Name: 功能互补分析（FCA）:实验室练习设计和实施，以补充生化途径的教学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习功能互补分析（FCA）技术，通过将功能基因导入突变细菌细胞来验证酶活性，恢复野生型表型。该方法适用于氨基酸代谢和肽聚糖生物合成等生化途径研究，为酶功能鉴定提供可靠的体内实验手段。

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AOH 和 MAS 感谢罗切斯特理工学院理学院以及托马斯·H·戈斯内尔生命科学学院提供的支持。本工作部分得到了美国国家科学基金会（NSF）授予 AOH 的项目 MCB-1120541 资助。

注意：作者愿意提供细菌菌株和重组质粒，以帮助有兴趣的人员将功能互补分析纳入教学。用于辅助功能互补实验的质粒列于表1中。
1. 功能互补实验质粒的构建
<ol>
	<li>二氨基庚二酸氨基转移酶（dapL）的克隆及其功能互补研究
	<ol>
		<li>从 dapL 开放阅读框（ORF）扩增 V. spinosum 和来自 cDNA 的 A. thaliana 和 C. reinhardtii 通过PCR进行。先在94 °C下进行1个循环，持续2分钟，随后进行30个循环：94 °C 15秒、60 °C 30秒、72 °C 2分钟。每个引物使用12 pmol，MgSO₄浓度为1 mM。4，0.5 mM 的 4 种脱氧核苷三磷酸，0.5 ng 模板 DNA 和 1 单位 Pfx DNA聚合酶 
		注意：有关从植物中克隆三个 dapL 直系同源基因的完整描述 A. thaliana (在-dapL），该细菌 Verrucomicrobium spinosum (与-dapL）和藻类 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，Cr-dapL）此前已有发表。2,18-20 
		注意：用于克隆 dapL 直系同源物的引物如下： 
		与dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3' 
		与dapL R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3' 
		在dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3' 
		在dapL R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3' 
		CrdapL F-5'-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC-3' 
		CrdapL R-5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3'</li>
		<li>将PCR片段克隆至质粒pET30A中，以构建重组质粒pET30A::与dapL, pET30A::在dapL 和 pET30A::Cr使用引物、限制性内切酶和T4 DNA连接酶对dapL进行操作。
		<ol>
			<li>简而言之，将50 ng插入片段和20 ng载体与1x连接酶缓冲液及1单位T4 DNA连接酶混合，于17 °C过夜孵育。将连接产物转化至 E. coli Dh5α 细胞并在添加了 50 µg/ml 的 LB 平板上筛选菌落−1 卡那霉素，37 °C 培养 24 小时。18-20</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为了构建用于功能互补的质粒，用限制性内切酶消化 pET30A::与dapL 和 pET30A::在使用限制性内切酶 XbaI 和 SalI 以及 XbaI 和 HindIII 对 dapL 质粒进行双酶切，用于 pET30A::CrdapL。使用T4 DNA连接酶将插入片段连接到质粒pBAD33中，以构建质粒pBAD33::与dapL；pBAD33::在dapL 和 pBAD33::CrdapL
		<ol>
			<li>将50 ng插入片段和20 ng载体在1×连接酶缓冲液中与1单位T4 DNA连接酶于17 °C过夜孵育。将连接产物转化至 E. coli Dh5α 细胞并在添加 34 µg/ml 的 LB 平板上筛选菌落−1 37 °C 培养 24 小时以筛选卡那霉素。20</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酪氨酸氨基转移酶（tyrB）的克隆 拟南芥 用于功能互补。 
	注意：有关从cDNA克隆的完整细节，请参见 A. thaliana 之前已通过基因位点标签 At5g36160 进行注释。4 
	<ol>
		<li>通过PCR扩增cDNA。程序为：94 °C预变性2 min，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C变性15 sec、60 °C退火30 sec和72 °C延伸2 min。每个反应体系中加入12 pmoles的正向和反向引物，1 mM MgSO₄。4，0.5 mM 的四种脱氧核苷三磷酸，0.5 ng 模板 DNA 和 1 单位 Pfx DNA聚合酶 
		注意：克隆 At5g36160 所用的引物序列如下： 
		在tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3' 
		AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3'</li>
		<li>将PCR片段用EcoR1和Sal1酶切后，克隆至质粒pET30A中，构建重组质粒pET30A::At5g36160；使用T4 DNA连接酶将片段连接入pET30A，具体步骤如下所述。4</li>
		<li>使用限制性内切酶 XbaI 和 HindIII 消化 pET30A::At5g36160，将所得片段通过 T4 DNA 连接酶连接至经相同限制性内切酶位点线性化的 pBAD33 载体中，构建重组质粒 pBAD33::At5g3160。
		<ol>
			<li>将50 ng插入片段和20 ng载体在1×连接酶缓冲液中与1单位T4 DNA连接酶于17 °C过夜孵育。将连接产物转化至 E. coli Dh5α细胞并在添加34 µg/ml的LB平板上筛选菌落−1 37 °C 培养 24 小时以处理氯霉素。4</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>UDP-克隆N乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸-中脑-2,6-二氨基庚二酸连接酶（murE）来自 V. spinosum 用于功能互补。 
	注意：从murE ORF的克隆 V. spinosum 此前已有描述。18
	<ol>
		<li>通过PCR扩增开放阅读框。使用以下程序：94 °C预变性2 min，随后进行30个循环，每个循环包括94 °C变性15 sec、60 °C退火30 sec和72 °C延伸2 min。每反应加入12 pmol的正向和反向引物，1 mM MgSO₄。4，0.5 mM 的四种脱氧核苷三磷酸，0.5 ng 模板 DNA 和 1 单位 Pfx DNA聚合酶。然后克隆至质粒pET100D中，以构建质粒pET100D::与murE 
		注意：用于克隆的引物 与murE 如下： 
		与MurE F- 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3' 
		VsMurE R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3'</li>
		<li>为了构建用于功能互补的质粒，用限制性内切酶消化 pET100D::与murE 
		使用限制性内切酶 XbaI 和 SalI 将插入片段连接至 pBAD33 载体中，以构建重组质粒 pBAD33::Vs使用T4 DNA连接酶进行murE连接。
		<ol>
			<li>将50 ng插入片段和20 ng载体与1单位T4 DNA连接酶一同置于1×连接酶缓冲液中，17 °C过夜孵育。将连接产物转化至 E. coli Dh5α 细胞并在添加 34 µg/ml 的 LB 平板上筛选菌落−1 37 °C 培养 24 小时以处理氯霉素。8</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>relA基因的克隆spoT (rsh) 来自 新鞘氨醇单胞菌属 sp 用于功能互补。 
	注意：rsh 的克隆来自 Novosphingobium sp. 此前已有描述。17 
	<ol>
		<li>通过PCR扩增rsh ORF以及起始密码子上游599个核苷酸和终止位点下游46个核苷酸的序列。反应条件为：94 °C预变性2 min，随后进行30个循环，每循环包括94 °C变性15 sec、60 °C退火30 sec和72 °C延伸2 min。每条引物用量为12 pmol，MgSO₄终浓度为1 mM4，0.5 mM 的四种脱氧核苷三磷酸，0.5 ng 模板 DNA 和 1 单位 Taq DNA 聚合酶。然后克隆至质粒 pCR2.1 中，构建 pCR2.1::Nsprsh
		<ol>
			<li>将1 µl扩增的PCR片段、1 µl pCR2.1载体、1 µl盐溶液和1 µl水混合，25 °C孵育5分钟，加入2 µl连接反应混合物 E. coli 细胞，并在添加了50 µg/ml的LB平板上筛选菌落−1 37℃孵育卡那霉素 °C 下孵育 24 小时。 
			注意：用于 rsh 克隆的引物如下： 
			rsh F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3' 
			rsh R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3'</li>
			<li>为了进行功能互补，用酶切消化质粒 pCR2.1::Nsp用 EcoR1 消化 rsh 并将插入片段连接至广宿主范围质粒 pRK290，构建重组质粒 pRK290::Nsp使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
			<ol>
				<li>将50 ng插入片段和20 ng载体在1×连接酶缓冲液中与1单位T4 DNA连接酶于17 °C过夜孵育。将连接产物转化至 E. coli Dh5α 细胞，并在添加 10 µg/ml 的 LB 平板上筛选菌落−1 37℃孵育四环素 °C 下孵育 24 小时。17</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 制备电转感受态细菌细胞以促进转化
注意：电转感受态细胞的制备基于1.0 L培养物体积的方案26，该方案可按比例缩小至较小体积即， 250 ml）。请注意，本方案可用于制备本文所述的所有菌株的感受态细胞，以促进FCA。22
<ol>
	<li>将单个菌落接种到50 ml液体培养基中，于锥形瓶中过夜培养，并确保在开始此步骤前核对突变体的基因型（表2）。</li>
	<li>第二天，将50 ml过夜培养物接种至1.0 L适宜培养基中（E. coli突变体使用LB培养基，Novosphingobium sp使用PD培养基），在30 °C下培养至OD600达到0.4–0.6（对数生长期）。</li>
	<li>在4 °C下以5,000 × g离心15分钟收集细胞，弃去上清液，并将沉淀重悬于500 ml无菌冰预冷的纯H2O中。</li>
	<li>在4 °C下以5,000 × g离心20分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于250 ml无菌冰预冷的10%甘油溶液中。</li>
	<li>在4 °C下以5,000 × g离心20分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于2.0 ml 10%甘油溶液中。</li>
	<li>将细胞分装至微量离心管中，每管50 µl，立即置于干冰-乙醇浴中速冻。将感受态细胞于-80 °C保存，用于电穿孔实验。</li>
</ol>
3. 用互补质粒对细菌细胞进行电穿孔
<ol>
	<li>进行电穿孔时，将1.0 µl（10–50 ng）重组质粒加入一份50 µl的感受态细胞中，冰上放置5分钟。</li>
	<li>用移液器将混合物转移至电穿孔比色皿中，并将电穿孔仪设置为以下参数：25 µF电容、2.5 kV电压和200 Ω电阻，然后施加电脉冲。</li>
	<li>向电穿孔比色皿中加入1.0 ml复苏培养基（LB），用移液器转移至15 ml锥形管中，在摇床培养箱中轻柔振荡复苏60分钟。</li>
	<li>从复苏步骤的培养物中取100 µl，用移液器加样并使用无菌涂布棒涂布于琼脂平板上，以筛选转化子。 
	注意：在开始此步骤前，请务必查阅表1和表2，确认抗生素种类和基因型，以制备正确的琼脂平板。</li>
</ol>
4. 利用L,L-二氨基庚二酸氨基转移酶（dapL）将AOH1进行转化以实现功能互补
<ol>
	<li>进行互补分析时，分别通过第3.0节所述的电穿孔方案，将空载体（pBAD33）以及DapL表达载体转化至AOH1菌株中，进行独立的转化实验。</li>
	<li>在添加了50 µg/ml−1 DAP、34 µg/ml−1 氯霉素和50 µg/ml−1 卡那霉素的LB琼脂培养基上涂布，筛选转化子。</li>
	<li>通过影印接种法，将菌落划线接种至含有0.2%（w/v）阿拉伯糖并添加或不添加50 µg/ml−1 DAP和34 µg/ml−1 卡那霉素的LB培养基上，检测功能互补性。</li>
	<li>在30 °C下培养24小时，观察结果。 
	注意：结果应显示，与仅含载体的对照相比，该突变株只有在突变背景下表达dapL基因时，才能在不含DAP的培养基上生长。</li>
</ol>
5. 利用UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酰-D-谷氨酰-2,6-meso-二氨基庚二酸连接酶（murE）对TKL-11进行转化以实现功能互补
<ol>
	<li>按照第3.0节所述方案，将突变株分别转化空载体（pBAD33）和表达MurE的载体（pBAD33::VsmurE）。</li>
	<li>在添加了50 µg/ml−1胸腺嘧啶和34 µg/ml−1氯霉素的LB琼脂培养基上涂布并筛选转化子，于30 °C培养24小时。</li>
	<li>通过划线或涂布方式，将对照组和实验组的菌落分别接种至两组含有0.2%（w/v）阿拉伯糖和50 µg/ml−1胸腺嘧啶的LB培养基平板上，检测互补效应。</li>
	<li>将其中一个平板在30 °C培养，另一个在42 °C培养24小时，以直观评估生长表型。 
	注意：结果应显示，与仅含载体的对照相比，只有在突变株背景中表达murE基因时，突变株才能在42 °C生长。</li>
</ol>
6. 利用酪氨酸氨基转移酶（tyrB）对DL39进行转化以实现功能互补
<ol>
	<li>按照第3.0节所述方案，将DL39菌株分别转化pBAD33或pBAD33::At5g36160，并在添加了50 µg/ml−1酪氨酸、50 µg/ml−1苯丙氨酸和34 µg/ml−1氯霉素的LB琼脂平板上筛选转化子。</li>
	<li>将菌落复制接种到含有50 µg/ml−1苯丙氨酸和50 µg/ml−1酪氨酸、50 µg/ml−1天冬氨酸、50 µg/ml−1亮氨酸、50 µg/ml−1缬氨酸、50 µg/ml−1异亮氨酸、10 µg/ml−1尿嘧啶、0.5% (w/v)甘油和0.2% (w/v)阿拉伯糖的最低培养基（M9）平板上。同时，通过划线方式将相同菌落复制接种到不含苯丙氨酸和酪氨酸的平板上。</li>
	<li>在30 °C下培养48小时，观察生长表型。 
	注意：结果应显示，与仅含空载体的对照相比，该突变株只有在突变背景下表达tyrB基因时，才能在不含苯丙氨酸和酪氨酸的培养基上生长。</li>
</ol>
7. 将Hx699进行转化以促进对Novosphingobium sp. 菌株Hx699低黏液表型的功能互补
<ol>
	<li>转化野生型菌株 Novosphingobium sp. (Rr2-17) 和突变体 Hx699 与 pRK290 和 pRK290::rshNsp 在两个独立的转化事件中，使用第3.0节所述的转化方案进行。</li>
	<li>将转化产物接种于添加了10 µg/ml的马铃薯葡萄糖（PD）琼脂平板上−1 四环素，并孵育至少24小时，或直至转化子出现。</li>
	<li>将两种转化产物分别划线接种于 &#34;X&#34; 在新鲜的PD琼脂平板上划线，并于30 ℃培养 在至少4天内保持在°C条件下。通过肉眼观察两块平板的生长表型，比较仅含载体的对照组，并进行实验观察。 
	注意：与仅含空载体的对照相比，当在突变体背景下表达 rsh 时，应观察到低黏液表型得到回补。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

罗切斯特理工学院的生物技术与分子生物科学课程体系中，许多课程除了授课部分外，还包含实验环节。2014-2015学年的课程体系共包含48门课程，其中29门设有实验环节，约占总课程数的60%。例如《植物生物化学与病理学基础》（FPBP）是一门融合授课与实验的课程，而《生物分离技术：原理与实践》（BPP）则是一门以实验为主的课程。
每门课程的实验部分旨在强化课堂讲授内容。例如，在FPBP和BPP课程中，重点强调了生物化学途径与代谢过程。部分主题包括氨基酸代谢、肽聚糖生物合成、植物次生代谢、细菌对环境生态位的响应等。作者在两门课程中均引入了功能互补实验作为实验教学内容，以加深学生对课堂讲授或实验前讲座中所讨论的代谢途径的理解。本文讨论了利用功能互补实验分析参与赖氨酸（lys）、肽聚糖（PG）、酪氨酸（tyr）、苯丙氨酸（phe）生化途径以及细菌严格反应相关基因功能的四个实例。
作者将这一实验模块引入课程中有多个原因。首先，功能互补分析是一种极好的教学工具，可用于强化或引入与遗传学、进化、基因组学、生物信息学和生物化学相关的知识点。其次...

在阐明基因功能/作用的研究中，功能互补是指将某个同源或直系同源基因以顺式（cis）或反式（trans）方式导入突变体背景后，该基因能够恢复具有可观察表型的突变体至野生型状态的能力。该技术已被广泛用于分离和鉴定多个基因的功能/作用。一个典型实例是利用酿酒酵母（S. cerevisiae）的ura3突变体和大肠杆菌（E. coli）的pyrF突变体，分离并鉴定白色念珠菌（Candida albicans）中的5'-磷酸核苷酸脱羧酶。1 作者在其研究项目中已应用该技术阐明了参与氨基酸代谢、肽聚糖代谢以及严谨反应相关基因的功能，并已将该技术纳入罗切斯特理工学院（Rochester Institute of Technology, RIT）生物技术与分子生物科学（BMB）教学项目中。
作者讲授罗切斯特理工学院（RIT）生物医学与生物技术（BMB）项目中的两门高年级选修实验课程：《植物生物化学/病理学基础》（FPBP，Hudson 教授）和《生物分离：原理与实践》（BPP，Hudson/Savka 教授）。由于课程中讨论的部分主题与作者的研究方向相关，因此他们已将各自研究项目中使用的技术和实验工具整合到这两门实验课程中。其中一个实例是将功能互补实验作为教学环节，以强化讲授中涉及的植物氨基酸代谢、细菌肽聚糖以及严谨反应代谢相关内容。
FPBB课程中讨论的植物三种氨基酸代谢途径分别为赖氨酸（lys）、酪氨酸（tyr）和苯丙氨酸（phe）。课程重点介绍了赖氨酸途径，因为赖氨酸对所有动物尤其是人类而言是一种必需氨基酸，而动物缺乏合成赖氨酸所需的遗传机制 从头合成此外，最近发现植物采用了一条与细菌显著不同的赖氨酸（lys）合成途径。这一发现部分得益于功能互补实验的推动 E. coli 二氨基庚二酸（diaminopimelate）dap) 突变体，利用模式植物中编码L,L-二氨基庚二酸氨基转移酶（DapL）的基因 拟南芥.2 通过中间产物二氨基庚二酸合成赖氨酸的变异途径如图所示 图1此外，赖氨酸的合成通过天冬氨酸衍生的氨基酸家族进行，该过程受到高度调控。3 除了在蛋白质合成中的重要性之外，由于酪氨酸（tyr）和苯丙氨酸（phe）作为苯丙烷类化合物生物合成前体物质的关键作用，其代谢途径也备受关注，这些苯丙烷类化合物参与植物防御物质的合成，例如：生物碱、木质素、黄酮类、异黄酮类、羟基肉桂酸等。4 tyr 和 phe 代谢途径也被特别标出，以展示植物与细菌在合成代谢途径上的差异。在细菌中，酪氨酸氨基转移酶（TyrB）参与这两种氨基酸的合成代谢；而在植物中，该酶主要参与 tyr 和 phe 的分解代谢，不参与这些氨基酸的合成代谢。图2).4
FPBP课程重点介绍了革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌在肽聚糖（PG）结构上的差异。由于大多数植物病原菌为革兰氏阴性菌，因此革兰氏阴性菌的肽聚糖在植物病理学中具有重要意义。最近一项关于十大细菌植物病原菌的综述显示，所有这些病原菌均为革兰氏阴性菌，分别属于以下属：Pseudomonas、Ralstonia、Agrobacterium、Xanthomonas、Erwinia、Xylella、Dickeya 和 Pectobacterium5。比较革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌肽聚糖肽链结构时，一个化学差异体现在两类细菌肽聚糖交联所用的氨基酸不同。这种交联差异的初始步骤发生在肽聚糖合成的细胞质阶段，由酶UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸-meso-2,6-二氨基庚二酸连接酶（MurE）催化完成（图3A）。MurE催化在肽链第三个位置添加特定的二胺化合物6。在大多数革兰氏阴性菌中，倒数第二个赖氨酸前体meso-二氨基庚二酸（m-DAP）作为交联氨基酸，而在大多数革兰氏阳性菌的肽聚糖中，赖氨酸（lys）则发挥相同的交联作用（图3B）7。这是因为m-DAP和lys均含有两个氨基，能够形成两个肽键，从而实现肽链之间的交联。
在生物分离：原理与实践（BPP）课程中，讨论了用于细菌培养的开放系统与封闭系统之间的差异，以及由于环境变化，两种系统中营养水平将发生显著变化的情况。这些事件与由营养匮乏或氨基酸及能量充足供应所触发的称为“&#34;降移&#34;或“&#34;升移&#34;的调控变化相关联。“&#34;降移&#34;反应可能发生在将细菌培养物从富含营养的复杂培养基转移至仅含单一碳源的化学成分明确培养基时。这种环境变化会导致tRNA和rRNA合成迅速停止。尽管氨基酸的生物合成被上调，但这种合成停止仍会导致核糖体缺乏，进而导致蛋白质和DNA合成受阻。
随后 &#34;向下移动&#34; 应答过程中，现有的核糖体被用于产生新的酶，以合成培养基或环境中不再可获取的氨基酸。经过一段时间后，rRNA合成完成并组装出新的核糖体，细菌细胞群体开始生长，尽管生长速率有所降低。这一系列事件被称为 &#34;严谨应答&#34; 或 &#34;严格控制&#34; 是细胞全局性调控的一个范例，可被视为一种通过调节细胞生物合成机制以适应底物供应和能量需求变化的机制。8 因此，严谨反应使细菌能够快速响应环境中营养物质的波动，并有助于增强细菌在营养物或底物可利用性快速变化的环境中竞争的能力。8-9 
严谨反应在氨基酸、碳、氮、磷酸盐和脂肪酸供应受限时，在基因表达中具有重要作用。8,10-14 这种严格反应由两种核苷酸——四磷酸鸟苷（ppGpp）和五磷酸鸟苷（pppGpp）共同调控，二者通常合称为 警报素 (p)ppGpp。例如，当氨基酸受限时——这可能导致蛋白质合成受阻——细胞内会积累一种称为警报素的鸟苷-3,5-二磷酸（ppGpp），它由鸟苷-3-二磷酸-5-三磷酸（pppGpp）的代谢生成。细胞内(p)ppGpp水平的变化参与调控一系列基因的表达，这些基因负责调控细胞对环境中底物缺乏的应答，而这些底物直接参与细胞的生长与发育。参与该过程的两个基因为relA和spoT。RelA是一种与核糖体结合的(p)ppGpp合成酶，参与响应因氨基酸缺乏而导致的未荷载tRNA的积累。SpoT具有双重功能，既可作为(p)ppGpp合成酶，也可作为水解酶；其合成酶活性参与应对碳源缺乏及脂肪酸饥饿。8 RelA/SpoT同源蛋白在植物和细菌中广泛存在，被称为Rsh RelA/SpoT h同源物。8,10-12,16 最近一项研究显示，细菌中存在一种特定的 Rsh 蛋白参与这些警报素的合成 新鞘氨醇单胞菌属 sp Rr 2-1717
本文介绍了与功能互补实验相结合的四条生物化学途径。本论文概述的互补实验为利用这种体内实验方法提供了途径，可用于鉴定或表征功能未知/假定的酶，也可作为教学工具，辅助生物化学途径的教学。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 突变株</td><td>Hudson/Savka 实验室或 CGSC（http://cgsc.biology.yale.edu/）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Biorad-USA</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Biorad-USA</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>温控培养箱</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>通用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12795084</td><td></td></tr><tr><td>M9 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63011</td><td></td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖培养基</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>DF0013-15-8</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>二氨基庚二酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92591</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>酪氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>苯丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>缬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>异亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>阿拉伯糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10342-020</td><td></td></tr><tr><td>Platinum pfx DNA 聚合酶</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11708-013</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15224-041</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Dh5-alpha</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Top10</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C4040-03</td><td></td></tr><tr><td>pET100D/topo 载体</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>K100-01</td><td></td></tr><tr><td>pCR2.1 载体</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>K2030-01</td><td></td></tr></tbody></table>

功能互补分析（fca）：一种设计并实施用于辅助生化途径教学的实验课程

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

功能互补实验（FCA）是一种广泛用于阐明基因/酶功能的体内实验方法。该技术在生物化学、遗传学以及许多其他学科中非常常见。本文报道了该技术的全面概述，以辅助氨基酸、肽聚糖及细菌严谨反应相关生化途径的教学。重点介绍了模式植物Arabidopsis thaliana中的两个cDNA，它们分别参与赖氨酸代谢（L,L-二氨基庚二酸氨基转移酶（dapL））以及酪氨酸和苯丙氨酸代谢（酪氨酸氨基转移酶（tyrB））。此外，通过分析细菌Verrucomicrobium spinosum中参与肽聚糖交联的UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰-meso-2,6-二氨基庚二酸连接酶（murE）基因，阐述了细菌肽聚糖合成途径。还通过分析细菌Novosphingobium sp.中负责高黏液表型的rsh（relA/spoT homolog）双功能基因，报道了细菌的严谨反应。本文展示了四个FCA实例，视频将重点介绍其中三个，即赖氨酸、肽聚糖和严谨反应。

用于各种功能互补分析的细菌菌株列于表2中。
功能互补分析：L,L-二氨基庚二酸氨基转移酶（dapL）
E. coli 双重突变株 AOH1（ΔdapD::Kan2, dapE6）在 dapE 基因中存在突变，并完全缺失 dapD 基因（图1）。因此，该突变株只有在提供二氨基庚二酸（DAP）的情况下才能生长。由于这些突变，AOH1 被认为是营养缺陷型。AOH1 适用于 L,L-二氨基庚二酸氨基转移酶（DapL）同源物的功能互补分析，因为 DapL 能够催化四氢去氧庚二酸（THDP）直接合成 L,L-二氨基庚二酸，从而促进肽聚糖（PG）和赖氨酸（lys）的合成（图1...

利用功能互补分析（FCA）可以阐明生物化学途径中酶活性的验证。本文描述了FCA检测方法，用于验证参与氨基酸代谢、细菌严格反应以及细菌肽聚糖生物合成的酶的酶活性。

功能互补分析（FCA）：一种设计并实施用于辅助生化途径教学的实验课程

功能互补实验（FCA）是一种广泛用于阐明基因/酶功能或作用的体内实验方法。该技术非常……

功能互补实验的总体目标是通过将相应基因的功能性拷贝导入突变细胞中，观察其是否能在突变背景下恢复野生型表型，从而阐明某种酶的活性。该方法有助于回答生物化学、微生物学、遗传学、植物生物学、进化等多个领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，它能够在通常具有生理性质的体内条件下评估酶的功能、活性和/或作用，而不同于通常为人工环境的体外条件。该技术的意义在于有助于识别和/或阐明尚未明确表征的酶的功能，以及仍具有假设性或预测性功能的酶。本实验的功能互补操作由生物技术与分子生物科学专业学生、我实验室的泰勒·哈克尼斯（Taylor Harkness）演示。根据文本方案完成 DapL、TarB、MurE 和 RSH 基因的克隆后，用单个突变细菌菌落接种 50 毫升液体培养基，用于转化目的基因，并过夜培养。第二天，用50毫升过夜培养物接种1升合适的培养基，在30摄氏度下培养至对数生长期，或培养至OD600为0.4至0.6。在4摄氏度下以5,000 × g离心15分钟收集细胞。然后倒掉上清液，加入500毫升无菌、冰冻的蒸馏水重悬沉淀。再次离心细胞，弃去上清液后，加入250毫升无菌、冰预冷的10%甘油重悬沉淀。最后一次离心细胞后，用2毫升10%甘油重悬细胞。将50微升分装液转移至微量离心管中，并立即放入干冰乙醇浴中快速冷冻。将细胞在负80摄氏度下保存，用于电穿孔。进行电穿孔时，向50微升感受态细胞中加入1微升重组质粒，冰上放置5分钟。将细胞转移至电穿孔比色皿中，并将电穿孔仪设置为以下参数：25度 Fahrenheit 电容、2.5千伏和200欧姆电阻。然后将比色皿放入仪器中，施加一个电脉冲。向比色皿中加入1毫升复苏培养基，将细胞转移至15毫升锥形管中。将细胞置于摇床培养箱中，在适合该突变株的温度下，以温和转速振荡培养60分钟，使其恢复。为筛选转化子，用移液器吸取100微升培养物滴加到含琼脂平板的培养基上，并使用无菌涂布棒将溶液均匀涂布。然后在适当的温度下过夜培养。更多细节请参见文字版实验方案。为了进行互补分析，通过电穿孔将空载体pBAD33或dapL表达载体转化至AOH1中，方法如前所述。将转化混合物涂布于LB琼脂培养基上，培养基中添加50 µg/mL二氨基庚二酸（Dap）、34 µg/mL氯霉素和50 µg/mL卡那霉素。将平板置于30 °C培养24小时后观察结果。使用空载体 pBAD33 或表达 murE 的载体，通过本视频前面演示的电穿孔法转化 TKL-11 突变株。将转化子涂布于 LB 琼脂平板上，平板中添加 50 微克/毫升硫胺素和 34 微克/毫升氯霉素，在 30 摄氏度下孵育 24 小时后检查转化子生长情况。通过划线或涂布的方法，将对照组和实验组转化所得的菌落分别接种到两块含有 0.2% 阿拉伯糖和 50 微克/毫升硫胺素的 LB 培养基平板上，以检测互补效应。将一个平板在30摄氏度下孵育，另一个平板在42摄氏度下孵育，24小时后观察生长表型。将新鞘氨醇菌属（novosphingobium）的突变株Hx699和野生型Rr217分别与pRK290空载体或含有天然rshNsp基因的载体进行转化，每种菌株各进行两次独立的转化实验，具体操作如本视频前面部分所示。将转化子接种于添加了10 µg/mL四环素的马铃薯葡萄糖琼脂（PD琼脂）平板上，孵育至少72小时，或直至转化子菌落可见。然后，用四环素新鲜的 PD 琼脂平板以 X 型划线法接种转化子。在 30 °C 下培养至少四天后，肉眼观察两个平板的生长表型。大肠杆菌双突变株 AOH1 在 DapE 基因中存在突变，并缺失 DapD 基因，因此除非提供 Dap，否则无法生长。如图所示，表达 DapLs 的 AOH1 突变体能够通过 Dap 溶解途径将 THDP 转化为 LLDap，从而在不含 LLDap 的培养基上生长。MurE 酶促进 m-DAP 掺入革兰氏阴性菌的肽聚糖中。大肠杆菌 MurE 突变体 TKL-11 在 42 摄氏度下无法生长。在此实验中，只有携带 MurE 的 TKL-11 细胞能在 42 摄氏度下生长。TyrB 基因的突变会阻碍酪氨酸和苯丙氨酸的合成。然而，如图所示，当 TyrB 突变株 DL39 表达拟南芥（A.thaliana）At5g36160 基因时，其可在缺乏酪氨酸和苯丙氨酸的 M9 培养基上生长，表明该酶能够合成酪氨酸。诺卡氏菌属的 Hx699 突变体携带一种无功能的 RSH 蛋白，产生低黏液表型。然而，当该突变体转化了天然 RSH 基因后，在多细胞 X 型菌落中会产生更多的可溶性胞外多糖，呈现高黏液表型。相比之下，当 Hx699 突变体转化空载体时，则仍表现为低黏液表型。一旦掌握，该技术可在大约24至48小时内完成。若操作得当，且排除克隆、感受态制备和转化步骤，具体时间取决于所用模式生物的生长情况。在进行该实验时，重要的是要牢记功能互补分析中所用突变体的生长条件要求。完成此操作后，还可采用其他方法，如传统的体外公理化表征，以回答更多问题，例如底物特异性、最适温度和最适pH值、体细胞迁移速率等。该技术建立后，将为生物学及其众多分支领域（如微生物学）的研究人员阐明来自多种生物体的酶在体内的功能或作用提供重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备电转感受态细菌细胞、如何利用电穿孔法转化细菌，以及如何通过功能互补实验评估基因/酶的功能。请勿忘记，操作病原体可能具有极高危险性，必须采取必要的预防措施。

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