双分子荧光互补的流式细胞术分析：一种高通量定量研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法

本实验的总体目标是绘制ACAP LBC与PDE4D3相互作用的位点。通过流式细胞术检测生物分子荧光互补（BC）的平均荧光强度来实现该目标。为此，将细胞转染表达ACAP LBC和PDE4D3片段的质粒，这些片段分别与荧光报告蛋白的N端或C端区域融合。

然后进行Venus流式细胞术检测，以评估蛋白片段相互作用后Venus荧光蛋白是否完整及其荧光情况。如果蛋白片段不发生相互作用，则无法检测到荧光。同时进行互补的蛋白质印迹分析，以确定相对的蛋白表达水平。

通过将YFP的平均荧光强度与蛋白质表达水平进行归一化，计算蛋白质-蛋白质相互作用的强度。结果数据表明，PDE43与ACAP LBC的结合由PDE43内的多个区域介导，主要通过上游保守区1（UCR1）。该技术相较于现有的方法（如免疫共沉淀和显微镜下的BPC）具有主要优势：操作相对简单、灵敏度高，并且能够实现对大量细胞的快速筛选。

尽管该方法可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用，但它也可用于筛选调节蛋白质-蛋白质相互作用的因素，以服务于药物发现。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为需要确定线性B响应。各构建体的表达水平应保持相似，以便能够相互比较使用不同蛋白质片段所获得的结果。

在本实验中，细胞被共转染以下成分：YFP 衍生物 Venus 的 N 端片段与全长 ACAP LBC 融合蛋白，以及 Venus 的 C 端片段分别与以下蛋白之一融合：全长 PDE43、PDE43 的上游保守区 1（UCR1），或 PDE43 的上游保守区 2 加催化区（UCR2+CAT）。转染前一天，在 6 孔组织培养板中每孔接种 1.2 × 10⁵ 个 HEC293T 细胞，加入 2 毫升完全生长培养基。每组实验设置三个对照孔，以及每个检测组各三个实验孔。

将Cotran在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日，准备转染BC血浆DNA质粒和CFP载体，后者与BS C质粒共转染作为标记。每种条件下，将相应量的DNA加入250微升Optum M1无血清培养基中。

在无菌离心管中，一管足以转染三个孔。然后向稀释的 DNA 混合物中每微克加入 3 µL 的 Transit-LT1 试剂，用移液器轻轻混匀，室温孵育 30 分钟。孵育后，将 250 µL 转染混合物逐滴加入细胞中，然后在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。

转染后，在落射荧光显微镜下观察荧光，细胞应表达黄色荧光以显示BC信号，同时表达CFP荧光以报告转染效率。为进行流式细胞术分析，首先用2毫升冰浴PBS洗涤细胞，然后加入250微升0.05%胰蛋白酶，于37摄氏度孵育2至5分钟以使细胞脱落。随后在显微镜下观察细胞脱落情况。

待细胞脱落后，加入一毫升 DMEM 中和胰蛋白酶。接着，将一毫升细胞悬液转移至一个微量离心管中，再将 0.25 毫升细胞悬液转移至第二个微量离心管中。在 500 ×g 条件下离心五分钟。

将250微升样品进一步处理用于流式细胞术。将1毫升样品置于冰上，用于后续的西部血液分析，该分析应与Spin Resus步骤平行进行。用250微升Fax缓冲液重悬细胞，并将细胞置于冰上；若流式细胞术分析不能立即进行，细胞也可用含1%多聚甲醛的PBS固定。流式细胞术使用配备488纳米、405纳米和642纳米固态激光器的Beckman Coulter Cyan ADP系统，采用Summit软件进行数据采集与分析。使用标准微球校准流式细胞仪后，以线性刻度绘制前向散射（FSC）对侧向散射（SSC）的散点图，并圈选活细胞群体进行分析。

接下来，在非聚集的活细胞群体中，绘制SSC与电压脉冲宽度以及门控图（gait）的关系。然后，在该仪器上以对数尺度绘制FSC在405 nm FL6通道的CFP荧光信号（线性尺度FSC对数尺度CFP荧光）关系，并对非聚集的活CFP阳性细胞进行门控。最后，在该仪器上以488纳米FL1通道的YFP荧光信号（线性尺度FSC对数尺度YFP荧光）绘制FSC与YFP荧光的关系，以观察BC的强度。

接下来，运行Y-F-P-C-F-P双阴性样本，并调节F-S-C-S-S-C FL1和FL6的光电倍增管（PMT）电压，以设定每个信号的阈值。随后，运行YFP和CFP单阳性样本，用于后续离线补偿。确保获取至少10,000个门控事件。

最后，在完成数据采集后，收集实验样本的数据。根据采集设置分析方案，通过在活细胞的FS CSC点图中设定门控一进行传递。在门控一的FSC脉冲点图中设定门控二，以获取非聚集的活细胞；在门控二的ccfp FSC点图中设定门控三，以获取非聚集的ccfp阳性活细胞。

使用YFP和CFP单阳性细胞对Yfp-CFP点图中的YFP和CCFP信号进行补偿后，确定CFP和YFP阳性细胞的阈值线。将CFP阳性细胞的YFP平均荧光强度（MFI）导出至Excel用于数据作图，然后在Excel中将Y-F-P-M-F-I归一化至Western blotting测定的ACAP LBC PDE E 43及上样对照alpha tubulin的表达水平，以确定YFP平均荧光强度的线性范围。在HEK 293细胞中将CFP与VN-ACAP LBC及不同量的VC-PDE E 43共转染，并按照本视频所述方法利用双分子荧光互补流式细胞术检测相互作用；该图显示VC-PDE E 43表达量相对于转染的VC-PDE E 43量的相对倍数变化。

由蓝色方块指示的CFP阳性细胞中Venus的平均荧光强度与VCDE 43的表达相关，且与通过蛋白质印迹图像分析确定的表达水平一致，后者由红色三角形表示。各样本间的CFP平均荧光强度相似，如绿色方块所示，该结果作为阴性对照，用于限制细胞间的变异。这些结果验证了通过测量BS e的平均荧光强度，利用流式细胞术定量ACAB LB C PDE 43相互作用的可行性，同时可确定用于筛选的BIC构建体的适当用量，以绘制ACAP LBC在PDE E 43 BIC分析中与全长PDE E 43（fl）结合的结合位点。

通过此方法评估了PDE 43的UCR一区以及PDE 43的UCR二区和CAT区，如图所示。vn ACAP LBC与VC PDE 43 UCR二区加CAT共表达时，相较于VC PDE 43全长和VC PDE 43 UCR一区，BC信号更低；在所有流式样本中观察到相似的蛋白表达水平，并将平均荧光强度归一化至ACAP LBC PDE 43和α微管蛋白的相对表达水平。因此，归一化后的B-C-M-F-I结果表明，ACAP LBC PDE 43全长与ACAP LBC PDE 43 UCR一区之间的荧光强度无差异，但ACAP LBC PDE 43 UCR二区加CAT相互作用的信号明显更低。

这些结果表明，PDE 43 中存在多个与 ACAP LBC 相互作用的区域，其中 PDE 43 UCR R 是与 ACAP LBC 相互作用的主要区域。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过 BP C 的流式细胞术分析来研究蛋白质-蛋白质相互作用。在进行该实验操作时，重要的是要确定使用适量的 BP C 载体，以获得相似的蛋白质表达水平和线性的 BP C 响应。在此实验基础上，可进一步采用肽段分析或风险分析等其他方法，以确定 PDE 40 D 三中哪些氨基酸残基负责该相互作用。

其ACAP与红细胞的相互作用。