全细胞膜片电生理方法对突触倍数的评价
April 23rd, 2019
在这里, 我们提出了一个评估功能突触多样性的方案, 使用全细胞膜片夹具电生理学在急性脑片。
在大脑中，一对神经元经常形成多个突触，称为突触多重性。然而，精确检查突触的多重性需要技术上具有挑战性的实验。该协议描述了一种使用全细胞贴片夹电生理学对突触倍数进行总估计的简单方法。
该方法可应用于任何物种和大脑区域，以研究突触的多重性。这种方法需要全细胞贴片夹电生理学的基本技能。获得具有低和稳定访问电阻的高质量录像对于准确解释数据至关重要。
要获得全单元配置，请将记录移液器放在切片的上方，并在电压夹模模式下偏移移液器电流。向移液器施加轻微的正压，然后锁定止损器。接下来，选择一个完整膜的健康细胞，用移液器接近组织。
正压应引起组织轻微干扰。以对角线运动缓慢地使移液器更接近细胞，直到在细胞表面上形成一个小酒窝。然后，松开正压锁。
细胞将开始形成一个密封，电阻将增加超过一个千兆。在电压夹中，将电池保持零下 68 毫伏。随后，稍微将移液器从细胞对角线拉开，以消除多余的压力。
补偿快速和缓慢的移液器电容。通过连接到移液器支架的管进行短暂的吸管，以突破电池并获得全细胞配置。然后，在电生理学数据采集和分析软件中切换到膜测试窗口上的细胞模式。
将记录浴的温度保持 27 至 30 摄氏度，流速为每分钟 1.5 至 2 毫升，以便进行后续实验。在多重突触中，动作电位同步神经递质释放并产生更大的后突触电流。使用 TTX 和镉阻断作用电位和钙依赖性车辆释放可防止后突触电流总和并降低振幅。
当没有多重性时，阻塞作用电位不会改变振幅。在实验一中，为了估计多重性，将细胞保持在负68毫伏，同时用低钙ACSF来吸收它。记录自发的 EPSC 至少五分钟，以确保稳定的基线。
接下来，向 aCSF 添加 30 微摩尔 4-AP 以增加作用潜在相关事件，并记录自发的 EPSC 至少 10 分钟，以获得完整的药物效果。然后，使用 4-AP 向 aCSF 中加入 0.5 微摩尔 TTX 和 10 微摩尔镉，并将微型 EPSC 记录至少 10 分钟。对于脱机分析，请使用 4-AP 应用之前的最后一分钟基线、4-AP 应用程序的第 10 分钟和 TTX 应用程序的第 10 分钟。
在这个实验中，细胞外钙被替换为钛，以去同化突触囊泡的释放。因此，如果存在多重性，这应会降低柱突触电流的振幅。在实验二中，记录自发的EPCS至少5分钟，同时用正常的钙ACSF使细胞吸收。
要去同化囊泡释放，请开始使用具有 aCSF 的钚来使细胞中注入，并记录自发的 EPSC。对于离线分析，要确定大振幅自发 EPSC 是否由于囊泡的同步释放，请将基线的最后一分钟与 aCSF 应用的第 10 分钟进行比较。多重性可能涉及多垂直释放，这会导致突触裂口中神经递质浓度较高。
添加Gama-DGG，一种低亲和力的AMPA受体拮抗剂，导致与较小的单量后突触电流相比，对较大多量的抑制效果较低。如果没有多垂直释放，伽玛-DGG在更大和更小的柱突触电流上同样有效。在实验三中，为了测试多维释放，在低钙ACSF中记录自发的EPSC至少5分钟。
通过灌注系统向 ACSF 添加 30 微摩尔 4-AP。记录自发的 EPSC 至少 10 分钟。然后，使用 4-AP 将 200 微摩尔伽马-DGG 添加到 aCSF 中，并记录自发的 EPSC 至少 10 分钟。
作为单独单元中的控制实验，重复这些过程，但应用低浓度的 DNQX 而不是伽玛-DGG。对于离线分析，分析每个药物应用的最后一分钟。突触活动的突发可以瞬时增加自发动作电位发射和释放概率的刺激的 afferents。
如果神经元表现出多重性，则作用电位的增加应导致后突触电流的振幅短暂增加。在实验四中，记录普通钙ACF中的自发EPSC。为了增加作用潜力的发射，使用充满 aCSF 的单极玻璃电极刺激 affers，速度为 20 赫兹两秒，以 20 秒的间爆发间隔重复 10 次。
为了进行分析，在第一个刺激之前使用 5，000 毫秒的自发 EPSC 作为基线，并与最终刺激后的 10 到 300 毫秒自发 EPSC 进行比较。然后，采取平均振幅和频率变化超过10个试验。使用检测和分析突触电流的程序分析自发的 EPSC 和微型 EPSC。
使用建议的检测参数和不停分析功能检测AMPA受体中位EPPC。手动扫描每个记录，以确保程序准确检测每个事件。通过将事件数据复制到剪贴板来导出事件数据，并将其粘贴到数据管理软件中。
接下来，计算每次药物治疗的平均频率和振幅，并进行相关的统计分析。在此处所示的示例中，4-AP 增加了自发 EPSC 的振幅和频率。TTX 和镉的后续应用降低了振幅和频率。
以下是记录中自发 EPSC 振幅的分布。在此检查的下丘脑神经元中，基线和 TTX 条件的振幅和频率是相同的，这表明基线自发 EPSC 包含很少的操作电位依赖 EPSC。因此，后续实验可以比较基线和4-AP之间的差值，以测量多重性。
突触传输的强度可以通过突触活动的突发来暂时增加。为了研究在更多的生理条件下的多样性，可以使用一种刺激来增加动作潜在的射击和释放概率。以下是突触刺激后自发 EPSC 频率和振幅变化的摘要。
稳定的记录对于准确解释数据至关重要。如果访问电阻在录制过程中变化超过 20%，则描述数据，因为这可能会混淆分析。该协议提供了一个简单的方法来估计突触多样性，这是一个关键的决定因素突触功效及其可塑性在不同的生理和病理生理条件。
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概述
本研究提出了一种使用全细胞膜缀片电生理学在急性脑片上评估神经元功能性突触多重性的协议。该方法使研究人员能够估计不同物种和脑区的突触多重性，强调获得高质量记录的重要性。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 突触机制
背景
- 理解突触多重性对于破译神经元通讯至关重要。
- 之前的实验突出了研究突触接触的复杂性。
- 需要一种可靠的方法来对各种模型中的突触多重性进行大致估计。
- 该协议利用全细胞膜缀片技术来提供对突触动力学的洞察。
研究目的
- 开发一种简单的协议来估计突触多重性。
- 促进对神经递质释放机制的理解。
- 提供一种可适应不同脑区和物种的方法。
所用方法
- 在急性脑片上使用全细胞膜缀片电生理学。
- 该模型包括来自各个脑区的神经元对。
- 实验包括阻断动作电位和钙依赖的小泡释放以评估多重性。
- 关键程序包括在记录过程中维持稳定的进入电阻和温度控制。
- 数据分析涉及在不同条件下兴奋性突触后电流（EPSC）的统计比较。
主要结果
- 通过EPSC幅度的变化识别了估计突触多重性的方法。
- 证明了小泡释放的干扰会改变突触后电流响应，确认了突触多重性。
- 解决了多小泡释放对突触有效性和神经递质浓度的影响。
- 在不同的实验条件下验证了该协议，提供了关于突触动力学的可靠数据。
结论
- 该研究建立了一种评估神经元对中突触多重性的可靠协议。
- 研究结果增进了对突触传递及其潜在机制的理解。
- 该方法可以在各种神经生物学背景下用于研究突触行为和可塑性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding synaptic multiplicity provides critical insight into the functional organization of neuronal circuits, which is essential for target validation in neuropsychiatric drug discovery. This electrophysiology-based method enables mechanistic de-risking by quantifying synaptic efficacy and plasticity under physiological conditions, supporting predictive confidence in early-stage target engagement. The approach aids in evaluating how pharmacological or environmental interventions alter synaptic connectivity, informing portfolio decisions in CNS therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic transmission mechanisms by estimating functional multiplicity of excitatory inputs onto postsynaptic neurons.
- Operational Value: Provides a quantitative electrophysiological readout to assess target-mediated changes in synaptic efficacy.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular targets to measurable changes in synaptic strength and release probability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized whole-cell patch-clamp protocol for measuring spontaneous and miniature EPSCs as functional synaptic outputs.
- Reproducibility: Requires stable access resistance and controlled perfusion conditions to ensure reliable amplitude and frequency comparisons across drug treatments.
- Scalability: Adaptable to various brain regions and species, enabling cross-model validation of synaptic phenotypes in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro synaptic measurements to in vivo behavioral or pharmacological interventions affecting synaptic organization.
- Mechanistic De-risking: Differentiates action potential-dependent from independent release, clarifying presynaptic mechanisms of drug action.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how targets influence synaptic multiplicity and neurotransmitter release dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay development for screening synaptic modulators prior to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by measuring changes in EPSC amplitude and frequency in response to pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible electrophysiological outputs suitable for assessing compound effects on synaptic transmission.
- Analytics: Generates amplitude and frequency distributions of sEPSCs and mEPSCs, enabling statistical comparison of synaptic activity under baseline and drug conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by linking synaptic multiplicity changes to behavioral or environmental manipulations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological capability for evaluating synaptic function across multiple CNS targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into synaptic efficacy, reducing ambiguity in target-mediated effects on neuronal communication.
- Operational Value: Delivers standardized, quantifiable electrophysiological measurements that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by linking molecular interventions to functional synaptic outputs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on synaptic multiplicity and release probability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-cell patch-clamp electrophysiology and acute brain slice preparation.
- Dependent on stable access resistance (<20% change) and precise temperature control (27–30°C) for valid data interpretation.
- Necessitates perfusion systems for sequential drug application (e.g., 4-AP, TTX, cadmium, gamma-DGG) and electrophysiology software for event detection.
- Must account for variability in synaptic activity due to burst firing or changes in release probability during afferent stimulation.
- Limited to relative estimates of multiplicity; absolute quantification requires complementary anatomical or imaging approaches.
