双分子荧光互补

该实验旨在确定两种蛋白质是否在细胞中相互作用，并描述该相互作用位点的各个方面。首先，用编码两种目标蛋白的表达构建体转染细胞，其中一种融合到片段化荧光蛋白的末端，另一种融合到片段化荧光蛋白的互补 C 末端。让转染的细胞在培养物中产生荧光信号后，通过成像和免疫印迹观察蛋白质复合物。

接下来，将收集到的图像导出到成像软件中，例如 Image J为了量化 A 对照实验中每个细胞的平均荧光强度，BIFC 结果可以证明蛋白质蛋白质相互作用和这些复合物的定位，如支架蛋白的 SH 三个结构域相交和 PI 3 KC 两个 β 的富含 pro 结构域。与共定位、免疫沉淀和 fret 等现有方法相比，该技术的主要优点是 BFC 允许对细胞中较弱的瞬时相互作用进行空间化定位。而且这种方法不需要像 Flast 那样进行大量的后处理图像。

这种方法可以解决信号转导领域的关键问题，例如 DO 蛋白 X 和 Y 相互作用，如果是这样，这些复合物在细胞中的特定区室是什么？一般来说，这种方法的新手会很挣扎，因为他们没有选择合适的配置来表达他们的活检。目标标记蛋白首先为 BIFC 融合蛋白选择多种荧光基团之一。

考虑到金星的氨基和羧基末端能够在 37 摄氏度下形成络合物，而 Y-F-P-B-I-F-C 片段需要在 30 摄氏度下预孵育。通过考虑 BIFC 片段的附着如何影响目标蛋白质的功能，设计用于标记添加到目标蛋白质的表达载体。例如，RAs 家族、GTP a 在羧基末端进行脂质修饰，如果不破坏这种修饰，就不能在这一端进行标记。

始终进行中试实验以确定转染条件。还可以通过荧光显微镜监测细胞，以确定信号发展的最佳时间。然后进行 western blossom 分析以确认构建体的相等表达。

或标志标签的免疫染色，以验证添加 BIFC 片段不会改变每个样品板的目标蛋白质的细胞定位。1.3 乘以 5 中的 10 个使细胞分别落到一个玻璃底物质板和六个孔板的两个孔上，并让细胞第二天在 37 摄氏度的培养箱中过夜。制备 DNA 以通过脂质切除术或其他首选方法进行转染。

首先，在 250 μL 无血清 DMEM 中稀释 DNA 作为转染对照。以 1 50 的浓度添加 CFP，即 BIFC DNA 总量。现在用 250 微升无血清 DMEM 稀释嘴唇，每 1 微克 DNA 使用 10 微升嘴唇。

混合 DNA 和唇部稀释液，在室温下孵育 20 分钟。用温热的无血清 DMEM 冲洗细胞两次。向六孔培养皿的每个玻璃底板或孔中加入 2 毫升无血清 DMEM。

然后将每种转染混合物均匀地分装在一个玻璃底培养皿和两个 6 孔中。孔板将细胞在 37 摄氏度下孵育 5 小时。最后，去除转染培养基，并更换为完整的 DMEM 加 10% FBS 培养基。

将细胞孵育中确定的时间，以获得目标蛋白质的必要表达水平。在 epi 荧光显微镜下检查转染的细胞，以确保阳性对照是荧光的。用 PBS 冲洗细胞 3 次以进行活细胞成像。

将细胞置于缺少指示芯片的培养基中。用于固定细胞成像。加入 2% 对位甲醛，置于冰上 10 分钟。

然后用 PBS 冲洗细胞 3 次，现在用 1 毫升 PBS 覆盖，并在 4 摄氏度的黑暗中储存，立即在六孔培养皿中裂解细胞。对于 Western blot 分析，重要的是同时制备所有细胞，以便 lys 细胞代表成像细胞。进行蛋白质印迹以确保标签蛋白以等效水平表达。

使用共聚焦显微镜对细胞进行成像时，在整个实验过程中保持设置恒定非常重要，这样样品之间的荧光才能具有可比性。确保对像素未饱和的单个单元格进行成像。由于 CFP 作为转染对照，因此仅选择 CFP 阳性细胞用于分析 BIFC 信号。

使用成像软件量化荧光，例如图像 J.在图像 J.Go 中打开图像文件以分析固定测量值。选中测量框中的面积和平均灰度值复选框。请注意，在此示例中，静脉图像为伪彩色绿色，而 CFP 图像为伪彩色红色。

使用手绘选择工具，在 CFP 通道中整个单元格的边缘周围绘制一个轮廓，并保留此轮廓。切换到 YFP 频道。去分析，测量平均灰度值反映了每张图像每个细胞的平均荧光强度。

在 YFP 通道中不包含单元格的区域中绘制一个圆。将此区域的测量值作为背景。从每张图像中减去背景。

最后，要计算细胞群的平均荧光强度，请平均一个样品中成像的所有细胞的平均等级值减去背景。理想情况下，在 3 个实验中定量 60 个细胞。多结构域支架蛋白交叉通过调节一种新的 2 类 PI 3 激酶来调节神经元存活，PI 3 KC 两个 β 相交 SH 三个结构域与 PI 3 KC 两个 β 的氨基末端富含脯氨酸的区域相互作用，VN 标记的 VN 转染与 VC 标记的 PI 3 KC 两个 β 相交，导致在 YFP 通道中产生荧光信号， 它是伪绿色，表示复合物形成。

此处以红色表示的 CFP 伪色用作对照，以标记 PI 3 KC 2 β 的脯氨酸富集结构域中的转染细胞突变，其破坏相交的共沉淀，PI 3 KC 2 β 降低 BIFC 信号。BIFC 信号的这种差异不是由于野生型和 PA PI 三种 K 蛋白的表达差异一旦掌握，如果作得当，该技术可以在三天内完成。在执行此程序时，您需要记住运行正确的对照并检查蛋白质表达，以确保 BC 信号的差异是由于复合物形成的差异，而不是由于此程序后的表达。

可以执行其他技术，例如对居民进行表面等离子体分析，以回答诸如这些复合物彼此之间的亲和力有何不同