功能互补分析（FCA）:实验室练习设计和实施，以补充生化途径的教学
June 24th, 2016
所涉及的生化途径的酶活性的确认可以使用功能性互补分析（FCA）阐明。描述在这个手稿是FCA测定表明参与氨基酸，细菌严格的响应和细菌的肽聚糖的生物合成的代谢酶的酶活性。
功能互补论文的总体目标是通过将相应基因的功能拷贝引入突变细胞来阐明酶的活性，以查看它是否在突变背景中恢复野生型表型。这种方法可以帮助回答各个领域的关键问题，例如生物化学、微生物学、遗传学、植物生物学、进化论等。该技术的主要优点是它在体内条件下评估酶的功能、活性和/或作用，这些条件通常是生理性的，而不是体外条件，通常是人为的。
该技术的意义延伸到识别和/或阐明未表征酶的功能，以及那些仍然具有推定或预测功能的酶。生物技术和分子生物科学专业的 Taylor Harkness 演示了这种功能互补的过程，他是我实验室的一名学生。根据文本方案克隆 DapL、TarB、MurE 和 RSH 基因后，用单个突变细菌细胞菌落接种 50 毫升液体培养基，以用目标基因转化并生长过夜。
第二天，使用 50 毫升过夜培养物接种 1 升适当的培养基，并在 30 摄氏度下生长至锁定期，或 OD 600 为 0.4 至 0.6。通过在 5， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 15 分钟来收获细胞。然后倒出上清液，并使用 500 毫升无菌、冰冷的蒸馏水重悬沉淀。
再次离心细胞，倾析上清液后，使用 250 毫升无菌、冰冷的 10% 甘油重悬沉淀。最后一次离心细胞后，使用两毫升 10% 甘油重悬细胞。将 50 微升等分试样转移到微量离心管中，然后将试管放入干冰乙醇浴中立即冷冻。
将细胞储存在零下 80 摄氏度以进行电穿孔。要进行电穿孔，将 1 μL 重组质粒添加到 50 μL 等分试样的感受态细胞中，并置于冰上 5 分钟。将细胞转移到电穿孔比色皿中，并将电穿孔仪设置为以下设置：25 华氏度电容、2.5 千伏和 200 欧姆电阻。
然后，将比色皿放入设备中，传递脉冲。向比色皿中加入 1 mL 回收培养基，并将细胞转移至 15 mL 锥形管中。将培养物在摇动培养箱中轻轻旋转，在突变体所需的适当温度下孵育 60 分钟，让细胞恢复。
要选择转化体，请将 100 微升培养物移液到带有琼脂平板的培养基上，并使用无菌涂布器铺展溶液。然后，在适当的温度下孵育过夜。有关更多详细信息，请参阅文本协议。
为了进行互补分析，用空载体 pBAD33 或使用电穿孔用 dapL 表达载体转化 AOH1，正如刚刚所示。将转化混合物接种在 LB 琼脂培养基上，补充有 50 μg/ml Dap、34 μg/mL 氯霉素和50 μg /mL卡那霉素。在观察结果之前，将板在 30 摄氏度下孵育 24 小时。
使用空载体 pBAD33 或表达 murE 的载体，使用电穿孔转化 TKL-11 突变体，如本视频前面所示。将转化体接种在 LB 琼脂上，补充每毫升 50 微克硫胺素和 34 微克/毫升氯霉素，并在 30 摄氏度下孵育板 24 小时，然后检查转化体。通过将来自对照和实验转化的菌落划线或铺板到两块 LB 培养基板上，加上 0.2% 阿拉伯糖和每毫升 50 微克硫胺素来测试互补。
在评估生长表型之前，将一个板在 30 摄氏度下孵育，另一个板在 42 摄氏度下孵育 24 小时。用 pRK290 空载体或含有天然 rshNsp 基因的载体在两个单独的转化事件中转化新鞘氨醇物种的突变型 Hx699 菌株和野生型 Rr217 菌株，如本视频前面所示。将转化体接种在补充有 10 μg/mL 四环素的马铃薯葡萄糖或 PD 琼脂上，孵育至少 72 小时，或直到出现转化体。
然后，用四环素在新鲜的 PD 琼脂平板上以 X 模式划线转化体。在 30 摄氏度下孵育至少 4 天后，目视检查两个板的生长表型。大肠杆菌双突变体 AOH1 携带 DapE 基因突变和 DapD 基因缺失，除非提供 Dap，否则不会生长。
如图所示，通过在 Dap 裂解通路中将 THDP 转化为 LLDap，表达 DapLs 的 AOH1 突变体能够在无 LLDap 的培养基上生长。MurE 酶促进 m-DAP 添加到革兰氏阴性菌的肽聚糖中。大肠杆菌 MurE 突变体 TKL-11 不能在 42 摄氏度下生长。
在本实验中，只有用 MurE 转化的 TKL-11 细胞在 42 摄氏度下生长。TyrB 基因突变会阻止酪氨酸和苯丙氨酸的合成。然而，如此处所示，当 TyrB 突变体 DL39 菌株表达拟南芥 At5g36160 基因时，它在 M9 培养基上生长，缺乏酪氨酸和苯丙氨酸，表明该酶可以合成酪氨酸。
新鞘氨醇属中的 Hx699 突变体含有非功能性 RSH 蛋白并产生低粘膜表型。然而，用天然 RSH 基因进行转化会在多细胞 X 条纹中产生更多可溶性细胞外多糖，这是高粘膜的。相反，当 Hx699 突变体用空载体转化时，它会产生粘液腺功能减退表型。
一旦掌握，这项技术可以在大约 24 到 48 小时内完成。如果执行得当，取决于所用模式生物的生长，不包括克隆、制备和转化步骤的能力。在尝试此过程时，重要的是要记住功能互补分析中使用的突变体的生长条件要求。
按照此程序，可以执行其他方法，如传统的体外公理表征，以回答其他问题，如底物特异性、温度和 pH 最佳以及体细胞速度速率等。经过开发，这项技术为生物学领域和许多细分领域（如微生物学）的研究人员阐明来自各种生物体的酶的体内功能或作用铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何制造电感受态细菌细胞、如何使用电穿孔转化细菌以及如何使用功能互补来评估基因/酶的功能有一个很好的了解。
不要忘记，与病原生物一起工作可能非常危险，应采取必要的预防措施。
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概述
本研究演示了功能互补分析（FCA）测定法，用于验证生物化学途径中的酶活性。它专注于氨基酸代谢、细菌严格反应和肽聚糖生物合成中涉及的酶。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 微生物学
- 遗传学
背景
- 功能互补分析有助于阐明酶活性。
- 这种方法恢复了突变细胞中的野生型表型。
- 它适用于各种科学领域。
- 相比体外条件，体内条件提供了更生理学的见解。
研究目的
- 评估特定酶的功能和活性。
- 识别和阐明未表征酶的作用。
- 在实验室环境中演示FCA技术。
使用的方法
- DapL、TarB、MurE 和 RSH 基因的克隆。
- 用感兴趣基因转化突变细菌细胞。
- 将转化后的细胞接种到液体培养基中。
- 过夜培养细菌以评估酶活性。
主要结果
- 成功恢复突变细胞中的野生型表型。
- 通过FCA验证酶活性。
- 氨基酸代谢途径和细菌过程的洞见。
- 演示FCA技术在各个领域的适用性。
结论
- FCA是研究酶功能的强大工具。
- 这种方法增强了对生物化学途径的理解。
- 它对多个科学学科的研究具有广泛的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Functional Complementation Analysis (FCA) provides a robust in vivo framework for validating gene and enzyme function within physiological contexts, directly supporting early discovery and target validation in biopharma R&D. By enabling restoration of wild type phenotypes in mutant backgrounds, FCA reduces mechanistic ambiguity and increases predictive confidence for pathway interrogation. This approach is particularly relevant for de-risking uncharacterized targets and informing portfolio triage decisions at critical discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses by restoring function in mutant models.
- Supports biological de-risking through in vivo assessment of gene or enzyme activity.
- Facilitates functional target validation for genes with putative or predicted roles.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening workflows.
- Establishes reproducible, quantitative phenotypic outputs for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of gene function across multiple conditions and constructs.
- Supports scalability and platform reuse for diverse gene or enzyme targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vivo functional outputs with disease-relevant pathways when model systems are appropriate.
- Provides continuity from gene discovery through preclinical validation of mechanistic hypotheses.
- Reduces translational risk by confirming biological relevance prior to advanced studies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on functional evidence.
Pipeline & Workflow Integration
FCA is positioned at the intersection of early discovery and lead identification, enabling hypothesis testing and pathway clarification before preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of gene or enzyme function in physiological settings.
- Screening: Provides reproducible, quantitative phenotypic readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers measurable outputs (e.g., growth restoration, phenotype rescue) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by confirming in vivo relevance of targets.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for functional interrogation across diverse gene families and pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes functional assays for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial genetics, and phenotypic analysis.
- Demands access to electroporation equipment and controlled growth environments.
- Necessitates cross-team standardization of mutant strains and assay conditions.
- Adaptation may be needed for different organisms or pathway contexts.
- Growth requirements and safety precautions must be rigorously observed, especially with pathogenic strains.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Preparation of Electro-competent Bacterial Cells for Transformation
2:33
Electroporation of Bacterial Cells with Complementation Plasmids
3:39
Transformation of AOH1 to Facilitate Functional Complementation Using L,L-diaminopimelate Aminotransferase
4:18
Transformation of TKL-11 to Facilitate Functional Complementation Using UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate Ligase
5:12
Transformation of Mutant Hx699 to Facilitate Functional Complementation of Hypomucoid Phenotype of Novosphingobium sp. Strain Hx699
6:02
Results: Functional Complementation Analysis
7:44
Conclusion
