在体实验 基于生物发光钙指示剂GFP-aequorin的功能性脑成像方法

生物发光成像的总体目标是对体内功能性的钙瞬变（作为神经活动的指标）进行长时间、深部脑区的成像。该方法有助于回答神经生物学领域的一些关键问题，例如果蝇大脑在睡眠期间的基础活动状态。该技术的主要优势在于无需使用激光进行激发。

这使得人们能够在不产生光漂白和毒性的情况下，对组织更深层的钙瞬变进行更长时间的成像，相较于传统的钙成像方法具有优势。该方法可揭示黑腹果蝇的基础脑活动，也可应用于其他模式生物，例如小鼠。首先，按照随附的文字版实验方案，准备所需的黑腹果蝇品系及实验用溶液。

然后，将一只果蝇转移至置于冰上的玻璃小瓶中，冰上麻醉两分钟。接着，将果蝇移至预冷的培养皿中，用一对镊子轻轻将其放入已修剪过的1000微升移液枪头内，修剪时使枪头末端呈约35度角。使用毛刷轻轻推动并调整每只果蝇，使其头部完全越过枪头边缘，且背部区域部分暴露。

然后，从头部开始沿移液管尖端边缘涂抹已准备好的牙科胶。需格外小心，避免接触头部的冠部。头部的粘附至关重要，因为将其固定在正确位置对于成功进行解剖和成像十分关键。

此外，粘合不良会导致林格溶液泄漏，并在成像前造成样品死亡。接下来，将带有果蝇的移液管尖端从记录室的孔中穿过，并轻轻按压以固定到位。然后使用预先准备好的硅胶将记录室的平面侧与移液管尖端接触处密封，以防止任何泄漏。

将一段胶带贴在灌注通道上，覆盖短边并延伸至腔室背面。接着，将带有果蝇的腔室置于显微镜下，并打开荧光灯。然后，用移液器向腔室内加入一毫升任氏液。

使用精细的手术刀，从果蝇头部后端向两侧的触角区域做平行切口。然后沿眼睛边缘切割，并在触角上方做一个垂直切口，连接先前的两条切口。最后在头部后方再做一次切口，随后使用一对精细且锋利的镊子去除已切开的角质层。

轻轻夹住并清除暴露的呼吸组织，直至清晰看到脑组织和发出荧光的蘑菇体。接下来，使用超锐利镊子小心夹住并捏住覆盖在脑组织上的神经上皮组织，将其移除，以便海肾素能够渗透。用移液器加入一毫升林格溶液，洗涤组织两次，以去除解剖过程中残留的任何碎屑，然后将样品放入暗盒中。

接下来，将含有5 µM苯甲基腔肠素的1毫升林格溶液用移液器加入到样品室中。关闭盒子，并在室温下孵育样品至少两小时。首先打开计算机中的显微镜系统。

此外，将相机冷却至负80摄氏度。接下来，设置排水系统，并将环境控制调节至20摄氏度。然后，打开光子成像仪，创建一个新文件夹，并命名第一次记录。

然后，通过将氯化钾、尼古丁和任氏液分别加入各自的储液槽中来设置灌流系统。调节流速，使每种溶液以每分钟2毫升的速度流出。接着，将样品放置在显微镜下的载物台上，并将放大倍数调节至5倍。

然后，通过穿刺处将灌注管插入通道。将显微镜设置为荧光模式，居中并使蘑菇体对焦。一旦蘑菇体对焦清晰，将放大倍数调整为20倍。

重新居中图像并调节焦距。接着，将引流装置置于引流池上方，并调节引流管的高度，使管尖刚好位于引流池上方。然后用林格液冲洗样本 30 秒，以检查引流是否充分。

最后，拉下遮光罩以屏蔽外部光线对装置的干扰。利用光子成像程序中的自动化系统，精细调节焦距，并对蘑菇体拍摄一张参考荧光图像。将光子采集速度调整至所需的记录速度，范围可设置为每50毫秒至每秒或更长时间采集一幅图像。

然后，选择光子模式并打开快门。接下来，在日志条目中输入基因型、性别、年龄和样本编号。通过按住控制键并单击拖动，调整感兴趣区域框的位置，使其覆盖花萼、细胞体和内侧叶。

现在，记录大约 5 到 10 分钟的基础值。接下来，打开开关以开始尼古丁的流动。同时，按下回车键并添加备注，以标明尼古丁流动已开始。

一分钟后，停止灌流，并在记录本中再次注明灌流已停止。随后用任氏液冲洗样品五分钟。在样品恢复期间，关闭冲洗，将计时器设定为额外五分钟，并准备开始氯化钾溶液的灌流。

准备就绪后，开始通入氯化钾溶液，并在样品记录中输入“100 毫摩尔氯化钾开始”。一分钟后，停止溶液流动，并在样品记录中输入“氯化钾关闭”。随后，用任氏液冲洗样品一分钟，并将显微镜切换至荧光模式。

拍摄最终的荧光图像，然后关闭灌流液并取出样品。在分析程序中，打开第一个文件，选择“显示控制”选项卡，然后点击 ROI。接着按住 Control 键并选择一个感兴趣区域。

接下来，调整感兴趣区域（ROI）的大小、方向和形状，以覆盖GFP荧光标记的壶腹和细胞体，以及内侧叶。当所有感兴趣区域添加完毕后，选择“视频”标签页以播放光子视频。根据需要调整第二宽度和第二步长。

然后根据需要重新调整感兴趣区域（ROI）的位置，确保其始终位于视频中的活性区域范围内。选取一些具有代表性的GFP荧光、尼古丁反应以及氯化钾反应的截图。随后裁剪这些截图，并将代表性图像粘贴至演示文稿幻灯片中，用于后续分析与比较。

将第二个宽度和第二步均调整为以秒为单位的录制速度。然后，通过移动上方面板中的灰色标记，选择分析区间，使其位于刺激开始前以及反应结束后的括号区域内。接着，选择播放时“暂停视图”，然后按下 rewind 按钮将视频回放重置到起始位置，再按下播放按钮。

然后，选择“计数率图表”选项卡，以调整单位，并根据需要调整感兴趣区域的颜色以及线条颜色。分析完成后，选择导出计数率数据。接着，选择壶腹和细胞体的合并记录，以及两侧内侧叶区域的记录，将这些图像粘贴到包含反应图像的幻灯片中。

刺激蘑菇体最简单的方法之一是通过激活离子型烟碱乙酰胆碱受体。此处显示的是对25微摩尔尼古丁的典型反应，该反应首先快速激活萼区和细胞体以及内侧叶，实验中使用了融合的GFP-水母发光蛋白（GFP-aequorin）构建体，该蛋白可结合钙离子并发光。通常情况下，萼区和细胞体的反应持续时间更长，且生物发光反应强度高于叶部，如反应序列图中所示。

该图描述了随时间变化的烟碱激活引起的生物发光反应的一个示例记录，其中包含卡氏体和细胞体的兴趣区域内的光子数以黑色表示，内侧叶区域内的光子数以红色表示。从该图中可以确定反应持续时间、反应期间的峰值光子数以及每条曲线下方的总面积。一旦熟练掌握，根据果蝇数量的不同，孵育前的制备阶段仅需两个小时。

此外，如果操作得当，每次记录可在短短二十分钟内完成。在进行该实验步骤时，重要的是要正确地饲养并维持果蝇品系的代数，以确保样品间的可重复性。在完成该步骤后，可进一步开展其他行为学实验，以回答更多问题，例如该结构的活动对特定行为会产生何种影响。

该技术的发展为神经生物学领域的研究人员探索果蝇大脑中的长期神经活动铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何为果蝇大脑的生物发光成像准备样品。请务必注意，尼古丁可能危害您的健康。

配制溶液或清理本实验操作时，应采取戴手套等防护措施。