用于分析学习诱导可塑性的脑片膜片钳技术

大家好，我是 Dai Mitsushima。本实验将通过比较未训练动物的膜片钳数据，向您展示如何在经过训练的动物中制备脑切片，从而分析学习诱导的突触可塑性。

大家好，我叫Hiroyuki Kida。在本实验中，我们通过转棒实验研究了运动奔跑的神经机制。转棒实验被广泛用于评估啮齿类动物的运动认知能力。

该方法的优点在于，我们可以通过提高旋转杆的速度，在测试过程中调节发现水平。旋转杆实验。在进行运动任务之前，应将旋转杆装置设置为加速模式，使其在300秒内从4转/分钟加速至40转/分钟。

每项测试中，大鼠需进行十次尝试，每次尝试之间的间隔时间为30秒。在首次训练过程中，大鼠通常会在转棒上跌落，即使转速较低，有时还会朝错误的方向行走。

然而，在重复训练后，大鼠能够以更高的速度行走。通过测量大鼠在转棒上的停留时间，我们可以评估其对该技能的学习表现。此处展示了转棒实验的结果。

如图所示，两天的训练足以掌握该运动技能。与第一次试验的潜伏期相比，事后分析显示在训练最后一天的试验中潜伏期显著缩短。通过测量大鼠在杆上的潜伏期，我们可以评估其对该技能的学习表现。

接下来，我们将向您展示一种避暗实验。该实验可用于分析情境学习能力。避暗实验装置由被一个活动门隔开的明室和暗室两部分组成。

训练期间，将大鼠放置在明亮区域，给予短暂时间以适应环境。门打开后，大鼠可自由进入黑暗区域。一旦大鼠进入黑暗区域，门即关闭，并给予持续两秒的轻微电击。

试验结束后，将大鼠放回笼中30分钟，随后再次将其置于装置的明亮区域。电击后30分钟，训练过的大鼠在进入黑暗区域前表现出明显更长的潜伏期。此处展示了抑制性回避测试的结果。

电击后，大鼠学会了避免进入黑暗区域而停留在光照侧，尽管它们在正常情况下并不偏好光照侧。这种回避黑暗侧的倾向表明已形成了情境记忆。训练后的脑切片。

在切开之前，我们使用碎冰将所有剪刀、止血钳和烧杯冷却。此处展示了我们的解剖准备工作。脑组织解剖应尽快进行。

在大鼠深度麻醉后，将其置于盛有碎冰的浅盘中，切开腹部以打开腹腔。切开膈肌后，再做一次侧向切口。使用止血钳夹闭肋软骨，以打开胸腔。

暴露心脏后，将一根18号不锈钢针插入左心室的后部。针尖应透过主动脉壁可见。剪开右心耳后，开始灌注。

确保先用充过气的冰冻解剖缓冲液充满针头和注射器。灌注前还应去除所有气泡。首先，在颅骨后部进行剪切。

然后进行侧向切割，再进行中央切割以暴露脑组织。解剖后，应将脑组织置于持续通入冷缓冲液的冰浴中孵育五分钟。在继续解剖前，需用冰冷的缓冲液润湿滤纸。

然后，将脑组织置于冰冷的不锈钢平台上。切片平台的角度对于确保脑切片的正确切割角度至关重要。角度不正确可能会切断目标锥体神经元。

修剪后，应在振动切片机的载物台上滴加一滴超级胶水。为确保牢固粘附，需用滤纸吸除多余的解剖缓冲液。使用振动切片机可在持续通气的冰浴缓冲液中制备薄脑片。

我们的目标区域是初级运动皮层。可使用虹膜剪将目标脑区剪下。接口室可使用塑料食品容器制作。

接口室的盖子对于容纳气体是必需的。使用红外-DIC显微镜观察脑片。在此我们可以看到初级运动皮层第2/3层神经元的一个示例。

膜片钳记录移液管中需填充适当的细胞内溶液。用于电流钳分析的溶液与电压钳分析的溶液不同。代表性结果。

电流钳技术有助于分析细胞的内在特性。在转棒训练后，我们能够从初级运动皮层第2/3层神经元获得电流钳数据。图A显示了由电流注入诱导的典型轨迹。

图B显示了注入电流与放电次数之间的关系。经过一天训练的大鼠引发的放电次数较少，而经过两天训练的大鼠比未训练大鼠引发的放电次数明显更多。如下方图示所示，经过一天训练的大鼠表现出更低的静息电位、更高的放电阈值以及更深的后超极化。

经过两天训练的大鼠表现出更高的静息电位和膜电阻。电压钳技术可用于分析学习诱导的突触可塑性。此处，我们可以看到情境训练后CA1神经元的数据。

我们记录了由单个谷氨酸或GABA囊泡诱导的CA1神经元的微型突触后电流。图A和图B显示了微型突触后电流的代表性轨迹。在河豚毒素存在的情况下，于同一神经元中依次测量了-16 mV下的微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）和0 mV下的微型抑制性突触后电流（mIPSCs）。

图C展示了未经训练、经过训练、未配对以及穿行对照大鼠的微型兴奋性突触后电流（mEPSC）和微型抑制性突触后电流（mIPSC）幅度的二维图。图D展示了微型突触事件频率的对应图。从下方图中可以看出，情境训练显著增强了兴奋性和抑制性突触，从而促进了神经元突触输入的多样性。

总之，电流钳技术可用于分析学习诱导的细胞特性变化。此外，电压钳技术是分析兴奋性和抑制性突触处学习诱导可塑性的有力工具。这些分析的详细结果可参见以下出版物。