Name: 双分子荧光互补 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学习双分子荧光互补技术，用于活细胞中蛋白质相互作用及其亚细胞定位的可视化研究。该方法通过分裂荧光蛋白片段重组发光，可检测弱或瞬时相互作用，为信号转导研究提供高分辨率空间信息。

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本方案中使用的 ITSN、PI3K-C2β 及对照载体仅可应要求向作者索取，且仅限用于非商业目的。作者谨此感谢 Chang-Deng Hu 博士为在 O'Bryan 实验室建立 BiFC 方案所提供的宝贵建议和试剂。KAW 的研究由 Jerome Lejeune 基金会提供资助。O'Bryan 实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号 HL090651）、美国国防部（DOD，项目号 PR080428）、St. Baldrick's 基金会以及 Jerome Lejeune 基金会的资助支持。

A. BiFC 校准
<ol>
	<li>选择一种荧光蛋白。 有多种荧光蛋白可用作双分子荧光互补（BiFC）的融合伴侣，例如YFP和Venus（见表1）。Venus的氨基端和羧基端能够在37°C下形成复合物，而YFP的BiFC片段则需要在30°C下预先孵育以促进荧光蛋白的形成2。这种低温孵育可能会影响某些细胞过程，在选择片段时应予以考虑。用于将Venus融合至目标蛋白羧基末端的载体可从Addgene获取（<a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a>；如pBiFC-VN173和pBiFC-VC155），同时还提供可用于对照的其他构建体，例如<a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a>和pBiFC-bFosVC1552。其他载体，包括氨基端Venus载体（pFLAG-VN173和pHA-VC155），可在以下网站获得：<a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/~hu1/</a>。</li>
	<li>标记目标蛋白。 BiFC片段可融合至候选蛋白的氨基端或羧基端。某些蛋白由于功能区域受限，可能无法在任一末端进行标记。例如，Ras GTP酶超家族的许多成员在羧基末端存在脂质修饰，因此无法在该位置连接BiFC片段。因此，在选择融合位点时，应充分评估BiFC片段的连接是否会影响目标蛋白的功能。如果无法确定标记对蛋白功能的影响，应测试多种组合方式。除了BiFC片段外，还可引入肽接头以增加断裂荧光蛋白与候选蛋白之间的灵活性。尽管BiFC载体中的多克隆位点（MCS）编码的短氨基酸序列可能已具备足够的灵活性，但RSIAT、KQKVMNH和RPACKIPNDLKQKVMNH接头已在BiFC实验中成功应用3,9。</li>
	<li>确定转染条件。 在测试多个突变体之前，应先进行若干对照实验。首先应尝试两种BiFC组合：一是两个已知相互作用的野生型蛋白，二是野生型与非相互作用突变体的组合。利用这两种组合，测试不同DNA用量和转染时间，以确定检测候选蛋白BiFC信号的最佳条件。建议在6孔板的每个孔中分别测试0.25 µg、0.5 µg和1.0 µg的每种BiFC构建体。转染后第二天通过荧光显微镜观察细胞，以确定信号发育的最佳时间。来自Addgene的<a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a>和pBiFC-bFosVC1552构建体可作为BiFC实验的有效阳性对照（见上文）。此外，应进行Western blot分析，以确认各构建体表达水平一致。应选择使两个野生型蛋白之间产生荧光信号，而在野生型与突变型蛋白之间几乎无信号的实验条件。最后，应尽可能保持蛋白表达水平较低，以避免非特异性相互作用。</li>
	<li>确定BiFC片段的添加是否改变目标蛋白的亚细胞定位。 每个BiFC构建体均含有HA或FLAG表位标签。应对转染细胞同时进行HA或FLAG表位标签以及内源性蛋白（如可行）的免疫染色，以评估BiFC标签是否影响目标蛋白的定位。</li>
</ol>
B. 细胞的铺板与转染
<ol>
	<li>将COS细胞（每份样品1.3×105个）接种至一个玻璃底Matek培养板以及6孔板中的两个孔中。于37°C培养过夜，使细胞贴壁。也可根据目标候选蛋白的特性，选用其他更相关的细胞类型。</li>
	<li>准备用于转染的DNA。我们通常使用Lipofectamine（Invitrogen）进行COS细胞转染，但其他试剂可能更适合特定细胞系。由于转染混合物需分配至一个玻璃底培养皿和6孔板中的两个孔，因此应根据此分配比例使用相应量的DNA。将DNA溶于250 µL无血清（SF）DMEM中。以总BiFC DNA量的1/5加入CFP作为转染对照。在进行BiFC定量分析时，仅分析CFP阳性的细胞是否存在BiFC信号。请注意，CFP的光谱可能与表1中某些BiFC配对存在重叠，因此可能需要选用其他转染对照。将Lipofectamine溶于250 µL无血清DMEM中（每1 µg DNA使用10 µL Lipofectamine）。混合DNA与Lipofectamine稀释液，室温孵育20分钟。 
	注意：Lipofectamine与DNA的比例可能因细胞类型而异。请根据目标细胞系选择合适的转染方法。</li>
	<li>用预热的无血清DMEM洗涤细胞两次。向每个玻璃底培养板或6孔板的每个孔中加入2 mL无血清DMEM。</li>
	<li>将每份转染混合物等量分配至一个玻璃底培养皿和6孔板的两个孔中。</li>
	<li>于37°C孵育细胞5小时。</li>
	<li>移除转染培养基，并更换为完全培养基（DMEM+10% FBS）。</li>
	<li>于37°C继续孵育过夜。转染后的孵育时间应根据目标蛋白的表达水平进行调整。过长的孵育可能导致非特异性相互作用，因此该步骤需通过实验经验确定最佳条件。</li>
</ol>
C. 成像用细胞的制备
<ol>
	<li>首先在落射荧光显微镜下观察细胞，以确认阳性对照具有荧光信号。若无荧光信号，可能需要将细胞在37°C继续孵育一段时间，直至观察到信号。</li>
	<li>用PBS（pH 7.4）清洗细胞3次。向玻璃底培养皿中的细胞加入2%多聚甲醛（pH 7.4），在冰上固定10分钟。再用PBS（pH 7.4）清洗细胞3次。将细胞置于4°C保存，加入1 mL PBS（pH 7.4）覆盖细胞。成像时不一定需要固定细胞，但一旦BiFC片段重新形成完整的荧光蛋白，该过程不可逆，从而无法分析动态相互作用3。此外，需注意未固定的细胞会持续产生荧光信号。在6孔板中裂解细胞，并制备裂解液用于Western blot分析。所有细胞必须同时处理，以确保裂解样本能够代表成像时的细胞状态。</li>
</ol>
D. 细胞成像
<ol>
	<li>将计算每个细胞的荧光强度。务必对单个细胞进行成像。</li>
	<li>CFP 作为转染对照被引入，仅选择 CFP 阳性细胞用于 BiFC 信号的分析。我们假设，如果细胞成功转染了 CFP，则其同样也转染了 BiFC 构建体。该方法可确保所观察到的无 BiFC 信号的细胞是由于目标蛋白之间缺乏相互作用，而非由于该细胞中缺失一个或两个 BiFC 表达构建体所致。</li>
	<li>我们使用蔡司 LSM 510 共聚焦显微镜进行细胞成像。使用该显微镜时，需保持放大倍数、针孔、探测器增益、放大器偏移、帧尺寸、扫描速度、扫描平均次数和激光功率的一致性。使用任何成像系统时，保持设置恒定都至关重要，以确保不同样本间的荧光信号具有可比性。此外，在定量荧光信号时，必须确保像素未达到饱和状态。</li>
</ol>
E. 荧光定量
<ol>
	<li>可使用任意成像软件对荧光进行定量。我们采用由美国国立卫生研究院（NIH）免费提供的 ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）。在 ImageJ 中打开图像文件，进入“Analyze”菜单，选择“Set Measurements”，在“Measurements”对话框中勾选“Area”和“Mean Gray Value”。</li>
	<li>使用“自由手绘选择”工具，在 CFP 通道中沿整个细胞的边缘绘制轮廓。</li>
	<li>保持该轮廓位置不变，切换至 YFP 通道，进入“Analyze”菜单，点击“Measure”。 
	“Mean Gray Value”表示所选区域内所有像素灰度值的总和除以像素数量（即细胞单位面积的平均荧光强度）。</li>
	<li>对每幅图像，在 YFP 通道中选择一个无细胞区域绘制圆形，测量该区域作为背景值。从每幅图像的测量值中减去背景值。</li>
	<li>计算同一样本中所有成像细胞的（Mean Gray Value 减去背景值）的平均值，该值即为细胞群体的平均荧光强度。建议在三次独立实验中对约 60 个细胞进行定量分析。</li>
</ol>
F. 代表性结果：
我们的实验室专注于多结构域支架蛋白intersectin（ITSN），该蛋白可与多种蛋白质相互作用，调控多个生化和信号通路10,11,12,13,14。ITSN包含两个Eps15同源（EH）结构域、一个卷曲螺旋区以及五个Src同源3（SH3）结构域。ITSN的较长亚型还含有Dbl同源（DH）和pleckstrin同源（PH）结构域，二者协同作用，作为Cdc42的鸟苷酸交换因子15。这种模块化结构促进了蛋白质-蛋白质相互作用，使ITSN成为进行双分子荧光互补（BiFC）实验的理想候选分子。ITSN的亚细胞定位可能改变其结合伙伴，从而影响ITSN所调控的信号通路（未发表数据）。近期，我们的实验室已证明ITSN通过调控一种新型II类PI3K（PI3K-C2β）来调节神经元存活11。PI3K-C2β氨基末端的富含脯氨酸结构域包含两个ITSN的SH3结构域结合位点。通过使用ITSN与PI3K-C2β截短突变体进行共免疫沉淀实验，我们证实ITSN的SH3A和SH3C结构域与PI3K-C2β的氨基末端区域相互作用。接下来，我们利用BiFC技术观察该复合物的亚细胞定位。将ITSN融合至Venus蛋白的氨基末端（pFLAG-VN173），将PI3K-C2β构建体融合至Venus蛋白的羧基末端（pHA-VC155）。作为另一阴性对照，将一个非特异性肽段融合至pHA-VC155。VN-ITSN与VC-PI3K-C2β形成具有点状分布的BiFC复合物（图2A，上排图像）。在PI3K-C2β富含脯氨酸结构域中引入突变，可破坏ITSN与PI3K-C2β的共沉淀，导致BiFC信号减弱（图2A，下排图像）11。ITSN与两种PI3K-C2β蛋白之间BiFC信号的差异并非由蛋白表达水平不同所致（图2B）。
<img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="蛋白质相互作用示意图，VN-VC互补过程，蛋白质片段融合分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 在双分子荧光互补（BiFC）技术中，一种荧光蛋白（此处为Venus）被分割为氨基端（VN）和羧基端（VC）两个片段。这两个片段分别与两种目标蛋白融合。当这两种蛋白发生相互作用时，VN和VC片段会重新结合，从而恢复荧光蛋白的结构，并在蛋白相互作用的位点产生荧光信号。BiFC是蛋白质片段互补分析（protein fragment complementation assay, PCA）的一个具体实例，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用5。
<img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="ITSN与PI3K及CFP共转染细胞的荧光显微镜图像；VC-PI3K与VN-ITSN的蛋白质印迹分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. ITSN与PI3K-C2β形成BiFC复合物。A. 将VN标签的ITSN与VC标签的PI3K-C2β野生型（WT）或富含脯氨酸结构域突变体（PI3K-C2β-PA）共转染细胞。ITSN与野生型PI3K-C2β形成复合物（绿色）。CFP（红色）用作转染对照。B. 通过蛋白质印迹检测各表达载体的表达水平一致。VC标签载体带有HA标签。
<img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="BiFC 片段激发-发射表；荧光光谱分析；实验数据图表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1. 有多种载体可与 BiFC 兼容。YN155：YFP 的 1-155 位氨基酸；YC155：YFP 的 155-238 位氨基酸；YN173：YFP 的 1-172 位氨基酸；YC173：YFP 的 173-238 位氨基酸；VN155：Venus 的 1-154 位氨基酸；VC155：Venus 的 155-238 位氨基酸；VN173：Venus 的 1-172 位氨基酸；VC173：Venus 的 173-238 位氨基酸；CN155：CFP 的 1-154 位氨基酸；CC155：CFP 的 155-238 位氨基酸；GN173：GFP 的 1-172 位氨基酸；CitN155：Citrine 的 1-155 位氨基酸；CitC155：Citrine 的 155-238 位氨基酸；CitN173：Citrine 的 1-172 位氨基酸；CitC173：Citrine 的 173-238 位氨基酸；CerN173：Cerulean 的 1-172 位氨基酸2,3,9。

<ol><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li>
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<li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+can+regulate+the+Ras%2FMAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li>
<li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis%2C+activates+mitogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li>
<li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenesis+and+endocytosis%3A+What%27s+at+the+INTERSECTIoN%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

双分子荧光互补（BiFC）是一种用于在完整细胞中可视化蛋白质-蛋白质相互作用并确定这些复合物亚细胞定位的优良方法。BiFC 的优势在于只有相互作用的蛋白质才会产生荧光，瞬时相互作用可被稳定，且成像数据的后期处理极少。该方法的两个缺点是荧光团成熟所需时间较长，以及荧光团复合物的不可逆性。在某些应用中，这种不可逆性反而可被利用为优势。例如，可将一种酶与其激活剂用于 BiFC 复合物中，从而实现持续性激活，进而确定哪些蛋白质被招募至该复合物。此外，BiFC 复合物的不可逆性有助于识别弱相互作用或瞬时相互作用。适当的对照对于 BiFC 实验结果的解读至关重要。不应使用空的 BiFC 载体作为对照，因为这些试剂会导致较高的背景荧光。合适的对照包括：使用已知可阻断两种蛋白质相互作用的目标蛋白中的突变体，或使用一种不应与目标蛋白形成复合物的无关蛋白。此外，必须进行蛋白质印迹（Western blot）分析，以确保不同构建体的表达水平相等，并排除荧光信号差异源于蛋白表达量不同的可能性。过高的表达水平可能导致非特异性相互作用和荧光信号，因此应将表达水平保持在相对较低的范围。
BiFC 是一种实用的...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底小培养皿</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14C</td><td></td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>Falcon BD</td><td>35-3846</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>18324020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr></tbody></table>

双分子荧光互补

Bimolecular Fluorescence Complementation

明确信号复合物的亚细胞分布对于理解该复合物的功能输出至关重要。 传统的研究方法（如免疫共沉淀）无法提供复合物空间定位的信息。相比之下，双分子荧光互补技术（BiFC）能够监测蛋白质复合物的相互作用及其在亚细胞结构中的定位。该方法将一种荧光蛋白拆分为氨基端和羧基端两个无荧光的片段，并分别与两个目标蛋白融合表达。当目标蛋白发生相互作用时，荧光蛋白片段得以重新组装，恢复荧光信号（图1）1,2。BiFC的一个局限性在于，一旦荧光蛋白片段被重新构建，形成的复合物即不可逆3。这一特性有助于检测短暂或微弱的相互作用，但无法用于分析复合物动态变化的动力学过程。另一个需要注意的问题是，重新组装的荧光蛋白需要约30分钟才能成熟并发出荧光，因此同样无法实现实时相互作用的观测4。BiFC是蛋白质片段互补实验（PCA）的一个具体实例，PCA利用多种报告蛋白来检测蛋白质-蛋白质相互作用，包括绿色荧光蛋白变体（BiFC）、二氢叶酸还原酶、β-内酰胺酶和荧光素酶等5,6。研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的其他方法还包括荧光共定位和弗斯特共振能量转移（FRET）7。在共定位实验中，两种蛋白质可分别直接标记荧光基团，或通过间接免疫荧光进行标记。然而，这种方法容易产生非相互作用蛋白的高背景信号，导致共定位数据难以解释。此外，由于共聚焦显微镜分辨率的限制，两种蛋白质可能在图像上呈现共定位，但实际上并未发生相互作用。而在BiFC中，只有当两个目标蛋白发生相互作用时才会产生荧光信号。FRET是研究蛋白质-蛋白质相互作用的另一种优秀方法，但技术上具有较高挑战性。FRET实验要求供体和受体在细胞内的亮度和化学计量比相近，同时还必须校正供体信号渗漏至受体通道以及受体信号反向渗漏的问题。与FRET不同，BiFC具有背景荧光低、图像数据后处理少、无需高水平过表达、且能够检测微弱或瞬时相互作用等优势。生物发光共振能量转移（BRET）是一种类似于FRET的方法，区别在于其供体为一种酶（例如荧光素酶），可通过催化底物产生生物发光，从而激发受体。BRET避免了信号渗漏和高背景荧光的技术难题，但由于底物无法特异性地定位于特定亚细胞区域，因而难以提供空间定位信息8。总体而言，BiFC是一种优异的方法，可用于可视化蛋白质复合物的亚细胞定位，进而深入理解区室化信号转导机制。

蛋白质的亚细胞定位对于确定细胞信号传导的时间和空间调控至关重要。本文中，我们介绍双分子荧光互补（BiFC）技术，作为一种在细胞内监测蛋白质空间相互作用的简便方法。

定义信号复合物的亚细胞分布对于理解该复合物的功能输出至关重要。传统方法如……

本实验旨在确定两种蛋白质在细胞内是否发生相互作用，并阐明相互作用位点的相关特征。首先，将表达载体转染至细胞中，这些载体分别编码两种目标蛋白质，其中一种蛋白质与断裂的荧光蛋白的N末端片段融合，另一种蛋白质则与断裂的荧光蛋白的互补C末端片段融合。在转染后的细胞于培养过程中产生荧光信号后，通过成像和免疫印迹技术对形成的蛋白质复合物进行可视化检测。接下来，将采集的图像导出至图像分析软件（如 Image J），以量化每个细胞的平均荧光强度。在受控实验中，BIFC 结果可展示蛋白质-蛋白质相互作用以及这些复合物的定位情况，例如支架蛋白中的 SH3 结构域与 PI3KC2β 中的富含脯氨酸结构域之间的相互作用。与现有的共定位、免疫共沉淀和 FRET 等方法相比，该技术的主要优势在于，BIFC 能够实现细胞内较弱且瞬时相互作用的空间定位，并且该方法无需像 FRET 那样进行复杂的图像后期处理。该方法可解决信号转导领域中的关键问题，例如蛋白质X与Y是否相互作用，如果存在相互作用，这些复合物在细胞内的具体定位区域是什么？通常，初学者在使用该方法时会遇到困难，因为他们未选择合适的表达活检样本的配置。首先为感兴趣的靶蛋白选择BIFC融合蛋白所用的多种荧光染料中的一种。需要注意的是，Venus 蛋白的氨基端和羧基端能够在 37 摄氏度下形成复合物，而 Y-F-P-B-I-F-C 片段则需要在 30 摄氏度下预先孵育。在设计用于为目标蛋白添加标签的表达载体时，应考虑 BIFC 片段的连接是否会影响目标蛋白的功能。例如，Ras 家族的 GTP 酶在羧基末端会发生脂质修饰，若在此末端添加标签会破坏该修饰过程，因此不能在这一端进行标记。始终进行预实验以确定转染条件。同时通过荧光显微镜观察细胞，以确定信号表达的最佳时间。然后进行蛋白质印迹分析，以确认各构建体的表达水平相等。重要的是，对每个样品板进行HA或Flag标签的免疫染色，以验证BIFC片段的添加不会改变目的蛋白的细胞定位。将1.3×10⁵个细胞分别接种到一个玻璃底培养板以及六孔板的两个孔中，并在37°C培养箱中静置过夜；次日，通过脂质体转染或其他偏好的方法制备用于转染的DNA。首先，将 DNA 溶于 250 µL 无血清 DMEM 中，作为转染对照。加入 CFP，其量为总 BIFC DNA 量的五十分之一。然后，每 1 µg DNA 使用 10 µL 脂质体，将脂质体溶于 250 µL 无血清 DMEM 中。将DNA与脂质稀释液混合，在室温下孵育20分钟。用预热的无血清DMEM洗涤细胞两次。向每个玻底培养皿或六孔板的每个孔中加入2毫升无血清DMEM。然后将每份转染混合物均匀分配至一个玻璃底培养皿和六孔板中的两个孔，于37摄氏度培养细胞5小时。最后，移除转染培养基，更换为含10% FBS的完全DMEM培养基。根据预实验确定的时间孵育细胞，以获得目标蛋白所需的表达水平。在落射荧光显微镜下观察转染后的细胞，确保阳性对照具有荧光信号。进行活细胞成像前，用PBS洗涤细胞三次。将细胞置于不含指示剂染料的培养基中。用于成像固定细胞时，加入2%多聚甲醛，冰上放置10分钟。然后用 PBS 清洗细胞三次，每次加入一毫升 PBS，清洗后将细胞置于四摄氏度避光保存，并立即在六孔板中裂解细胞。进行 Western 印迹分析时，所有细胞必须同时制备，以确保裂解细胞能代表成像细胞的状态。通过 Western 印迹检测，确认标签蛋白的表达水平相当。使用共聚焦显微镜对细胞成像时，需在整个实验过程中保持设置恒定，以确保不同样本间的荧光信号具有可比性。务必对单个细胞进行成像，确保像素未达到饱和。由于实验中使用CFP作为转染对照，因此仅选择CFP阳性细胞进行BIFC信号分析。使用成像软件（如 ImageJ）对荧光进行定量。在 ImageJ 中打开图像文件。进入“分析”菜单，选择“设置测量”。在测量选项框中，勾选“面积”和“平均灰度值”。请注意，在本示例中，静脉图像被伪染为绿色，而 CFP 图像被伪染为红色。使用自由选择工具，在CFP通道中围绕整个细胞的边缘绘制轮廓，并保持该轮廓位置不变。切换到YFP通道，进入分析菜单，测量平均灰度值，该值反映每张图像中每个细胞的平均荧光强度。在不含细胞的区域，于YFP通道中画一个圆。对该区域进行测量，作为背景值。从每张图像中减去该背景值。最后，为了计算一组细胞的平均荧光强度，需对一个样本中所有成像细胞的平均灰度值减去背景值后取平均。理想情况下，应在三次实验中定量分析共计60个细胞。多结构域支架蛋白intersectin通过调控一种新型II类PI3激酶PI3KC2β来调节神经元存活；intersectin的SH3结构域与PI3KC2β氨基末端的富含脯氨酸区域相互作用；将VN标签的intersectin与VC标签的PI3KC2β共转染后，可在YFP通道中检测到荧光信号，该信号被伪彩显示为绿色，表明复合物形成。此处将CFP伪染为红色，用作标记转染细胞的对照。PI3Kc2β脯氨酸富集区的突变会破坏intersectin与PI3Kc2β的共沉淀，从而降低BIFC信号。BIFC信号的这种差异并非源于野生型与PA型PI3K蛋白表达水平的不同。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三天内完成。进行该实验时，需注意设置适当的对照，并检测蛋白表达情况，以确保BC信号的差异是由复合物形成差异所致，而非蛋白表达差异所致。还可以采用表面等离子体共振等技术来研究这些复合物彼此之间的亲和力差异等问题。

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双分子荧光互补

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