Name: 在脑片全细胞膜片钳记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学习在新鲜脑片上进行全细胞膜片钳记录技术，用于研究神经元的电生理特性和功能变化。该方法帮助研究人员探索特定脑区神经元的活动模式及其在完整神经回路中的作用。

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本研究得到了德克萨斯大学西南医学中心启动资金（SK）的支持。

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<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique.</a> Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).</li>
<li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).</li>
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<li>Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPAR-Independent+Effect+of+Striatal+aCaMKII+Promotes+the+Sensitization+of+Cocaine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward.</a> J Neurosci. , (2012).</li>
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<li>Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+neurons%2C+opposite+adaptations%3A+psychostimulant+experience+differentially+alters+firing+properties+in+accumbens+core+versus+shell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell.</a> J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).</li>
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<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+adaptations+in+the+nucleus+accumbens+caused+by+experiences+linked+to+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse.</a> Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).</li>
<li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+in+selectively+activated+nucleus+accumbens+neurons+following+cocaine+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization.</a> Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).</li>
<li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li>
<li>Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+patch+clamp%3A+nanotechnologies+for+intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording.</a> Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale-targeted+patch-clamp+recordings+of+functional+presynaptic+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels.</a> Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).</li>
</ol>

所有作者均无竞争利益或利益冲突。

本方案描述了在脑片神经元上进行全细胞膜片钳实验的基本操作流程。然而，该技术的复杂性、潜力和敏感性无法在本文中得到全面阐述。在此，我们力求阐明最基本的步骤，并强调为获得成功且严谨的全细胞记录所必须控制的关键参数。为进一步深入理论学习，已有大量书籍和文章发表，内容涵盖脑片全细胞膜片钳记录技术3,21-24，以及优化所用溶液以提高细胞存活率的方法25-27。要常规性地完成高质量记录，需要通过大量实践来不断提升操作技能。尽管如此，只要正确实施上述步骤，即使在动物死亡数小时后仍可对细胞进行膜片钳记录，从而获得有关突触功能和固有兴奋性变化的重要信息。
一般来说，除了需要仔细配制人工脑脊液（ACSF）和细胞内微电极溶液外，从脑组织解剖、切片、形成成功的全细胞记录构型，到获得严谨且无偏倚的数据，每一步骤都需要大量练习。其中，制备出健康的脑片尤为关键。简而言之，应迅速完成脑组织的解剖（理想情况下 &#60;45 秒）、切片过程中维持低温（0 - 2 °C）以及使用合适的切片液，均在保障细胞活性方面发挥重要作用。值得注意的是，不同实验室之间，以及根据所研究的...

膜片钳技术是一种于20世纪70年代末发展起来的电生理学技术1,2，是研究活体组织中单个或多个离子通道功能的主要工具。在可实现的不同膜片钳构型中，全细胞膜片钳记录能够用于研究神经元大部分区域的电学行为。传统上，该技术在体外（in vitro）进行，实验对象包括脑切片、新鲜分离的神经元或细胞培养模型3。当在脑切片中的神经元上实施该技术时，具有多项优势：（i）神经元所处的脑环路相对完整，与细胞培养制备物相比，在一定程度上提供了更具生理相关性的环境3，从而能够捕捉早期事件，甚至实时监测由任何类型的急性药理学干预所触发的细胞和分子事件——这种时间分辨率是经典在体（in vivo）条件下无法实现的；（ii）能够通过视觉识别脑切片中的特定脑区，从而对所研究的脑区以及表达荧光标记物的特定神经元实现高度区域特异性3；（iii）通过打开细胞质膜的较大区域，可进入细胞内空间（与使用尖锐微电极穿刺细胞膜进行细胞内记录的方法不同）4。这使得可以改变内液中特定离子的成分或浓度，从而在不同条件下研究分子靶点或细胞机制。例如，在建立全细胞构型后，任何可加入记录微电极（膜片钳电极）溶液中的特定药理学试剂（例如，拮抗剂）均可直接扩散至细胞质中，并作用于其潜在的细胞内靶点，而不会影响邻近细胞中的靶功能。此外，与尖锐微电极记录相比，膜片钳电极尖端的较大开口具有更低的电阻和更少的干扰噪声，因而能更有效地实现对细胞内部的电学访问4。然而需要注意的是，电极尖端的较大开口可能导致细胞透析，从而造成细胞内分子机制的流失，而这些机制可能对正在研究的生物学现象的表达至关重要5,6。在此情况下，尖锐电极记录可能更为合适。此类记录需使用孔径远小于全细胞记录所用电极的微电极，从而最大限度地减少细胞内空间与电极内溶液之间的离子交换。
任何形式的经历（急性或慢性），包括学习7-10，滥用药物的暴露11,12，应激13,14, 等等。，可改变特定脑区神经元功能的多个方面。由于这些改变通常需要一定时间才能形成（数小时至数天），因此对经历特定经验的动物进行脑切片全细胞记录，可使研究人员识别出这些变化。基本上，参与神经元功能的许多（即使不是全部）组分例如、配体门控离子通道、电压门控离子通道、神经递质转运体）从而影响脑环路活动和行为，可因经验而发生改变（经验依赖性可塑性）10,15-17在神经元层面，脑环路活动源于突触间持续不断的相互作用（例如，谷氨酸传递）和细胞内在兴奋性因素（例如，轴突-胞体-树突离子通道：钠、Na+；钾，K+；以及钙，Ca2+在特定条件下，利用全细胞膜片钳电生理技术，可分离出特异性来源于突触兴奋性与固有兴奋性变化的信号改变。
在大多数情况下，突触兴奋性通过全细胞电压钳技术进行评估. 这种记录模式可用于测量离子电流[例如，通过神经元质膜上的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPA受体）和N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA受体）介导，在膜电位钳制于设定电压的条件下进行。在此实验中，研究者使用含有铯（Cs+），一种广谱的 K 通道阻滞剂+ 通道（关键的内在兴奋性因素）。在建立全细胞构型后，Cs的扩散+ 在细胞内空间中会阻断K+ 通道，从而实现相对高效的空间钳制，并避免固有兴奋性因素对其他测量结果的影响。空间钳制问题， 即，当记录不规则形状的细胞时，全细胞电压钳制的难度会增加（例如，神经元），尤其是具有庞大而复杂树突分支的神经元18,19由于体细胞电压钳对神经元树突树的电压控制效果较差，所研究的树突电信号的各个方面会以依赖于树突距离的方式发生扭曲。结合药物学工具（如匹罗毒素（γ-氨基丁酸，GABA）A 受体拮抗剂）或犬尿酸（谷氨酸受体广谱阻断剂）溶解于细胞外溶液（人工脑脊液，ACSF）中，该技术可实现对谷氨酸受体和GABAAR介导的电流。
相比之下，固有兴奋性通常在电流钳记录模式下进行评估。与电压钳记录不同，这种记录模式能够测量离子电流流经神经元质膜所引起的膜电位变化。通常，通过神经元产生动作电位能力的变化来评估固有兴奋性的改变，而动作电位的产生依赖于Na+和K+通道。因此，在进行电流钳记录时，微电极内填充含有K+而非Cs+的内液。结合在ACSF中溶解的阻断谷氨酸和GABAA受体介导电流的药理学试剂，该实验设计可在不受突触兴奋性因素变化干扰的情况下，特异性地测量固有因素（例如，K+通道）对神经元放电活动的贡献。
本文将介绍实现以下目标所需的基本操作步骤：（i）制备健康的脑片；（ii）建立全细胞记录构型；以及（iii）监测基本参数，以评估突触和固有兴奋性。

<table><tbody><tr><td>孤立脉冲刺激发生器</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>隔离单元（ISO-Flex）</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>计算机控制放大器&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>数字采集系统</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>灌流室及在线加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>成像相机</td><td>Q Imaging</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Narishige 微电极拉制仪 PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>切片固定装置（琴弦式）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>切片孵育室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>非金属注射器针头</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>热熔胶枪</td><td>Home Depot</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>气体分散管</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>断头剪</td><td>Home Depot</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>3号手术刀柄</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>小型直头尖头剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>血管插管镊&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500453</td><td></td></tr><tr><td>弯头止血钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>经济型镊子 #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>挖取式刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;铯葡萄糖酸盐内液（pH 7.2&amp;ndash;7.3，280&amp;ndash;290 mOsm）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>D-葡萄糖酸 50%&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铯（CsOH）50%&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl，2.8 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，20 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA，0.4 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>氯化四乙铵，5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;GTP，0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP，2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;钾葡萄糖酸盐内液（pH 7.2&amp;ndash;7.3，280&amp;ndash;290 mOsm）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>K D-葡萄糖酸盐，120 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl，20 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，10 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA，0.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;GTP，0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP，2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;标准人工脑脊液（ACSF，渗透压 &amp;asymp; 300–310 mOsm）&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>KCl，2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl，119 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，1 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3,&lt;/sub&gt; 26.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖，11 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;·7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，1.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;配制溶液所用的其他化合物&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>犬尿烯酸</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

脑片中的全细胞膜片钳记录

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

全细胞膜片钳记录是一种电生理技术，可用于研究神经元大部分区域的&#160;电学特性。在此配置中，微电极与细胞膜形成紧密接触，防止电流泄漏，从而比先前使用的细胞内尖电极记录方法提供更准确的离子电流测量结果。传统上，全细胞记录可在多种制备类型的神经元上进行，包括细胞培养模型、离体神经元、脑片中的神经元，以及完整麻醉或清醒动物体内的神经元。总之，该技术极大地促进了人们对可兴奋细胞被动和主动生物物理特性的理解。该技术的一个主要优势在于，它能够实时提供特定干预（例如，药理学处理、实验者诱导的可塑性）如何改变特定神经元功能或通道的信息。此外，细胞膜的显著开放使得电极内溶液可自由扩散至细胞质中，从而可在不改变邻近细胞功能的情况下，将药物（例如，特定细胞内蛋白的激动剂或拮抗剂）引入细胞并靶向调控这些分子。本文将重点介绍在脑片神经元上进行的全细胞记录&#160;，这种制备方式的优势在于可在相对完整保存的脑环路中记录神经元活动，即在生理相关背景下进行研究。特别是&#160;，当结合适当的药理学手段时，该技术是一种强大工具，可用于识别在经历各种经验（如学习、药物滥用暴露和应激）后发生的特定神经适应性变化。总之，脑片中的全细胞膜片钳记录为在离体制备中检测完整清醒动物体内形成的神经元功能长期改变提供了有效手段。

温度是实验者易于控制的一个因素，它会影响离子通道和受体的生物物理特性，从而影响突触后电流（PSCs，包括EPSC和IPSCs）的波形以及神经元产生动作电位的能力。 图3 和 图4 分别显示温度对神经元放电以及诱发电兴奋性突触后电流（eEPSCs）斜率的影响。放电模式（图3) (即，到达1的潜伏期st 峰电位、峰电位数量、频率以及动作电位波形）由特定电压门控离子通道（Na+，Ca2+，以及 K+），该过程对温度敏感。 图3 显示平均尖峰数量随温度升高而增加。请注意，在此处描述的实验条件下（MSNs 记录），尽管在亚生理温度下尖峰频率似乎未发生改变，28 °C），当温度达到生理相关水平时，其显著增加32 °C). 图4A 显示了eEPSC斜率（常用于评估突触强度的一个参数）随温度升高而增加的示例。...

本方案描述了进行全细胞膜片钳记录的基本操作步骤。该技术可用于研究&#160;神经元的电学行为，且在脑切片中进行时，可评估仍相对完整地整合于保存较好的脑环路中的神经元的多种功能。

全细胞膜片钳记录是一种电生理学技术，可用于研究细胞较大区域的电学特性……

本实验的主要目标是描述如何在新鲜制备的脑片中进行全细胞膜片钳记录。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如实验性控制操作如何改变特定脑区中特定神经元的活动。该技术的主要优势在于，它提供了一种手段，可鉴定在完整且清醒动物体内已形成的神经元功能的离体长期改变。尽管该方法可用于研究脑片中的神经元功能，但也适用于其他系统，例如培养细胞和活体神经元。本实验操作将由我实验室的学生 Francisco Garcia-Oscos 进行演示。开始此操作时，使用带有塑料修剪尖端的移液管，从恢复室中轻轻吸取一片脑片。将移液管放入记录室中，轻轻挤压，使脑片从移液管中缓慢释放至记录室底部铺好的盖玻片上。接着，使用显微镜4倍物镜，调整脑片位置，使目标区域精确位于记录室中央。待达到理想位置后，使用切片固定装置（又称harp）固定脑片位置。随后，切换至40倍物镜，轻轻 lowering 镜头直至其接触灌流室中的人工脑脊液（ACSF）。接着使用微调旋钮将组织调至清晰对焦。当焦平面位于组织水平时，观察目标区域内的细胞。现在，寻找一个目标细胞。在计算机屏幕上标记该细胞，以帮助引导记录用微电极。升高物镜，为放置记录用微电极留出足够的空间。在此步骤中，使用1毫升注射器、非金属微量注射针和专用滤器，将预先配制的内液充入微量移液管中。确保微量移液管中无气泡。然后将微量移液管放入电极夹持器中，使溶液与涂有氯化银的导线电极接触。拧紧移液管帽，使锥形垫圈在微移液管周围形成密封。然后，在将微移液管浸入ACSF之前，通过连接至移液管 holder 的充气注射器施加正压，以防止碎屑进入。使用显微操作器将移液管引导至记录室，使其大致位于浸没式物镜中心的下方。使用显微操作器以中高速移动微电极时，在计算机屏幕上定位微电极，并沿XY轴将其引导至细胞位置。同时，通过施加电压阶跃测量微电极阻抗。施加正压以清除可能阻塞微电极的气泡或其他异物。清除微移液管后，进行电压调零以将移液管电流降至零。使用显微镜的细调焦旋钮，开始向下调焦的同时逐渐降低微移液管。务必先向下调焦，再将微移液管降至焦平面，以确保微移液管尖端不会突然刺入脑片。当微量移液管接触到切片表面时，将显微操作器速度调至中低档。轻轻施加轻微的正向压力，以清除路径上的碎屑。然后通过交替调节XYZ控制旋钮，或通过同时改变X轴和Z轴（旋转Z轴旋钮）的对角线方式接近细胞。当微量移液器接近细胞至足够近时，细胞表面会出现一个凹陷。此时通过连接移液器 holder 吸管的管道施加短暂而微弱的负压，以形成封接。在吉欧封接（giga-seal）形成过程中，使用计算机控制的放大器指令将细胞的钳制电位调节至生理静息电位，以防止膜破裂后发生突然的电位变化。在吉欧封接形成后，补偿快速或慢速电容。在此过程中，施加的吸力切勿过强，否则膜可能在封接建立前发生破裂。如果封接保持稳定且电阻超过1吉欧姆（

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