线值大约 5 到 10 分钟。接下来，打开开关以开始尼古丁的流动。同时，按 Enter 并添加一个注释以表示尼古丁的流动已经开始。

一分钟后，停止流，并在日志中再次记下，表示流已停止。然后，用林格溶液洗涤样品 5 分钟。样品恢复后，关闭清洗液，将计时器再设置五分钟，然后准备开始氯化钾流路。

准备开始时，开始氯化钾流路，并在样品日志中输入 100 毫摩尔氯化钾启动。1 分钟后，停止流速，并在样品日志中输入 potassium-chloride shut-off"。然后，用林格溶液洗涤样品 1 分钟，并将显微镜切换到荧光模式。

拍摄最终荧光图像，然后关闭林格溶液并取出样品。在分析程序中，打开第一个文件，选择显示控件"选项卡，然后单击 ROI。然后，按住 Ctrl 键并选择感兴趣的区域。

接下来，调整 ROI 的大小、方向和形状，以包括 GFP 照射的花萼和细胞体，以及内叶。添加所有感兴趣区域后，选择电影"选项卡播放光子视频。根据需要调整第二个宽度和第二个步长。

然后根据需要重新调整 ROI 位置，使其保留在视频中的活动区域内。选择 GFP 荧光、尼古丁响应和氯化钾响应的一些代表性屏幕截图。然后裁剪屏幕截图并将代表性图像粘贴到演示幻灯片中，以便后期分析和比较。

将 second width 和 second step 调整为以秒为单位的录制速度。此外，通过将顶部面板中的灰色标记移动到括号区域、刺激开始之前和响应结束之后来选择分析的长度。接下来，选择暂停视图"，然后按倒带按钮将视频播放重置为开头，然后按播放按钮。

然后，选择 Tab 计数率图表"以调整单位并根据需要调整感兴趣区域的颜色以及线条颜色。分析完成后，选择 Export count rate data （导出计数率数据）。然后，选择花萼和细胞体的组合记录，以及来自每侧内侧叶区域的记录，并将这些图像粘贴到带有响应图像的幻灯片中。

刺激蘑菇体的最简单方法之一是激活离子型烟碱乙酰胆碱受体。对 25 微摩尔尼古丁的典型反应（如此处所示）始于花萼和细胞体以及内侧叶的快速激活，并使用融合的 GFP-水母发光蛋白构建体，它与钙结合并发光。通常，花萼和细胞体中的响应持续时间更长，并且表现出比裂片更大的生物发光响应，如响应的序列面板所示。

该图描述了随时间变化的生物发光对烟碱活化反应的样本记录，其中包含花萼和细胞体的感兴趣区域中的光子数以黑色表示，内叶区域内的光子数以红色表示。从该图中，可以确定响应的长度、响应期间的峰值光子值以及每条曲线下的总面积。一旦掌握，准备阶段在孵化前只需两个小时，具体取决于果蝇的数量。

此外，如果执行得当，每次录制都可以在短短 20 分钟内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住正确老化和保持苍蝇库存，以确保样品之间的可重复性。按照此过程，可以执行进一步的行为测试以回答其他问题，例如结构的活动对特定行为的影响。

这项技术的发展为神经生物学领域的研究人员探索果蝇大脑中的长期神经活动铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何制备用于果蝇大脑生物发光成像的样品有很好的了解。不要忘记尼古丁可能对您的健康有害。

在制备溶液或清理此程序时，应采取预防措施，例如手套。