脑片中的全细胞膜片钳记录

本实验的主要目标是描述如何在新近分离的脑片中进行全细胞膜片钳记录。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如实验性控制操作如何改变特定脑区内特定神经元的活动。该技术的主要优势在于，它提供了一种手段，可用于鉴定在完整且清醒的动物体内发育形成的神经元功能的离体长期变化。

尽管该方法可用于研究脑片中的神经元功能，但也适用于其他系统，例如培养细胞以及活体内的神经元。本次实验操作将由我实验室的学生 Francisco Garcia-Oscos 进行演示。开始该操作时，使用带有塑料修剪尖端的移液管，从恢复室中轻轻吸取一片脑片。

将移液管放入记录室中，轻轻挤压移液管，使脑片缓慢释放到记录室底部铺好的盖玻片上。接着，使用显微镜的 4 倍物镜，调整脑片位置，使目标区域精确地位于记录室的正中心。当达到理想位置后，使用切片固定装置（也称为“harp”）固定脑片位置。

随后，切换至 40 倍物镜，并轻轻降低镜头，直至其接触记录室中的人工脑脊液（ACSF）。然后使用微调旋钮将组织调至焦点清晰。当焦点位于组织层面时，观察目标区域内的细胞。

现在，寻找一个目标细胞。在计算机屏幕上标记该细胞，以帮助引导记录用微电极。升高物镜，为放置记录用微电极留出足够的空间。

在此步骤中，使用1毫升注射器、非金属微量注射针头和专用滤器，将预先配制的内液充入微电极中。确保微电极内无气泡。然后将微电极放入电极夹持器中，使溶液与涂有氯化银的金属丝电极接触。

拧紧移液管帽，使锥形垫圈在微移液管周围形成密封。接着，在将微移液管浸入ACSF之前，使用连接到移液管 holder 的充满空气的注射器施加正压，以防止碎屑进入移液管。利用显微操作器，将移液管引导至记录室，使其大致位于浸没物镜的中心下方。

使用显微操作器以中高速移动微量移液器时，在计算机屏幕上定位该移液器，并沿XY轴将其引导至细胞所在位置。同时，通过施加电压阶跃测量微量移液器的电阻。施加正压以清除阻塞移液器的任何气泡或其他异物。

清除微移液管后，进行电压调零以将移液管电流降至零。使用显微镜的细调焦旋钮，开始向下调焦的同时逐渐降低微移液管。务必先向下调焦，再将微移液管降至焦平面，以确保微移液管尖端不会突然刺入脑片。

当微量移液器接触到切片表面时，将显微操作仪的速度调至中低档。轻轻施加微弱的正压，以清除路径上的任何碎屑。然后通过交替使用 XYZ 控制旋钮，或通过旋转 Z 轴旋钮同时改变 XZ 轴方向以对角线方式接近细胞。

当微量移液器接近细胞至足够近时，细胞表面会出现一个凹陷。此时通过连接移液器持握装置抽吸管的管道施加短暂而微弱的负压，以形成封接。在吉欧封接（giga-seal）形成过程中，使用计算机控制的放大器指令装置将细胞的钳制电位调节至生理静息电位，以便在细胞膜破裂后避免电位的突然变化。

在吉伽封接形成后，补偿快速或慢速电容。此处非常重要的一点是施加的负压不能过强，否则膜可能在封接建立之前发生破裂。

如果封接保持稳定且电阻高于1 GΩ，则施加短暂而强烈的负压以破裂细胞膜。负压必须短暂，且强于形成封接时所施加的压力，以确保细胞膜充分破裂，并获得稳定的全细胞记录模式。

在膜片钳测试中切换到细胞模式，观察细胞的不同参数，例如输入电阻、串联电阻和膜电容。达到全细胞构型后，在记录过程中持续监测这些参数。此处显示的是单个伏隔核壳部中型棘状神经元（MSN）诱发的兴奋性突触后电流（EPSC）斜率的示例。

将温度从24升高至28，再升高至32摄氏度时，诱发电位兴奋性突触后电流（EPSC）的斜率增加。此处，在电压钳制模式下于负80毫伏条件下测定诱发电位兴奋性突触后电流的幅度。当串联电阻增加时，诱发电位兴奋性突触后电流的幅度减小。

此处展示了两个神经元的记录轨迹示例，说明输入电阻对神经元产生动作电位能力的影响。神经元处于电流钳模式，并维持在 -80 mV。当输入电阻增加时，动作电位的数量也随之增加。

在进行该操作时，需要牢记制备健康的脑片至关重要。同时，应注意监测可能影响电信号波形的参数，例如串联电阻、输入电阻以及温度。观看本视频后，您应对脑片全细胞记录技术的基本原理有清晰的理解。