使用全细胞膜片钳电生理技术评估突触多重性

在大脑中，一对神经元通常会形成多个突触连接，这被称为突触多重性。然而，对突触多重性的精确研究需要技术上具有挑战性的实验。本方案描述了一种利用全细胞膜片钳电生理技术对突触多重性进行粗略估算的简便方法。

该方法可应用于任何物种和脑区，以研究突触的多重性。该方法需要掌握全细胞膜片钳电生理学的基本技能。获得低且稳定的串联电阻的高质量记录，对于准确解读数据至关重要。

为了获得全细胞记录构型，将记录电极置于脑片上方，并在电压钳模式下调整电极电流。对电极施加轻微的正压，并锁定旋塞阀。接着，选择一个细胞膜完整的健康细胞，用电极接近组织。

正压应在组织上引起轻微扰动。以对角线方向缓慢将移液管靠近细胞，直至细胞表面形成一个小凹陷。随后，释放正压锁定。

细胞将开始形成封接，电阻将上升至一吉欧姆以上。在电压钳模式下，将细胞钳制在负68毫伏。随后，轻微地沿对角方向将移液管从细胞上拉开，以去除多余压力。

补偿快电容和慢电容。通过连接至移液管持握器的管道施加短暂的负压，以击穿细胞膜并获得全细胞记录构型。随后，在电生理数据采集与分析软件的膜片测试窗口中切换至细胞模式。

后续实验中，将记录浴槽的温度维持在 27 至 30 摄氏度，灌流速度维持在每分钟 1.5 至 2 毫升。在多突触连接中，动作电位可同步神经递质的释放，从而产生更大的突触后电流。使用河豚毒素（TTX）和镉阻断动作电位及钙依赖性囊泡释放，可防止突触后电流的叠加，并降低其幅度。

当不存在多重性时，阻断动作电位不会改变其幅度。在实验一中，为评估多重性，将细胞钳制在负68毫伏，同时用低钙人工脑脊液灌流。记录至少五分钟的自发性兴奋性突触电流，以确保获得稳定的基线。

接下来，在 aCSF 中加入 30 µM 的 4-AP，以增加动作电位依赖性事件，并记录至少 10 分钟的自发性兴奋性突触后电流（EPSCs），以获得药物的完全效应。随后，在含有 4-AP 的 aCSF 中加入 0.5 µM TTX 和 10 µM 镉离子，记录至少 10 分钟的微小兴奋性突触后电流（miniature EPSCs）。用于离线分析时，选取施加 4-AP 前即刻的基线最后 1 分钟、施加 4-AP 后第 10 分钟以及施加 TTX 后第 10 分钟的数据进行分析。

本实验中，用锶替代细胞外钙以去同步突触囊泡的释放。因此，如果存在多重释放，则应降低突触后电流的幅度。在实验二中，在用正常含钙人工脑脊液（aCSF）灌流细胞的同时，记录至少五分钟的自发兴奋性突触后电流（EPSCs）。

为了去同步囊泡释放，开始用锶离子aCSF灌注细胞，并记录自发性兴奋性突触后电流（EPSCs）。在离线分析时，为确定大幅值自发性EPSC是否源于囊泡的同步释放，需将基线期最后一分钟的数据与施加锶离子aCSF第10分钟的数据进行比较。多重性释放可能涉及多囊泡释放，这会导致突触间隙中神经递质浓度升高。

加入低亲和力AMPA受体拮抗剂gamma-DGG后，其对较大的多囊泡释放介导的突触后电流的抑制效果弱于对较小的单囊泡释放介导的突触后电流。若不存在多囊泡释放，gamma-DGG对较大和较小的突触后电流的抑制效果应相同。在实验三中，为检测是否存在多囊泡释放，需在低钙人工脑脊液（aCSF）中记录至少五分钟的自发性兴奋性突触电流（EPSCs）。

通过灌流系统向aCSF中加入30 µM 4-AP，记录至少10分钟的自发性兴奋性突触后电流（EPSCs）。随后，在含有4-AP的aCSF中加入200 µM gamma-DGG，继续记录至少10分钟的自发性EPSCs。

作为另一细胞中的对照实验，重复上述操作步骤，但使用低浓度 DNQX 代替 gamma-DGG。对于离线分析，分析每种药物应用的最后 1 分钟。突触活动的簇发可短暂增加自发动作电位的发放以及刺激传入纤维的释放概率。

如果神经元表现出多重性，动作电位的增加应导致突触后电流振幅出现短暂升高。在实验四中，在正常钙离子浓度的aCSF中记录自发性兴奋性突触电流（EPSCs）。为增加动作电位的发放，使用充满aCSF的单极玻璃电极以20赫兹的频率刺激传入纤维持续2秒，并重复10次，各次刺激串之间的间隔为20秒。

分析时，以第一次刺激前的5,000毫秒自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）作为基线，与最后一次刺激后10至300毫秒的自发性兴奋性突触后电流进行比较。然后，计算10次试验中振幅和频率变化的平均值。使用能够检测和分析突触电流的程序来分析自发性兴奋性突触后电流和微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）。

使用推荐的检测参数和连续分析功能来检测AMPA受体介导的兴奋性突触后电流（EPSCs）。手动检查每条记录，以确保程序能够准确识别每个事件。通过将事件数据复制到剪贴板并粘贴至数据管理软件中，完成数据导出。

接下来，计算每种药物处理下的平均频率和幅度，并进行相应的统计分析。在此处展示的一个示例中，4-AP 增加了自发性兴奋性突触后电流（EPSCs）的幅度和频率。随后应用 TTX 和氯化镉则降低了幅度和频率。

以下是记录中自发性兴奋性突触后电流（EPSC）幅度的分布情况。在本研究检测的下丘脑神经元中，基础状态与河豚毒素（TTX）处理条件下的EPSC幅度和频率相同，表明基础状态下的自发性EPSC极少依赖动作电位。因此，后续实验可通过比较基础状态与4-氨基吡啶（4-AP）处理之间的差异来测量突触传递的多重性。

突触传递的强度可由突触活动的短暂爆发而暂时增强。为了在更接近生理条件的情况下研究其多重性，可采用传入刺激来增加动作电位的发放频率和递质释放概率。以下是突触刺激后自发性兴奋性突触电流（EPSC）频率和幅度变化的总结。

稳定的记录对于准确解读数据至关重要。如果在记录过程中接入电阻变化超过20%，应对此数据加以描述，因为这可能影响分析结果。本方案提供了一种简单的方法来估算突触多重性，这是不同生理和病理生理条件下突触效能及其可塑性的关键决定因素。