Name: 双分子荧光互补流式细胞仪分析:高通量的定量方法研究蛋白质 - 蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学习双分子荧光互补流式细胞仪分析方法，用于高通量定量研究AKAP-Lbc与PDE4D3的蛋白质-蛋白质相互作用。该技术可快速筛选调控蛋白互作的因素，适用于药物发现研究。

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感谢伊利诺伊大学芝加哥分校（UIC）O'Bryan 实验室对本研究的实验评估与深入讨论。本研究由美国心脏协会资助项目11SDG5230003（资助对象：GKC）以及美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心—UIC临床与转化科学中心资助项目UL1TR000050支持。

1. 细胞转染
<ol>
	<li>转染前一天接种细胞，进行免疫荧光实验时接种较少数量的细胞。
	<ol>
		<li>用于免疫荧光：在6孔板中，将盖玻片（每孔1片）用0.02%明胶在37 °C下包被至少4小时，用培养基洗涤1次，然后每孔接种1 × 105个HEK 293T细胞于2 ml完全生长培养基中[DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）加10%胎牛血清（FBS）]。</li>
		<li>用于流式细胞术和Western blot分析：在6孔板中每孔接种1.2 × 105个HEK 293T细胞于2 ml完全生长培养基中（或在24孔板中每孔接种0.3 × 105个HEK 293T细胞于0.5 ml完全生长培养基中）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明书准备用于转染的DNA：免疫荧光实验使用Effectene（Qiagen），流式细胞术和Western blot分析使用TransIT-LT1（Mirus）。所用DNA量如下表所示。
	<table border="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td>&nbsp;</td>
				<td>24孔板（ng）</td>
				<td>6孔板（ng）</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>CFP-载体</td>
				<td>10</td>
				<td>50</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>VNN-AKAP-Lbc</td>
				<td>200</td>
				<td>1000</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>VCN-PDE4D3-FL（全长PDE4D3）</td>
				<td>2.5, 5, 10, 20, 40, 80</td>
				<td>100</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>VCN-PDE4D3-UCR1（含UCR1结构域的PDE4D3 N端片段）</td>
				<td>&nbsp;</td>
				<td>100</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>VCN-PDE4D3-UCR2+CAT（含UCR2和催化结构域的PDE4D3 C端片段）</td>
				<td>&nbsp;</td>
				<td>100</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	使用Effectene进行转染（6孔板）：
	<ol>
		<li>将指定量的质粒DNA与4 μl增强剂加入100 μl EC缓冲液中，混匀，在室温下孵育5分钟。</li>
	 <li>加入5 μl Effectene，混匀，在室温下孵育10分钟，然后逐滴加入细胞中。	 </li>
 </ol>
 使用TransIT-LT1进行转染（6孔板/24孔板）：
 <ol>
		<li>将指定量的质粒DNA加入无菌管中的250 μl（6孔板）或50 μl（24孔板）Opti-MEM I无血清培养基中。</li>
		<li>将TransIT-LT1试剂加入稀释后的DNA混合物中，轻轻吹打混匀（TransIT-LT1试剂与DNA的比例为每1 μg DNA加入3 μl TransIT-LT1试剂）。</li>
		<li>在室温下孵育30分钟，然后逐滴加入细胞中。</li>
	</ol>
 </li>
 </ol>
2. 流式细胞术、蛋白质印迹和免疫荧光的细胞制备
<ol>
	<li>转染后24小时，在收集细胞前，于落射荧光显微镜下观察荧光表达情况。</li>
	<li>流式细胞术分析的细胞制备：
	<ol>
		<li>用0.5 ml/2 ml预冷的PBS洗涤24孔板/6孔板中的细胞。</li>
		<li>使用50 μl/250 μl 0.05%胰蛋白酶消化并解离细胞。</li>
		<li>加入200 μl/1 ml DMEM培养基以中和胰蛋白酶活性。</li>
		<li>将细胞悬液于500 × g离心5分钟，收集250 μl细胞（适用于24孔板和6孔板）用于流式细胞术分析，剩余细胞（1 ml）用于Western blot分析。</li>
		<li>将细胞重悬于250 μl FACS缓冲液 [PBS + 0.5% (w/v) BSA + 2 mM EDTA] 中，置于冰上保存以进行流式细胞术分析。若不能立即进行流式细胞术分析，可将细胞固定于1%多聚甲醛（溶于PBS）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blot分析的细胞制备：与流式细胞术分析的细胞制备同步进行。
	<ol>
		<li>用2 ml预冷的PBS洗涤细胞一次，加入100 μl细胞裂解液[10 mM磷酸钠缓冲液，pH 6.95，150 mM NaCl，5 mM EDTA，5 mM EGTA，1% Triton X-100]裂解细胞。</li>
		<li>在4 °C条件下，以21,000 × g离心10分钟，收集细胞裂解液。</li>
		<li>采用Bradford法测定蛋白浓度，按每孔等量蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，随后转移至硝酸纤维素膜进行免疫印迹分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光实验的细胞制备：
	<ol>
		<li>用2 ml PBS洗涤细胞3次，加入1 ml 3.7%多聚甲醛（溶于PBS）于室温固定10分钟，再用2 ml PBS洗涤5分钟，重复3次。</li>
		<li>将盖玻片用封片剂封固于载玻片上。如有需要，可用指甲油密封盖玻片边缘。</li>
		<li>将载玻片于4 °C保存，待后续观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 流式细胞术和免疫荧光显微镜
<ol>
	<li>使用配备488 nm、405 nm和642 nm固态激光器的Beckman Coulter Cyan ADP进行流式细胞术。数据采集与分析采用Summit软件。
	<ol>
		<li>使用标准微球校准流式细胞仪。</li>
		<li>以线性刻度绘制前向散射光（FSC）/侧向散射光（SSC），用于圈选活细胞群体。</li>
		<li>绘制FSC/电压脉冲宽度，用于圈选非聚集的活细胞群体。</li>
		<li>以对数刻度绘制计数/FL6（CFP荧光，405 nm），用于圈选非聚集的CFP阳性活细胞。</li>
		<li>以对数刻度绘制计数/FL1（YFP荧光，488 nm），用于检测BiFC信号强度。</li>
		<li>运行YFP-CFP-双阴性样本，调节FSC、SSC、FL1和FL6光电倍增管（PMT）电压，设定各信号的阈值。</li>
		<li>运行单阳性（YFP+和CFP+）样本，用于后续离线补偿分析。</li>
		<li>至少采集10,000个门控事件（非聚集的活CFP+细胞）用于分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光显微镜检测使用蔡司LSM 510共聚焦显微镜进行。注意：为确保所有数据之间的准确比较，各样本之间的设置（如放大倍数、针孔大小、探测器增益、放大器偏移、帧尺寸、扫描速度、扫描平均次数和激光功率）必须保持一致。</li>
</ol>
4. 数据分析（使用 Summit 软件进行）
<ol>
	<li>建立与采集相似的分析方案，并进行适当的设门： 
在FSC/SSC点图中设门1，圈选活细胞。 
在门1的FSC/脉宽图中设门2，圈选非聚集的活细胞。 
在门2的计数/CFP图中设门3，圈选非聚集的CFP+活细胞。</li>
	<li>使用YFP+和CFP+单阳性细胞对YFP和CFP信号进行补偿。</li>
	<li>重新确定CFP/YFP阳性细胞的阈值线。</li>
	<li>将CFP+细胞的YFP平均荧光强度（MFI）导出至Excel用于数据作图。</li>
	<li>根据Western blot测定的AKAP-Lbc、PDE4D3及上样对照α-tubulin的表达水平，对YFP MFI进行归一化处理。</li>
</ol>

<ol><li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein-protein+complexes+to+interactomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li>
<li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-protein+systems%3A+beyond+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li>
<li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li>
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<li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).</li>
<li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).</li>
<li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

BiFC 是一种简单且灵敏的蛋白质-蛋白质相互作用研究方法。该方法不能用于发现新的蛋白质-蛋白质相互作用，但特别适用于在细胞内确认蛋白质-蛋白质相互作用并研究其功能特性，例如蛋白质复合物的亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用位点的定位，以及筛选能够调节蛋白质-蛋白质相互作用的小分子/多肽。由于 VN 和 VC 片段本身不具荧光，背景荧光较低，从而提高了该检测方法的灵敏度。VN-蛋白质-VC-蛋白质相互作用需要一定时间成熟/稳定，因此观察蛋白质-蛋白质相互作用存在延迟，最佳观察时间点可能需要通过实验经验确定。还应注意的是，VN-蛋白质-VC-蛋白质相互作用不可逆，因此遗憾的是，使用当前的 Venus BiFC 构建体时，该方法不适用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的动态动力学过程。
适当的对照对于BiFC分析至关重要。合适的阴性对照包括在相应的BiFC载体中表达不相互作用的蛋白质或非特异性肽段，或者如果可能，使用破坏蛋白-蛋白相互作用的突变体。空的BiFC载体不是良好的对照，因其会导致非特异性的高背景荧光。如果在两种相互作用蛋白之间未观察到BiFC信号，应分析其表达情况。此外，BiFC信号...

据估计，人类相互作用组中存在约 650,000 种蛋白质-蛋白质相互作用，在维持正常细胞功能中发挥着关键作用1,2。除了共免疫沉淀（co-IP）这一从细胞裂解液中研究蛋白质-蛋白质相互作用的金标准方法外，目前已开发出多种蛋白质片段互补检测法（PCA），以提高在细胞内检测蛋白质-蛋白质相互作用的灵敏度3。相关技术包括 Förster 共振能量转移（FRET）、生物发光共振能量转移（BRET）以及双分子荧光互补（BiFC）4,5。BiFC 技术基于两个荧光蛋白片段（本文使用 Venus，一种 YFP 变体）的促进性结合，这两个片段分别与潜在相互作用的蛋白质伴侣融合（本示例中为 AKAP-Lbc 和 PDE4D3）。当目标蛋白质在细胞内发生相互作用时，可形成具有功能的荧光蛋白复合物，从而产生可检测的荧光信号，可通过荧光显微镜在活细胞或固定细胞中进行观察6,7,8。与其他 PCA 方法相比，BiFC 具有较高的灵敏度且技术难度较低，适用于研究活细胞中蛋白质的亚细胞定位。然而，该技术的主要缺点在于，一旦荧光蛋白复合物形成便不可逆转，因此不适合用于研究动态变化的蛋白质-蛋白质相互作用。在本研究中，我们利用 BiFC 技术通过监测 Venus 的荧光强度来绘制 PDE4D3 与 AKAP-Lbc 之间的相互作用位点。与传统的荧光显微镜分析相比（若未采用自动化高通量设备，则该方法耗时且劳动强度大），流式细胞术可在短时间内对异质细胞群体中的数千个细胞进行直接的定量分析9,10。本文通过并行比较流式细胞术-BiFC 分析与传统 co-IP 方法，证明两种方法可获得可比的数据结果，但流式细胞术 BiFC 分析更节省时间且所需样本量更少，因而在目标细胞数量有限时更具优势。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#8217;s 改良 Eagle&amp;#8217;s 培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（青/链），100 倍浓度</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>抗 Flag 抗体</td><td>Sigma</td><td>M2, F1804</td><td></td></tr><tr><td>抗 HA 抗体</td><td>Covance</td><td>16B12, MMS-101R</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#945;-微管蛋白</td><td>Sigma</td><td>DM1A, T9026</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>Clontech</td><td>632569</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板，6 孔，组织培养处理</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>质粒大量提取试剂盒，高速型</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#8217;s 磷酸盐缓冲液（DPBS），无菌 1×</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，0.05%（w/v）</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>用于流式细胞术染色的聚苯乙烯圆底管</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>S74337MF</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气套式培养箱</td><td>NuAIR DH autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳及转膜装置</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyan ADP 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

双分子荧光互补的流式细胞术分析：一种高通量定量研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

在研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的方法中，双分子荧光互补（BiFC）技术相对简单且灵敏。BiFC 技术基于使用一种荧光蛋白的两个非荧光片段（此处使用黄色荧光蛋白变体 Venus）产生荧光信号。将非荧光的 Venus 片段（VN 和 VC）分别与两个相互作用的蛋白质（本例中为 AKAP-Lbc 和 PDE4D3）融合，当发生 VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 相互作用时，可在细胞内重新形成具有功能的荧光蛋白，从而产生荧光信号。
双分子荧光互补（BiFC）技术可根据荧光强度提供蛋白质复合物的亚细胞定位信息以及蛋白质相互作用强度的信息。然而，利用显微镜进行BiFC分析以量化蛋白质-蛋白质相互作用强度时，由于蛋白质表达和相互作用存在异质性，该方法耗时较长且具有一定主观性。通过将流式细胞术分析与BiFC技术相结合，可在短时间内准确测量大量细胞中的荧光BiFC蛋白质-蛋白质相互作用信号。本文展示了该方法在绘制PDE4D3中与AKAP-Lbc相互作用所必需区域中的应用。这种高通量方法可用于筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。

AKAP-Lbc 和 PDE4D3 构建体（图 1B）分别与 VN 和 VC 片段融合。AKAP-Lbc 与 PDE4D3 的相互作用可产生功能性 YFP 荧光（图 1A）。本文采用双分子荧光互补（BiFC）方法绘制 PDE4D3 中 AKAP-Lbc 的结合位点。上游保守区 1（UCR1）、上游保守区 2（UCR2）和催化区（CAT）在 PDE4 家族蛋白中高度保守，因此，使用全长（FL）、UCR1 以及 UCR2 加 CAT 片段筛选 PDE4D3 与 AKAP-Lbc 的结合位点。在 HEK 293T 细胞中表达 VN-AKAP-Lbc 与 VC-PDE4D3 片段可产生不同强度的荧光信号（图 1C）。BiFC 结果表明，UCR1 和 UCR2+CAT 均参与 PDE4D3 与 AKAP-Lbc 的相互作用。AKAP-Lbc 与 UCR1 相互作用产生的荧光强度高于 AKAP-Lbc 与 UCR2+CAT 的相互作用，表明 PDE-UCR1 与 AKAP-Lbc 的结合能力强于 PDE-UCR2+CAT。
<p class...

双分子荧光互补的流式细胞术分析为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种高通量的定量方法。该方法可用于绘制蛋白质结合位点图谱，以及筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。

在研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的方法中，双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）技术相对简单且灵敏。BiFC...

本实验的总体目标是绘制ACAP LBC与PDE4D3相互作用的位点。通过流式细胞术检测生物分子荧光互补（BC）的平均荧光强度来实现该目标。为此，将细胞转染表达ACAP LBC和PDE4D3片段的质粒，这些片段分别与荧光报告蛋白的N端或C端区域融合。然后进行Venus流式细胞术检测，以评估蛋白片段相互作用后Venus荧光蛋白是否完整及其荧光情况。如果蛋白片段不发生相互作用，则无法检测到荧光。同时进行互补的蛋白质印迹分析，以确定相对的蛋白表达水平。通过将YFP的平均荧光强度与蛋白质表达水平进行归一化，计算蛋白质-蛋白质相互作用的强度。结果数据表明，PDE43与ACAP LBC的结合由PDE43内的多个区域介导，主要通过上游保守区1（UCR1）。该技术相较于现有的方法（如免疫共沉淀和显微镜下的BPC）具有主要优势：操作相对简单、灵敏度高，并且能够实现对大量细胞的快速筛选。尽管该方法可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用，但它也可用于筛选调节蛋白质-蛋白质相互作用的因素，以服务于药物发现。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为需要确定线性B响应。各构建体的表达水平应保持相似，以便能够相互比较使用不同蛋白质片段所获得的结果。在本实验中，细胞被共转染以下成分：YFP 衍生物 Venus 的 N 端片段与全长 ACAP LBC 融合蛋白，以及 Venus 的 C 端片段分别与以下蛋白之一融合：全长 PDE43、PDE43 的上游保守区 1（UCR1），或 PDE43 的上游保守区 2 加催化区（UCR2+CAT）。转染前一天，在 6 孔组织培养板中每孔接种 1.2 × 10⁵ 个 HEC293T 细胞，加入 2 毫升完全生长培养基。每组实验设置三个对照孔，以及每个检测组各三个实验孔。将Cotran在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日，准备转染BC血浆DNA质粒和CFP载体，后者与BS C质粒共转染作为标记。每种条件下，将相应量的DNA加入250微升Optum M1无血清培养基中。在无菌离心管中，一管足以转染三个孔。然后向稀释的 DNA 混合物中每微克加入 3 µL 的 Transit-LT1 试剂，用移液器轻轻混匀，室温孵育 30 分钟。孵育后，将 250 µL 转染混合物逐滴加入细胞中，然后在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。转染后，在落射荧光显微镜下观察荧光，细胞应表达黄色荧光以显示BC信号，同时表达CFP荧光以报告转染效率。为进行流式细胞术分析，首先用2毫升冰浴PBS洗涤细胞，然后加入250微升0.05%胰蛋白酶，于37摄氏度孵育2至5分钟以使细胞脱落。随后在显微镜下观察细胞脱落情况。待细胞脱落后，加入一毫升 DMEM 中和胰蛋白酶。接着，将一毫升细胞悬液转移至一个微量离心管中，再将 0.25 毫升细胞悬液转移至第二个微量离心管中。在 500 ×g 条件下离心五分钟。将250微升样品进一步处理用于流式细胞术。将1毫升样品置于冰上，用于后续的西部血液分析，该分析应与Spin Resus步骤平行进行。用250微升Fax缓冲液重悬细胞，并将细胞置于冰上；若流式细胞术分析不能立即进行，细胞也可用含1%多聚甲醛的PBS固定。流式细胞术使用配备488纳米、405纳米和642纳米固态激光器的Beckman Coulter Cyan ADP系统，采用Summit软件进行数据采集与分析。使用标准微球校准流式细胞仪后，以线性刻度绘制前向散射（FSC）对侧向散射（SSC）的散点图，并圈选活细胞群体进行分析。接下来，在非聚集的活细胞群体中，绘制SSC与电压脉冲宽度以及门控图（gait）的关系。然后，在该仪器上以对数尺度绘制FSC在405 nm FL6通道的CFP荧光信号（线性尺度FSC对数尺度CFP荧光）关系，并对非聚集的活CFP阳性细胞进行门控。最后，在该仪器上以488纳米FL1通道的YFP荧光信号（线性尺度FSC对数尺度YFP荧光）绘制FSC与YFP荧光的关系，以观察BC的强度。接下来，运行Y-F-P-C-F-P双阴性样本，并调节F-S-C-S-S-C FL1和FL6的光电倍增管（PMT）电压，以设定每个信号的阈值。随后，运行YFP和CFP单阳性样本，用于后续离线补偿。确保获取至少10,000个门控事件。最后，在完成数据采集后，收集实验样本的数据。根据采集设置分析方案，通过在活细胞的FS CSC点图中设定门控一进行传递。在门控一的FSC脉冲点图中设定门控二，以获取非聚集的活细胞；在门控二的ccfp FSC点图中设定门控三，以获取非聚集的ccfp阳性活细胞。使用YFP和CFP单阳性细胞对Yfp-CFP点图中的YFP和CCFP信号进行补偿后，确定CFP和YFP阳性细胞的阈值线。将CFP阳性细胞的YFP平均荧光强度（MFI）导出至Excel用于数据作图，然后在Excel中将Y-F-P-M-F-I归一化至Western blotting测定的ACAP LBC PDE E 43及上样对照alpha tubulin的表达水平，以确定YFP平均荧光强度的线性范围。在HEK 293细胞中将CFP与VN-ACAP LBC及不同量的VC-PDE E 43共转染，并按照本视频所述方法利用双分子荧光互补流式细胞术检测相互作用；该图显示VC-PDE E 43表达量相对于转染的VC-PDE E 43量的相对倍数变化。由蓝色方块指示的CFP阳性细胞中Venus的平均荧光强度与VCDE 43的表达相关，且与通过蛋白质印迹图像分析确定的表达水平一致，后者由红色三角形表示。各样本间的CFP平均荧光强度相似，如绿色方块所示，该结果作为阴性对照，用于限制细胞间的变异。这些结果验证了通过测量BS e的平均荧光强度，利用流式细胞术定量ACAB LB C PDE 43相互作用的可行性，同时可确定用于筛选的BIC构建体的适当用量，以绘制ACAP LBC在PDE E 43 BIC分析中与全长PDE E 43（fl）结合的结合位点。通过此方法评估了PDE 43的UCR一区以及PDE 43的UCR二区和CAT区，如图所示。vn ACAP LBC与VC PDE 43 UCR二区加CAT共表达时，相较于VC PDE 43全长和VC PDE 43 UCR一区，BC信号更低；在所有流式样本中观察到相似的蛋白表达水平，并将平均荧光强度归一化至ACAP LBC PDE 43和α微管蛋白的相对表达水平。因此，归一化后的B-C-M-F-I结果表明，ACAP LBC PDE 43全长与ACAP LBC PDE 43 UCR一区之间的荧光强度无差异，但ACAP LBC PDE 43 UCR二区加CAT相互作用的信号明显更低。这些结果表明，PDE 43 中存在多个与 ACAP LBC 相互作用的区域，其中 PDE 43 UCR R 是与 ACAP LBC 相互作用的主要区域。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过 BP C 的流式细胞术分析来研究蛋白质-蛋白质相互作用。在进行该实验操作时，重要的是要确定使用适量的 BP C 载体，以获得相似的蛋白质表达水平和线性的 BP C 响应。在此实验基础上，可进一步采用肽段分析或风险分析等其他方法，以确定 PDE 40 D 三中哪些氨基酸残基负责该相互作用。其ACAP与红细胞的相互作用。

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