相关光学显微镜与电子显微镜技术研究小胶质细胞与β-淀粉样蛋白斑块的相互作用

本实验的总体目标是在进行包埋前免疫染色及透射电镜样品处理之前，鉴定阿尔茨海默病小鼠模型脑切片中的β-淀粉样蛋白斑块。该方法有助于回答神经免疫学领域中的关键科学问题，例如小胶质细胞与靠近β-淀粉样蛋白斑块的突触之间的相互作用。该技术的主要优势在于，能够对特定脑区和脑层中包含β-淀粉样蛋白斑块的脑组织切片进行预先筛选。

尽管该方法可用于阿尔茨海默病，但也适用于任何存在淀粉样变性的其他疾病或组织。首先，配制浓度为 5 毫克/毫升的甲氧基-X04 化合物溶液。使用微量天平称取 5 毫克甲氧基-X04。

在通风橱中，将甲氧基 X04 溶解于 100 微升 DMSO 中，搅拌至形成澄清的绿色溶液。在搅拌过程中，依次加入 450 微升丙二醇和 450 微升磷酸盐缓冲液。将溶液在 4°C 下持续搅拌过夜。

第二天应可见黄绿色乳状物。注射甲氧基-X04后，按批准的方法给予每公斤体重10毫克的剂量，并在预定时间点处死动物，用预冷的PBS缓冲液将经多聚甲醛固定的脑组织清洗三次。然后，使用锋利的剃刀刀片切除嗅球，并将脑组织沿冠状面切成两到三块高度大致相等的组织块，所有组织块可同时进行切片，以加快实验进程。

将脑组织块粘附到固定于托盘中的标本板上。确保光滑的切面牢固地贴附在标本板上。向托盘中加入 PBS 溶液，直至整个脑表面完全浸没。

将托盘放入振动切片机中，并调整振动切片机的设置以获得50微米厚的切片。开始切片，若需立即进行筛选，使用细画笔将切片转移至磷酸盐缓冲液（PBS）中。或者，可将切片置于含有冷冻保护液的玻璃小瓶中，于20摄氏度保存。

借助立体定位小鼠脑图谱，选取包含目标区域的脑切片，并将每张切片放入24孔细胞培养板的孔中，置于冷冻保护液内。接着，使用一次性移液管在显微镜载玻片上滴加一滴PBS，然后将脑切片置于液滴上。在荧光显微镜下观察切片，识别含有甲氧基-X04标记的Aβ斑块的区域。

在不移动显微镜载物台的情况下，采集目标区域的明场和荧光模式图像。每张图像必须在两种模式下显示相同的区域，以便将斑块与组织切片的结构区域相对应。根据动物编号保存并命名所采集的图像。

同时记录培养板中的孔位编号以及所拍摄图像的视野位置。成像完成后，立即将切片放回指定的孔中。按照相同的操作流程依次检查下一个切片，以避免切片干燥。

为对齐图像，请在 ImageJ 中打开同一 ROI 的明场和紫外场图像。然后使用 MosaicJ 插件对齐两张图像的边缘。将对齐并合并后的图像按照孔号保存在对应动物编号的文件夹中。

将同一动物不同切片的图像进行合并，以识别并定位目标区域中的斑块。筛选过程完成后，将已检测的切片置于含有冷冻保护剂的24孔细胞培养板中，于20摄氏度保存，直至进行免疫染色或进一步处理。首先，在玻璃小瓶中用磷酸盐缓冲液配制1%四氧化锇溶液。

由于四氧化锇具有光敏感性，需用铝箔包裹玻璃小瓶，以保护溶液免受光照。在磷酸盐缓冲液洗涤后，移除切片上的缓冲液，并使用细画笔将切片展平。在添加四氧化锇之前，务必立即展平切片，因为切片中的任何褶皱都会变得永久，而在四氧化锇固定后尝试展平组织只会导致切片破裂。

使用移液管将四氧化锇逐滴加入切片中，直至浸没切片。用铝箔覆盖孔板，避免切片暴露于光线下，并在室温下孵育30分钟。孵育期间，在一次性烧杯中准备塑料树脂。

按顺序将各组分混合，使用 10 毫升血清学移液管充分混匀，直至获得均匀的颜色。将配制好的混合物转移至铝制称量皿中。这些称量皿将在组织切片脱水后用于承载切片。

孵育时间结束后，将切片依次浸入浓度递增的乙醇中脱水，每次两分钟。将脱水后的切片从24孔培养板转移至20毫升玻璃小瓶中。然后将切片浸入丙烯氧化物中三次，每次两分钟，以去除残留的乙醇。

接下来，使用弯曲的玻璃移液管尖端或细小的画笔将切片从丙烯酸氧化物溶液中转移至塑料树脂中，并在室温下静置过夜以完成浸透。浸透完成后，将装有样品的铝制称量皿放入50至60摄氏度的烘箱中加热10至15分钟。若要将切片包埋在三氟氯乙烯共聚物薄膜上，需先用细小画笔在切片上涂布一层薄薄的树脂。

然后，将铝制称量皿中的组织切片一次移动一片至PCTFE薄膜片上。去除组织周围的多余树脂，注意不要扰动组织。将一个称量皿中的所有切片转移至PCTFE薄膜片上后，将第二张PCTFE薄膜片覆盖在第一张之上，使组织和树脂夹在两张薄膜片之间，形成夹心结构。

将树脂在55至60摄氏度的培养箱中聚合三天。组织即可用于超薄切片及超微结构观察。以下图像显示了同一海马区切片通过明场和荧光模式进行的双重成像。

在明场下观察目标区域和层次。使用波长范围为 340 至 380 纳米的紫外滤光片可成功定位 A-β 斑块。此图像显示的是进行 IBA1 预包埋免疫染色前的海马组织切片。

虚线标出了一个可见的斑块。该图像显示了同一组织切片经IBA1预包埋免疫染色并进行透射电子显微镜处理后的结果。请注意，经电子显微镜组织处理后，虚线圈出的斑块仍然可见。

一旦掌握，若操作得当，该实验方案可在一周内完成。在进行此操作时，重要的是要牢记每一步都必须严格进行，以降低污染及其他结构降解的风险，这些因素均会影响样品的质量。切勿忘记，使用锇时可能具有极高危险性，因此在执行该操作时，应始终采取预防措施，例如穿戴实验服和手套。

请务必根据您所在机构的指南，在实验结束使用后将其丢弃。