双分子荧光互补流式细胞仪分析:高通量的定量方法研究蛋白质 - 蛋白质相互作用

该程序的总体目标是绘制 ACAP LBC 与 PDE 4、D、3 相互作用的位点。通过使用流式细胞术测量生物分子、荧光、互补或 BC 的平均荧光强度。为此，用 ACAP LBC 和 PDE 4 D 3 片段转染细胞，这些片段与荧光报告蛋白的 N 或 C 末端部分融合。

然后进行 Venus 流式细胞术以评估蛋白质片段是否相互作用的荧光 Venus 完成和荧光。如果蛋白质片段不相互作用，则不会检测到荧光。进行互补的蛋白质免疫印迹血液分析以确定相对蛋白质表达水平。

然后通过将 YFP 平均荧光强度与蛋白质表达水平归一化来计算蛋白质蛋白质相互作用的强度。结果数据表明，PDE 43 与 ACAP LBC 的结合是由 PDE 43 内的多个区域介导的，主要是通过上游保守区域 1 或 UCR 1。与现有方法（如使用显微镜的共免疫沉淀和 BP C）相比，该技术的主要优点是相对简单、灵敏且有助于快速筛选大量细胞。

虽然这种方法可以深入了解蛋白质-蛋白质相互作用，但它也可用于筛选调节蛋白质-蛋白质相互作用的因子，以便进行药物发现。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为需要确定线性 B 响应。构建体的表达应相似，以便使用不同蛋白质片段的结果可以相互比较。

在此处描述的实验中，用 YFP 衍生物的 N 末端片段转染细胞，将维纳斯与全长 ACAP LBC 融合，将维纳斯的 C 末端片段与以下全长 PDE E 43 之一融合，上游保守区 1 UCR PDE E 43 之一或上游保守区 2 加催化区 UCR R 2 加 PDE 43 的 CAT 在转染前一天在六。好吧，组织培养板以 2 毫升完全生长的方式接种 1.2 倍 10 至第五个 HEC 2 9 3 T 细胞。中等种子，三个对照孔加上每个测试的三个孔。

Cotran 在 5% 二氧化碳下在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天准备转染 BC 血浆 DNA 构建体和 CFP 载体，用 BS C 构建体作为标记物进行 cot 转染。对于每种情况，将适量的 DNA 添加到 250 μL Optum M1 无血清培养基中。

在无菌试管中，一根试管足以转染三个孔。然后向稀释的 DNA 混合物中加入 3 μL 运输 LT，每 μg 1 种试剂，轻轻移液混合，在室温下孵育 30 分钟。在 250 μL 转染混合物中滴加细胞孵育后，然后在 37 摄氏度下以 5% 二氧化碳孵育 24 小时。

转染后，在落射荧光显微镜下检查荧光，细胞应表达黄色荧光以表示 BC 信号和 CFP 荧光以报告转染效率。为了制备用于流式细胞术分析的细胞，首先用 2 毫升冰冷的 PBS 洗涤细胞，然后加入 250 μL 0.05% 胰蛋白酶分离细胞，在 37 摄氏度下孵育 2 至 5 分钟。然后使用显微镜检查细胞脱离。

细胞分离后，用 1 毫升 DMEM 中和胰蛋白酶。接下来，将 1 mL 细胞转移至一个微量离心管中，然后将 0.25 mL 细胞转移至第二个微量离心管中。将试管以 500 块奶酪离心 5 分钟。

250 微升样品将进一步处理用于流式细胞术。将 1 毫升样品放在冰上用于蛋白质血液分析，应在离心复苏后同时进行。将细胞悬浮在 250 微升传真缓冲液中并置于冰上 细胞也可以固定在 PBS 中的 1% 多聚醛中 如果这里不能立即进行流式细胞术分析，则使用贝克曼库尔特青色进行流式细胞术，配备 488 纳米、405 纳米和 642 纳米固态激光器的 DP Summit 软件在使用标准珠子校准流式细胞仪后进行采集和分析， 在线性尺度上绘制前向散射或 FSC 与侧向散射 SSC 的对比，并在活细胞群上绘制步态。

接下来绘制 SSC 与非聚集活细胞群的电压脉冲宽度和步态的关系。然后在线性尺度上绘制 FSC 与 405 FL 6 在 405 FL 6 上的对数尺度上该仪器上的 CFP 荧光，并在非聚集的活 CFP 阳性细胞上步态。最后，在线性尺度上绘制 FSC 与 488 纳米 FL 1 处的 YFP 荧光在对数尺度上绘制该仪器上的荧光，以可视化 BC 强度。

接下来，运行 Y-F-P-C-F-P 双负采样并调整 F-S-C-S-S-C FL one 和 FL six 光电倍增管或 PMT 电压以设置每个信号的阈值。接下来，运行 YFP 和 CFP 单阳性样品，以便将来进行离线补偿。确保至少获取 10， 000 个门控事件。

最后，在数据收集后收集实验样品的数据。根据采集设置分析方案，在活细胞的 FS CSC 点图中使用门 1 传播。FSC 脉冲中的门 2 与门 1 的点图（用于非聚集的活细胞）和门 3 的 CCFP FSC 点图（用于非聚集的 ccfp 阳性活细胞）。

使用 YFP 和 CFP 单阳性细胞补偿 Y fp CFP 点图中的 YFP 和 CCFP 信号后，我们确定了 CFP 和 YFP 阳性细胞的截止线。将 CFP 阳性细胞的 YFP 平均荧光强度或 MFI 导出到 excel 以进行数据绘图，然后在 Excel 中将 Y-F-P-M-F-I 标准化为 ACAP LBC PDE E 43 和加载对照 α 微管蛋白的表达水平，通过蛋白质印迹确定以确定 YFP 平均荧光强度的线性范围。用 VN ACAP L BBC 和 HEC 2 93 细胞中不同量的 VC PDE E 43 对 CFP 进行 cot 转切，并使用 bif 流式细胞术评估相互作用，如本视频所述，该图显示了 VC PDE E 43 表达的相对倍数变化作为 VC PDE E 43 转染的函数。

蓝色方块表示的 CFP 阳性细胞中 Venus 的平均荧光强度与 VCDE 43 表达相关，并且与通过蛋白质印迹图像分析确定的表达水平一致，由红色三角形表示。如绿色方块所示，在样品中观察到相似的 CFP 平均荧光强度，并用作阴性对照以限制细胞变异。这些结果验证了使用流式细胞术通过测量 BS e 的平均荧光强度来量化 ACAB LB C PDE 43 相互作用，同时确定用于筛选的 BIC 构建体的适当量，以在 PDE E 43 内绘制 ACAP LBC 结合位点ACAP LBC 与全长 PDE E 43 fl 相互作用的 BIC 分析。

使用这种方法评估 PDE 43 的 UCR 一个区域和 PDE 43 的 UCR 两个和 CAT 区域，如图所示。与 VC PDE 43 FL 和 VC PDE 43 UCR 相比，vn ACAP LBC 和 VC PDE 43 UCR 二加 CAT 的表达导致 BC 信号降低，在所有流式样品中观察到一种相似的蛋白表达，平均荧光归一化为 ACAP LBC PDE 43 和 α 微管蛋白的相对表达水平。因此，归一化 B-C-M-F-I 表明 ACAP LBC PDE 43 FL 和 ACAP LBC PDE 43 UCR R one 之间的荧光强度没有差异，但 ACAP LBC PDE 43 UCR 2 加 CAT 相互作用的信号要低得多。

这些结果表明，PDE 43 中有多个区域与 ACAP LBC 相互作用，并且 PDE 43 UCR R one 是与 ACAP LBC 相互作用的主要区域。观看此视频后，您应该对如何通过 BP C 的流式细胞术分析来研究蛋白质、蛋白质相互作用有很好的了解。在尝试此过程时，重要的是要记住确定用于获得相似蛋白质表达和线性 BP C 反应的正确 BP C 构建体量。按照此程序，可以执行其他方法，如肽或风险，以确定 PDE 40 D three 中的哪些氨基酸负责。

它的 ACAP RBC 相互作用。