相关光学和电子显微镜，研究与β淀粉样蛋白斑块的小神经胶质互动
June 1st, 2016
本文介绍了使用甲氧基X04，它穿过血 - 脑屏障，并选择性地结合β褶的致密核心斑块Aβ发现张在阿尔茨海默氏症小鼠模型可视化淀粉样蛋白斑块Aβ的协议。它允许的前免疫染色和处理电子显微镜含斑块组织切片预检。
该程序的总体目标是在用于电子显微镜的预包埋免疫染色和组织处理之前，从阿尔茨海默病小鼠模型中识别脑切片中的 β-淀粉样蛋白斑块。这种方法可以帮助回答神经免疫学领域的关键问题，例如小胶质细胞与 β 淀粉样蛋白图附近突触的相互作用。该技术的主要优点是它允许在感兴趣的区域和层中预筛选包含淀粉样蛋白 β 图的脑组织切片。
虽然这种方法可以应用于阿尔茨海默病，但它也可以应用于存在淀粉样变性的任何其他疾病或组织。首先，制备每毫升 5 毫克的甲氧基 X04 化合物溶液。使用 mirco 天平称量 5 毫克甲氧基 X04。
在通风橱下，将甲氧基 X04 溶解在 100 微升 DMSO 中并搅拌，直到获得透明的绿色溶液。在搅拌的同时，连续加入 450 μL 丙二醇和 450 μL 磷酸盐缓冲盐水。将溶液在 4 摄氏度下混合过夜。
第二天，应该可以看到黄绿色的乳剂。注射甲氧基 X04 后，加入每公斤体重 10 毫克的剂量，并根据批准的方法在所需时间点处死动物，用冷冻 PBS 洗涤对羟醛固定脑 3 次。然后，使用锋利的剃须刀片，去除嗅球，将大脑冠状切成两到三块高度大致相等的碎片，所有这些碎片都可以同时切片，以加快手术速度。
将脑组织块粘在固定在托盘中的标本板上。确保光滑的切割表面牢固地粘在标本板上。将 PBS 溶液添加到托盘中，直到整个大脑表面完全浸没。
将托盘放入振动切片机中，并调整振动切片机的设置，以产生 50 微米厚的切片。开始切割，如果筛选，请立即使用细画笔将切片转移到 PBS 中。或者，可以将切片放置在装有冷冻保护溶液的玻璃瓶中，以便在 20 摄氏度下储存。
在立体定位小鼠脑图谱的帮助下，选择包含感兴趣区域的脑切片，并将每个切片放入 24 孔培养板孔中的冷冻保护剂中。接下来，使用一次性移液器将 PBS 液滴添加到显微镜载玻片上，然后将切片放在液滴上。在荧光显微镜下检查切片，以识别含有甲氧基 X04 标记的 a-β 斑块的区域。
无需移动显微镜载物台，即可在明场和荧光模式下捕获感兴趣区域的图像。每张图像必须在两个字段中显示相同的区域，以将斑块与组织切片的结构区域相关联。根据动物编号保存并命名拍摄的图像。
还要记录板中的孔号和拍摄照片的字段。成像完成后，将切片放回指定的孔中。使用相同的程序检查序列中的下一个部分，以避免干燥部分。
要对齐图像，请在 ImageJ 中打开相同 ROI 的明场和 UV 场图像。然后，使用 MosaicJ 插件对齐两个图像的边缘。根据井号将对齐和组合的图像保存在具有特定动物编号的文件夹中。
结合来自同一动物不同部分的图像，以识别和定位感兴趣区域中的斑块。筛选过程完成后，将检查的切片储存在 20 摄氏度下，是含有冷冻保护剂的 24 孔培养板，直到进行免疫染色或进一步处理。首先，在玻璃瓶中的磷酸盐缓冲液中制备 1% 四氧化锇溶液。
由于四氧化锇具有光敏性，因此请用铝箔盖住玻璃瓶以保护溶液避光。在磷酸盐缓冲液中洗涤后，从切片中取出缓冲液，并使用细画笔将它们平铺。确保在添加四氧化锇之前立即将切片压平，因为切片中的任何褶皱都会变成永久性的，并且在锇固定后尝试压平组织只会破坏切片。
使用移液管将四氧化锇一次一滴添加到切片中，直到切片浸入。用铝箔盖住孔，以保护切片避光，并在室温下孵育 30 分钟。在此孵育过程中，在一次性烧杯中准备塑料树脂。
按顺序将组分混合在一起，并使用 10 毫升血清移液管充分混合，直到获得均匀的颜色。将准备好的混合物转移到铝制称重盘中。一旦组织切片脱水，这些组织将接受组织切片。
孵育时间过后，用浓度递增的乙醇将切片脱水，每个切片 2 分钟。将脱水切片从 24 孔培养板转移到 20 mL 玻璃瓶中。然后将切片浸入环氧丙烷中 3 次，每次 2 分钟，以去除残留的乙醇。
接下来，使用弯曲的玻璃移液器吸头或细画笔将切片从环氧丙烷溶液转移到塑料树脂中，并在室温下放置过夜以浸润。浸润后，将装有标本的铝制称量皿放入 50 至 60 摄氏度的烤箱中 10 至 15 分钟。要在聚三氟氯乙烯薄膜片材上嵌入切片，首先使用细画笔在切片上涂上一层薄薄的树脂。
然后，一次将一段组织从铝制称重皿移动到 PCTFE 薄膜片材上。清除组织周围多余的树脂，注意不要打扰它。将所有切片从一个称重盘移动到 PCTFE 薄膜片材后，将第二张 PCTFE 片材放在第一片上，在两张片材之间形成纸巾和树脂的夹层。
将树脂在 55 至 60 摄氏度的培养箱中聚合 3 天。然后，组织准备好进行超薄切片和超微结构检查。下图显示了使用明场和荧光模式对一个海马切片进行双重成像。
感兴趣的区域和图层在明场下可视化。而 a-β 斑块则使用 340 至 380 纳米范围内的紫外线滤光片成功定位。该图显示了 IBA1 预包埋免疫染色之前的海马切片。
虚线勾勒出可见的斑块。该图像显示了 IBA1 预包埋免疫染色和透射电子显微镜处理后的相同切片。请注意，在用于电子显微镜的组织处理时，由虚线包围的斑块仍然可见。
一旦掌握，如果执行得当，该协议可以在一周内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住，每个步骤都必须严格执行，以减少污染和其他结构性恶化的可能性，这些因素会影响样品的质量。不要忘记，使用锇可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着实验服和手套。
请务必在实验结束时按照您设施的指南丢弃。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文描述了一种使用甲氧基-X04在阿尔茨海默症小鼠模型中可视化淀粉样蛋白Aβ斑块的协议。该方法允许在进行免疫染色和电子显微镜处理之前对含斑块的组织切片进行预筛选。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经免疫学
- 阿尔茨海默症研究
背景
- Aβ斑块与阿尔茨海默症相关。
- 了解小胶质细胞与突触的相互作用至关重要。
- 甲氧基-X04选择性地与Aβ斑块中的β-折叠结构结合。
- 这种技术可应用于其他淀粉样变相关疾病。
研究目的
- 识别脑切片中的β-淀粉样蛋白斑块。
- 促进嵌入前免疫染色。
- 增强电子显微镜处理的组织。
使用的方法
- 制备甲氧基-X04溶液（5 mg/mL）。
- 使用微型天平称量甲氧基-X04。
- 将溶液应用于脑组织切片。
- 在进一步处理之前可视化淀粉样斑块。
主要结果
- 成功可视化了小鼠模型中的Aβ斑块。
- 识别出供进一步研究的感兴趣区域。
- 促进了免疫染色和电子显微镜处理。
- 可能应用于其他淀粉样变相关疾病。
结论
- 甲氧基-X04方法对于斑块预筛选是有效的。
- 这种技术有助于理解神经免疫学相互作用。
- 它在阿尔茨海默症之外具有更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables early identification of amyloid plaques in brain tissue, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By pre-screening for plaque-containing sections, it reduces wasted effort in downstream immunostaining and ultrastructural analysis. The method enhances predictive confidence in microglial–plaque interaction studies, informing go/no-go decisions in Alzheimer’s disease target de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial localization relative to amyloid plaques to test neuroinflammatory hypotheses.
- Operational Value: Prescreens tissue sections to focus resources on regions with detectable plaques, improving efficiency in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming plaque presence before investing in time-intensive EM and immunostaining procedures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses methoxy-X04 fluorescence to generate quantitative plaque localization data compatible with correlative imaging.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible section selection criteria for downstream EM preparation.
- Assay Readiness: Generates archived, cryoprotected sections suitable for batch processing in immunostaining and resin embedding pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains plaque visibility through EM processing, enabling ultrastructural correlation with fluorescently labeled microglia.
- Disease Model Fidelity: Applicable to amyloidopathy models beyond Alzheimer’s, supporting broad target validation in protein misfolding diseases.
- <Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions based on plaque burden and regional distribution before committing to therapeutic intervention studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, specifically enabling efficient progression from plaque detection to microglial interaction analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial–amyloid plaque spatial relationships in defined brain regions.
- Screening: Enables reproducible selection of plaque-positive sections, reducing variability in immunostaining and EM sample preparation.
- Analytics: Generates correlated brightfield and fluorescence image datasets for quantitative plaque burden and co-localization analysis.
- Translational Research: Preserves plaque integrity through EM processing, allowing structural validation of fluorescently identified targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable pre-screening platform for amyloid detection across multiple disease models and target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by confirming amyloid presence prior to mechanistic studies.
- Operational Value: Reduces reagent and instrument workload by excluding plaque-negative sections from downstream processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency in neurodegenerative target programs by minimizing failed experiments due to low plaque yield.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified target prioritization based on plaque burden and regional specificity in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent microscopy, vibratome sectioning, and EM sample preparation.
- Dependent on access to methoxy-X04, DMSO, propylene glycol, and osmium tetroxide with appropriate safety controls.
- Necessitates standardized sectioning and staining protocols to ensure plaque detection consistency across operators and sites.
- Adaptation to non-murine models may require optimization of dosing, perfusion, and section thickness.
- Plaque detection sensitivity is limited by methoxy-X04 binding affinity and tissue autofluorescence in certain brain regions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Methoxy-X04 Solution Preparation and Injection
1:52
Brain Sectioning Using a Vibratome
3:21
Screening for the Presence of Methoxy-X04-stained Plaques
5:40
Tissue Processing for Electron Microscopy
9:01
Results: Visualization of Aβ Plaques in 21-month-old APP-PS1 Mice Using Light Microscopy Following Systemic Injection of the Fluorescent Dye Methoxy-X04
10:01
Conclusion
