双分子荧光互补
2011年4月15日
在确定的时空调控细胞信号蛋白质的亚细胞定位是很重要的。在这里，我们描述了一个简单的方法监测在细胞内的蛋白质的空间相互作用的双分子荧光互补（附设）。
该实验旨在确定两种蛋白质是否在细胞中相互作用，并描述该相互作用位点的各个方面。首先，用编码两种目标蛋白的表达构建体转染细胞，其中一种融合到片段化荧光蛋白的末端，另一种融合到片段化荧光蛋白的互补 C 末端。让转染的细胞在培养物中产生荧光信号后，通过成像和免疫印迹观察蛋白质复合物。
接下来，将收集到的图像导出到成像软件中，例如 Image J为了量化 A 对照实验中每个细胞的平均荧光强度，BIFC 结果可以证明蛋白质蛋白质相互作用和这些复合物的定位，如支架蛋白的 SH 三个结构域相交和 PI 3 KC 两个 β 的富含 pro 结构域。与共定位、免疫沉淀和 fret 等现有方法相比，该技术的主要优点是 BFC 允许对细胞中较弱的瞬时相互作用进行空间化定位。而且这种方法不需要像 Flast 那样进行大量的后处理图像。
这种方法可以解决信号转导领域的关键问题，例如 DO 蛋白 X 和 Y 相互作用，如果是这样，这些复合物在细胞中的特定区室是什么？一般来说，这种方法的新手会很挣扎，因为他们没有选择合适的配置来表达他们的活检。目标标记蛋白首先为 BIFC 融合蛋白选择多种荧光基团之一。
考虑到金星的氨基和羧基末端能够在 37 摄氏度下形成络合物，而 Y-F-P-B-I-F-C 片段需要在 30 摄氏度下预孵育。通过考虑 BIFC 片段的附着如何影响目标蛋白质的功能，设计用于标记添加到目标蛋白质的表达载体。例如，RAs 家族、GTP a 在羧基末端进行脂质修饰，如果不破坏这种修饰，就不能在这一端进行标记。
始终进行中试实验以确定转染条件。还可以通过荧光显微镜监测细胞，以确定信号发展的最佳时间。然后进行 western blossom 分析以确认构建体的相等表达。
重要的是，HA或标志标签的免疫染色，以验证添加 BIFC 片段不会改变每个样品板的目标蛋白质的细胞定位。1.3 乘以 5 中的 10 个使细胞分别落到一个玻璃底物质板和六个孔板的两个孔上，并让细胞第二天在 37 摄氏度的培养箱中过夜。制备 DNA 以通过脂质切除术或其他首选方法进行转染。
首先，在 250 μL 无血清 DMEM 中稀释 DNA 作为转染对照。以 1 50 的浓度添加 CFP，即 BIFC DNA 总量。现在用 250 微升无血清 DMEM 稀释嘴唇，每 1 微克 DNA 使用 10 微升嘴唇。
混合 DNA 和唇部稀释液，在室温下孵育 20 分钟。用温热的无血清 DMEM 冲洗细胞两次。向六孔培养皿的每个玻璃底板或孔中加入 2 毫升无血清 DMEM。
然后将每种转染混合物均匀地分装在一个玻璃底培养皿和两个 6 孔中。孔板将细胞在 37 摄氏度下孵育 5 小时。最后，去除转染培养基，并更换为完整的 DMEM 加 10% FBS 培养基。
将细胞孵育中确定的时间，以获得目标蛋白质的必要表达水平。在 epi 荧光显微镜下检查转染的细胞，以确保阳性对照是荧光的。用 PBS 冲洗细胞 3 次以进行活细胞成像。
将细胞置于缺少指示芯片的培养基中。用于固定细胞成像。加入 2% 对位甲醛，置于冰上 10 分钟。
然后用 PBS 冲洗细胞 3 次，现在用 1 毫升 PBS 覆盖，并在 4 摄氏度的黑暗中储存，立即在六孔培养皿中裂解细胞。对于 Western blot 分析，重要的是同时制备所有细胞，以便 lys 细胞代表成像细胞。进行蛋白质印迹以确保标签蛋白以等效水平表达。
使用共聚焦显微镜对细胞进行成像时，在整个实验过程中保持设置恒定非常重要，这样样品之间的荧光才能具有可比性。确保对像素未饱和的单个单元格进行成像。由于 CFP 作为转染对照，因此仅选择 CFP 阳性细胞用于分析 BIFC 信号。
使用成像软件量化荧光，例如图像 J.在图像 J.Go 中打开图像文件以分析固定测量值。选中测量框中的面积和平均灰度值复选框。请注意，在此示例中，静脉图像为伪彩色绿色，而 CFP 图像为伪彩色红色。
使用手绘选择工具，在 CFP 通道中整个单元格的边缘周围绘制一个轮廓，并保留此轮廓。切换到 YFP 频道。去分析，测量平均灰度值反映了每张图像每个细胞的平均荧光强度。
在 YFP 通道中不包含单元格的区域中绘制一个圆。将此区域的测量值作为背景。从每张图像中减去背景。
最后，要计算细胞群的平均荧光强度，请平均一个样品中成像的所有细胞的平均等级值减去背景。理想情况下，在 3 个实验中定量 60 个细胞。多结构域支架蛋白交叉通过调节一种新的 2 类 PI 3 激酶来调节神经元存活，PI 3 KC 两个 β 相交 SH 三个结构域与 PI 3 KC 两个 β 的氨基末端富含脯氨酸的区域相互作用，VN 标记的 VN 转染与 VC 标记的 PI 3 KC 两个 β 相交，导致在 YFP 通道中产生荧光信号， 它是伪绿色，表示复合物形成。
此处以红色表示的 CFP 伪色用作对照，以标记 PI 3 KC 2 β 的脯氨酸富集结构域中的转染细胞突变，其破坏相交的共沉淀，PI 3 KC 2 β 降低 BIFC 信号。BIFC 信号的这种差异不是由于野生型和 PA PI 三种 K 蛋白的表达差异一旦掌握，如果作得当，该技术可以在三天内完成。在执行此程序时，您需要记住运行正确的对照并检查蛋白质表达，以确保 BC 信号的差异是由于复合物形成的差异，而不是由于此程序后的表达。
可以执行其他技术，例如对居民进行表面等离子体分析，以回答诸如这些复合物彼此之间的亲和力有何不同
？查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究介绍了双分子荧光互补（BiFC）作为一种监测蛋白质相互作用和细胞内定位的方法。通过使用BiFC，研究人员可以以直接的方式可视化和定量蛋白质的相互作用。
研究的主要组成部分
科学领域
- 细胞信号传导
- 蛋白质相互作用
- 荧光显微镜
背景
- 理解蛋白质定位对细胞信号传导至关重要。
- BiFC允许在活细胞中可视化蛋白质相互作用。
- 这种方法有利于研究短暂的相互作用。
- 传统方法可能需要大量的后处理。
研究目的
- 确定细胞中两种蛋白质之间的相互作用。
- 识别这些相互作用的具体部位。
- 提供一种可靠的方法来可视化蛋白质复合物。
使用的方法
- 将两种蛋白质的表达构建体转染到细胞中。
- 一种蛋白质与碎片化的荧光蛋白融合。
- 使用成像和免疫印迹来可视化蛋白质复合物。
- 使用成像软件定量荧光强度。
主要结果
- 成功可视化了细胞中的蛋白质相互作用。
- 识别了蛋白质复合物的定位。
- 展示了BiFC相对于传统方法的优势。
- 提供了对特定蛋白质结构域相互作用的洞察。
结论
- BiFC是研究蛋白质相互作用的有效方法。
- 该技术增强了对蛋白质定位的理解。
- 它为现有方法提供了更简单的替代方案。
常见问题
Executive Industry Relevance
Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) enables direct visualization of protein-protein interactions and their subcellular localization, addressing a critical gap in spatially resolved target validation. This capability enhances predictive confidence in early discovery by distinguishing true molecular interactions from background, supporting robust mechanistic de-risking. BiFC's strengths in detecting weak or transient complexes make it a valuable asset for portfolio triage and early-stage decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved interrogation of protein-protein interactions within live cells.
- Supports functional target validation by confirming interaction specificity and compartmentalization.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing direct interactions from co-localization artifacts.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of interaction modulators.
- Delivers quantitative fluorescence outputs for standardized assay development.
- Reduces post-processing requirements compared to FRET, streamlining workflow scalability.
- Enables reliable detection of weak or transient interactions for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by mapping interaction localization in physiologically relevant compartments.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by confirming molecular mechanisms in situ.
- Provides risk-adjusted data for translational biomarker development when supported by interaction specificity.
- Enhances predictive de-risking for preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
BiFC integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for spatially resolved interaction analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing specific protein complexes in live cells.
- Screening: Offers reproducible, quantitative fluorescence readouts for assay standardization and compound screening.
- Analytics: Enables measurement of average fluorescence intensity per cell, supporting comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects molecular interaction data to disease-relevant compartments, informing biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Functions as a broadly applicable capability for diverse protein interaction studies across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows with minimal post-processing.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell transfection, and fluorescence imaging.
- Needs access to confocal microscopy and quantitative imaging software (e.g., ImageJ).
- Demands rigorous control experiments for expression validation and tag localization.
- Must consider tag placement to avoid disrupting protein function or localization.
- Limited by irreversible fluorophore reconstitution and lack of real-time kinetic analysis.
