对于血液处理快速的方法，以提高血浆肽水平的人血产量

这种 RAPID 方法的总体目标是提高人血中待测内源性肽激素的产量。RAPID 方法最近被建立用于大鼠，也适用于人血液。RAPID 方法提高了产量，并允许检测内源性肽的正确分子形式。

RAPID 方法易于使用。然而，与标准血液采样相比，RAPID 方法更耗时且更昂贵。因此，它可能更适用于研究环境。

该方法的目视演示至关重要，因为样品的及时稀释和洗脱对于确保适当的肽水平非常重要。禁食一夜后，在标准化时间从前臂静脉采集静脉血。并根据标准程序或 RAPID 方法进行处理。

指导受试者在抽血前不要运动或吸烟。对于标准处理，在含有 EDTA 的冷冻管中采集血液，并在 4 摄氏度下以 3000 Gs 在 10 分钟内离心 10 分钟。收集上清液，并保持零下 80 摄氏度，直到通过放射免疫测定法进一步处理。

对于 RAPID 处理，立即在冰冷的 RAPID 缓冲液中将血液稀释 1 至 10。PH 值为三点六，含零点一摩尔铵酸铵。零点五摩尔氯化钠和酶抑制剂。

在 10 分钟内，将 RAPID 样品在 4 摄氏度下以 3000 Gs 离心 10 分钟，并使用移液器收集上清液。接下来，以每分钟 10 毫升的速度用 100% 放线腈充注色谱柱。用 0.1% 三氟乙酸或 TFA 平衡后。

使用注射泵以每分钟 1 mL 的恒定速率上样 RAPID 样品上清液。用 3 mL 0.1% TFA 以每分钟 10 mL 的速度清洗小柱后，用 2 mL 含 0.1% TFA 的 70% 乙腈以每分钟 2 mL 的速度缓慢洗脱 RAPID 样品。使用真空离心干燥洗脱的样品，并储存在零下 80 摄氏度，直到通过放射免疫测定进一步处理。

获得碘 125 放射性标记的人肽。将肽保持粉末形式，直到实验开始。然后用 0.1% 乙酸新鲜稀释。

对于标准处理，抽血后立即放入含有 EDTA 的冷藏试管中，将 1 毫升血液转移到含有 50 微升放射性标记物的试管中，含有 3000 至 6000 CPM。对于 RAPID 处理，将 1 毫升含有血液的 EDTA 转移到装有 9 毫升 RAPID 缓冲液的试管中，500 微升放射性标记含有 30， 000 至 60， 000 CPM。由于 1 比 10 的稀释度，使用大 10 倍体积的放射性标记进行 RAPID 处理。

在应用 RAPID 方法的不同步骤后，立即使用 γ 计数器评估放射性标记肽的回收率。不要通过真空离心来干燥样品，并注意在零下 80 摄氏度下储存。为了进行测量，将上清液转移到适合 γ 计数器的试管中。

并评估每分钟的计数。测量标准样品中的整个上清液。在 RAPID 样品中，分析总体积的十分之一，以获得相当数量的放射性标记物。

作为 100% 标准品，使用两个样品，其中含有 50 μL 碘 125 放射性标记肽，且未进行处理。同时测量所有样品的放射性。在含有 EDTA 的冷冻试管中抽血，并将 1 毫升转移到装有 200 微升放射性标记的酰基生长素释放肽（含有 15， 000 至 20， 000 CPM）的试管中，用于标准处理。

对于 RAPID 处理，将 1 毫升血液转移到装有 9 毫升快速缓冲液和 200 微升含有 15， 000 至 20， 000 CPM 的放射性标记酰基生长素释放肽的试管中。之后，像以前一样处理样品。如需通过反相 HPLC 进行进一步分析，请将样品直接上样到稳定键合的 C18 色谱柱上，该色谱柱在 17% 乙腈和补充 0.1% TFA 的水中平衡。

平衡 5 分钟后，使用 17% 至 40% 乙腈的梯度，在 40 分钟内以每分钟 1 mL 的速度洗脱样品。每分钟收集 1 毫升的馏分，并使用 γ 计数器分析放射性。在单独的实验中，将 200 微升含有 15， 000 至 20， 000 CPM 的放射性标记的酰基生长素释放肽直接加载到色谱柱上，并像以前一样进行 HPLC。

对于放射免疫测定，在室温下解冻冷冻上清液和真空干燥粉末。在放射免疫测定之前，根据血浆的原始体积，将干燥的 RAPID 样品重新悬浮在双蒸水中。根据制造商的方案，使用商业放射酰蛋白释放肽和总生长素释放肽以及酰基生长素释放肽

使用硼硅酸盐管，以便稳定地形成调色板。第一天，将样品与检测缓冲液和初级抗体在制造商提供的稀释液中孵育 24 小时。第 2 天，加入碘 125 示踪剂，涡旋，孵育 24 小时。

第 3 天，加入沉淀试剂，涡旋，并按照制造商的建议进行孵育。然后，将试管在 4 摄氏度下以 3， 000 Gs 离心 20 分钟。除去上清液并使用 γ 计数器计算调色板中的放射性。

计算癸酰基生长素释放肽，即总生长素释放肽减去酰基生长素释放肽的差值。通过逐个十酰基生长素释放肽对每个样品进行潜水来评估酰基、癸酰基生长素释放肽比率。如果可能，在一个批次中处理所有样品，以避免批间差异。

与标准血液处理相比，RAPID 血液处理提高了人血液中碘 125 放射性标记肽的产量。经过标准血液处理后，9 种肽的放射性标记肽的回收率在 48% 到 68% 之间。RAPID 处理提高了所有碘 125 标记肽的产量，回收率范围为 71% 至 98%此处显示的是标准或 RAPID 血液处理后碘 125 标记的酰基生长素释放肽在人血液中的洗脱曲线。

RAPID 处理后，碘 125 标记的生长素释放肽逃脱在预期位置。而在标准程序之后，观察到较早的峰值。可能对应于 desacyl ghrelin。

这代表肽的降解率为 62%。与标准处理相比，RAPID 血液处理提高了酰基、癸酰基生长素释放肽的比率。RAPID 处理后，正常体重受试者血液中的酰基、癸酰基生长素释放肽比值为 1 比 3。

与标准血液处理后的 1 到 23 相比。在厌食症和肥胖条件下观察到类似的结果。与标准处理相比，RAPID 血液处理导致内源性 kisspeptin 血液水平升高。

在厌食症和正常体重受试者中，与标准处理相比，RAPID 后循环内源性 kisspeptin 水平显着升高。在肥胖条件下，差异没有达到显着性。一旦掌握并正确执行，这项技术可以在不到一小时的时间内完成。

当肽的预期浓度较低或组间差异较小时，此方法尤其重要。不能给出肽的一般推荐。每种肽的潜在益处应在开始时测试一次。

这项技术为不同领域的研究人员探索内源性肽激素的产量铺平了道路，更重要的是，探索内源性肽激素的正确分子形式。观看此视频后，您应该对如何将 RAPID 方法应用于人体血液处理有一个很好的了解。