Name: 相关光学和电子显微镜，研究与β淀粉样蛋白斑块的小神经胶质互动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学习使用methoxy-X04染色法在阿尔茨海默病小鼠模型中识别β淀粉样蛋白斑块，并结合免疫染色与电子显微镜技术进行神经免疫学研究。该方法有助于预筛选含斑块的脑组织切片。

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我们感谢魁北克大学医院研究中心生物成像平台的Sachiko Sato博士和Julie-Christine Lévesque提供的技术协助。本研究工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）RGPIN-2014-05308项目、班廷研究基金会以及加拿大苏格兰礼慈善基金会向M.E.T.提供的资助支持。
H.E.H. 获得黎巴嫩高等教育与教育部的奖学金资助，K.B. 获得拉瓦尔大学医学院的资助。

注意：所有实验均经机构动物伦理委员会批准，并按照拉瓦尔大学动物护理委员会管理的加拿大动物护理委员会指南进行。实验使用了4至21月龄的APP-PS1雄性小鼠。这些动物饲养在12&#160;小时光照-黑暗循环、22 - 25 °C的环境中，可自由获取食物和水。
1. 甲氧基-X04 溶液的配制
<ol>
	<li>配制 5 mg/ml 的 methoxy-X04 溶液9 通过将甲氧基-X04溶解于含有10%二甲基亚砜（DMSO）、45%丙二醇和45%磷酸盐缓冲盐水（含0.9% NaCl的100 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4）的溶液中制备。
	<ol>
		<li>使用微量天平称取5 mg甲氧基-X04化合物。在通风橱内，将甲氧基-X04溶于DMSO中，并搅拌至形成澄清的淡绿色溶液。随后在持续搅拌下依次加入丙二醇和磷酸盐缓冲液。</li>
		<li>在4 °C下于旋转仪上搅拌溶液过夜，得到黄绿色乳状液。该溶液可在4 °C保存长达两个月，不会发生降解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 甲氧基-X04 溶液注射
<ol>
	<li>24 小时&#160;灌注前，称量小鼠体重，并使用27½ G针头按每公斤体重10 mg的剂量向每只小鼠腹腔注射methoxy-X04&#160;针</li>
</ol>
3. 注射小鼠的经心灌注
<ol>
	<li>灌注前一天，配制适量体积的磷酸盐缓冲液（PBS）、3.5%丙烯醛和4%多聚甲醛（PFA）溶液13 并在 4 °C 下过夜保存。 
	注意：这些溶液将用于灌注和预包埋免疫组织化学。处理丙烯醛时需格外小心，因为&#160;它对研究人员和环境均有腐蚀性和毒性。此外，由于丙烯醛对塑料具有腐蚀性，配制丙烯醛溶液时务必使用适当的玻璃器皿。</li>
	<li>灌注当天，使用可截留25 µm颗粒的粗滤纸过滤PFA和丙烯醛。</li>
	<li>灌注过程中，使用蠕动泵以25 ml/min的流速依次向小鼠循环系统注入15 ml PBS、75 ml 丙烯醛和150 ml 多聚甲醛。 
	谨慎操作。&#160;在通风橱内严格进行灌注，以避免接触PFA和丙烯醛的有害气体。
	<ol>
		<li>设置&#160;启动泵，将一端插入 PBS 溶液中，用 PBS 填充管路（容量约为 15 ml），并固定一个 25 G 针头&#160;将带翼采血针连接到另一端。操作过程中，务必确保管路中无任何滞留的气泡。</li>
		<li>将灌注泵设置好并将管路中充满PBS后，立即将管子直接放入丙烯醛瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次麻醉一只小鼠，使用27½ G针头经腹腔注射戊巴比妥钠，剂量为90 mg/kg体重。通过尾部或足趾夹捏测试其反应，只有当小鼠对这些有害性疼痛刺激无反应时，方可继续操作。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定（面朝上，背部向下），用胶带将其前肢和后肢固定于操作台面，小心暴露心脏，避免损伤其他器官。膈肌穿刺后应迅速操作。
	<ol>
		<li>使用手术剪沿胸部正中线从肋骨后方开始向前至锁骨处切开皮肤。</li>
		<li>沿胸腔腹侧肋骨基部再做两个侧向切口。轻轻移动并固定两片皮瓣，确保完全暴露整个胸腔。</li>
		<li>用钝头镊子夹住剑突以暴露胸腔并固定尖头剪刀。剪开膈肌和肋骨，注意避免刺破肺部，并继续向前剪至锁骨上方。刺破膈肌后务必迅速操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用钝头镊子轻轻撕开心包膜。用钝头镊子固定心脏，剪开右心房，并开始灌注PBS。立即将采血针插入左心室。</li>
	<li>用PBS（在管路中）灌注小鼠，随后用丙烯醛灌注3分钟&#160;（对应75 ml）后，换用PFA固定6分钟&#160;（对应150 ml）。更换溶液前务必暂停泵流，以防止气泡进入管路。</li>
	<li>处死小鼠，取出固定后的脑组织，直接放入含有4% PFA的玻璃小瓶中，固定至少2小时&#160;在 4 °C 下。
	<ol>
		<li>使用剪刀和镊子剪开皮肤以暴露颅骨，以提取脑组织。在两眼之间小心地敲开颅骨，并逐块去除颅骨碎片，以暴露其下方的脑组织。</li>
		<li>小心取出暴露的大脑并进行后续处理&#160;用4% PFA再固定2小时&#160;在进行振动切片前。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用振动切片机进行脑组织切片
<ol>
	<li>用预冷的 PBS 缓冲液清洗固定好的脑组织 3 次。使用锋利的剃刀刀片切除嗅球（除非该区域是研究对象），并将脑组织沿横断面切成 2 至 3 个高度大致相等的脑块，以便同时进行切片，从而加快实验进程。</li>
	<li>将脑组织块垂直粘附于固定在切片槽中的样品板上。确保切面平整且牢固地贴附在样品板上，避免在切片过程中脱落。向切片槽中加入足量 PBS 溶液，直至整个脑组织表面完全浸没。此步骤中必须始终保持脑组织块及其后续切片完全浸没在 PBS 中。</li>
	<li>将切片槽放入振动切片机中，调节切片速度为 0.5 mm/sec，振动频率为 90 Hz，进刀厚度为 50 µm，以获得厚度为 50 µm 的切片。然后用细毛笔将切片转移至含有冷冻保护液（40% PBS、30% 乙二醇和 30% 甘油）的 20 ml 玻璃瓶中。将玻璃瓶储存于 -20 °C，待后续使用。或者，也可将切片保留在 PBS 中，以便按后续步骤立即进行筛选。</li>
</ol>
5. 筛选甲氧基-X04染色斑块的存在
<ol>
	<li>借助立体定位小鼠脑图谱14，选择包含目标区域的脑切片，例如本示例中使用的海马CA1区。将每张切片放入含有足够抗冻保护液的24孔培养板的孔中，以防止切片干燥。</li>
	<li>依次检查每张切片，避免切片干燥，操作步骤如下：
	<ol>
		<li>使用一次性移液器在显微镜载玻片上滴加一滴PBS，将切片置于液滴中。</li>
		<li>在荧光显微镜下观察切片，识别含有甲氧基-X04标记的Aβ斑块的区域。 
		注意：使用荧光紫外（UV）滤光片（激发波长340–380 nm）可轻松观察甲氧基-X04。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在不移动显微镜载物台的情况下，分别以明场和荧光模式采集目标区域（ROI）的图像，因为每张图像必须在两种模式下显示同一区域，以便将斑块的存在直接与组织切片的结构区域相关联。</li>
	<li>根据动物编号保存并命名所采集的图像。&#160;同时记录板中的孔号以及所拍摄图像的视野。例如：9978A1B；动物编号：9978；孔号：A1；视野：明场。成像完成后，将切片放回&#160;其指定的孔中。 
	注意：最终，对每张检测的切片可获得两张图像，一张为明场，另一张为紫外场。</li>
	<li>在Image J中打开同一目标区域的两张图像（一张明场，一张紫外场），使用MosaicJ插件对齐两张图像的边缘，并根据其来源孔号保存对齐合并后的图像。</li>
	<li>将图像保存至以特定动物编号命名的独立文件夹中。合并图像以识别和定位组织切片中的斑块，并在两种不同模式（明场和紫外场）下全面观察整个切片。</li>
	<li>完成筛选后，将已检测的切片保存在含抗冻保护液的24孔培养板中，置于-20 °C冰箱，直至进行免疫染色或其他后续处理。</li>
</ol>
6. IBA1 的预先包埋免疫染色
注意：将培养板置于室温下缓慢移动的摇床中，对选定的自由漂浮切片进行IBA1免疫染色。
<ol>
	<li>用约 1 ml PBS 彻底清洗切片 3 次，每次持续 10 分钟。</li>
	<li>用含 0.3% 过氧化氢的 PBS 溶液淬灭内源性过氧化物酶，孵育 10 分钟。此步骤可防止非特异性过氧化物酶活性，避免背景染色。</li>
	<li>用 PBS 清洗组织 3 次，每次 10 分钟&#160;。</li>
	<li>将切片在含 0.1% 硼氢化钠的 PBS 溶液中孵育 30 分钟。此步骤对于还原固定步骤中残留的醛类物质至关重要，若组织固定时使用了丙烯醛，则此步骤尤为重要。</li>
	<li>用 PBS 清洗组织 3 次，每次 10 分钟&#160;，并确保去除所有气泡。</li>
	<li>封闭切片 1 小时。不同抗体可能需要不同的封闭时间和封闭液。对于 IBA1，配制含 10% 胎牛血清、3% 牛血清白蛋白和 0.01% Triton X-100 的 50 mM Tris 缓冲盐水（TBS；pH 7.4）作为封闭缓冲液。 
	注意：封闭步骤旨在防止一抗的非特异性结合。低浓度的 Triton X-100 可实现膜的轻微通透化，以获得更好的染色效果，同时浓度足够低，可在电镜下保留组织的大部分超微结构特征。</li>
	<li>移除组织上的封闭液，加入一抗溶液（兔抗 IBA1，用封闭液稀释至 [1:1,000]），在 4 °C 下过夜孵育。</li>
	<li>用 TBS 清洗 3 次，每次 10 分钟&#160;。</li>
	<li>在 0.05 M TBS 中加入二抗（生物素标记的山羊抗兔 IgG）[1:200]，孵育 90 分钟。</li>
	<li>用 TBS 清洗 5 次，每次 5 分钟&#160;。</li>
	<li>在 TBS 溶液中加入亲和素-生物素复合物溶液（亲和素 [1:100]，生物素 [1:100]），孵育 1 小时。</li>
	<li>用 TBS 清洗 5 次，每次 5 分钟&#160;。</li>
	<li>用含 0.05% 二氨基联苯胺（DAB）和 0.015% 过氧化氢的 TBS 溶液显色 8 分钟。 
	注意：DAB 显色时间可能因实验方案而异，应通过在光学显微镜下快速观察染色切片来确定最佳时间。 
	注意：对于 IBA1 染色，应在 20X 放大倍数下清晰可见小胶质细胞的胞体和突起（代表性示例见 图 2）。使用 DAB 时需谨慎，因其为已知致癌物。</li>
	<li>在此步骤中需密切监控切片（如上所述），避免过度显色。通过将切片在冰冷的 PB 中清洗 5 次，每次 5 分钟&#160;，以终止反应。</li>
</ol>
7. 透射电子显微镜样品制备
<ol>
	<li>在玻璃小瓶中用 PBS 配制 1% 四氧化锇溶液。四氧化锇具有光敏感性；&#160;用铝箔包裹玻璃小瓶，以保护溶液免受光照。 
	使用四氧化锇时需谨慎，因其为高度危险化学品。此步骤及后续操作均应在通风橱内进行。</li>
	<li>移除切片中的PBS，并使用细画笔将其展平。每次只对一个孔进行此操作，以保持&#160;防止切片干燥。在加入四氧化锇之前务必立即展平切片，因为切片中的任何褶皱都会变得永久，而在四氧化锇固定后尝试展平组织只会导致切片破裂。</li>
	<li>将切片浸入四氧化锇中 30 分钟&#160;在室温下，使用移液管每次加入一滴四氧化锇，以防止切片折叠。用铝箔覆盖孔板，以保护切片免受光照。 
	注意：此步骤可固定切片中的脂质。四氧化锇后固定后，组织会呈现深黑色。</li>
	<li>在组织样本浸入四氧化锇期间，于一次性烧杯中配制塑料树脂：按顺序加入20 g组分A、20 g组分B、0.6 g组分C和0.4 g组分D。按上述顺序将各组分混合，使用10 ml血清移液管充分搅拌，直至获得均匀一致的颜色。</li>
	<li>将制备好的混合物转移至铝制称量皿中。待组织切片脱水后，将置于其中。</li>
	<li>依次使用递增浓度的乙醇脱水，每步2分钟，顺序如下：35%、35%、50%、70%、80%、90%、100%、100%、100%。</li>
	<li>为去除残留的乙醇，将切片浸入丙烯酸甲酯中，每次2分钟，共3次。将脱水后的切片从24孔细胞培养板转移至20 ml玻璃小瓶中。由于丙烯酸甲酯会溶解塑料且具有危害性，操作时务必使用玻璃小瓶并保持谨慎。</li>
	<li>使用弯头玻璃移液管尖端或细毛刷将切片从丙烯酸氧化物溶液转移至树脂中，并在室温下过夜浸润。注意避免用丙烯酸氧化物稀释树脂。</li>
	<li>将组织切片连同树脂包埋在聚氯三氟乙烯（PCTFE）薄膜上：
	<ol>
		<li>将装有样品的铝制称量皿放入50 - 60 °C的烘箱中，加热10 - 15 min&#160;在将切片包埋于PCTFE薄膜之前。</li>
		<li>每次处理一个铝制称量皿来包埋切片。使用细画笔，在一片PCTFE膜上涂一层薄薄的树脂。</li>
		<li>将组织一次一片地从铝制称量皿转移至PCTFE膜片上。去除组织周围的多余树脂，注意不要扰动组织。</li>
		<li>将所有切片从一个称量皿转移至PCTFE膜片上后，将另一张PCTFE膜片覆盖在第一张之上，使组织与树脂夹在两张膜片之间，形成夹心结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在55 - 60 °C的培养箱中孵育树脂，使其聚合，持续3天。</li>
	<li>材料现已准备好进行超薄切片和超微结构观察，这些是通常由电镜核心设施执行的专业技术。将样品安全地存放在PCTFE薄膜之间，在室温下可长期保存而不发生超微结构降解。 
	注意：超薄切片及透射电子显微镜观察的后续步骤在另一份实验方案中有详细说明13.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了一种利用电子显微镜对致密核心Aβ斑块进行共定位研究的关联方法。甲氧基-X04 体内 注射可快速筛选出特定脑区和特定层次中包含Aβ斑块的脑切片，例如海马CA1区的辐射层和 lacunosum-moleculare 层。在本示例中，采用甲氧基-X04预筛选结合IBA1的包埋前免疫染色，以研究在致密核心Aβ斑块存在条件下，不同小胶质细胞表型在超微结构水平上如何与突触相互作用。
小胶质细胞对其周围环境具有极强的响应性，其炎症活性长期以来在损害正常脑功能和促进阿尔茨海默病（AD）进展的背景下被广泛研究。特别是，这些细胞因广泛活化并释放促炎性细胞因子，导致慢性神经炎症以及正常脑内稳态的破坏，而被牵连于神经退行性过程15。然而近年来，这些常驻免疫细胞也被发现可在健康脑中主动重塑神经元环路，从而揭示了新的致病机制16,17。在阿尔茨海默病的神经炎症过程中，它们在突触处的生理功能可能失调，导致突触丢失加剧，而突触丢失目前被认为是各种神经退行性疾病中认知功能下降的最佳病理相关指标18,19。
<p ...

Aβ 淀粉样斑块的形成是阿尔茨海默病（AD）主要的神经病理学特征。然而，越来越多的证据表明免疫系统在疾病进展中发挥着重要作用。1,2特别是，来自临床前和临床研究的新数据已确定免疫功能障碍是阿尔茨海默病（AD）病理过程的主要驱动因素和促成因素。基于这些发现，中枢及外周免疫细胞已成为治疗AD的潜在治疗靶点。3. 以下方案结合了光学显微镜和电子显微镜（EM），以深入揭示Aβ斑块沉积与阿尔茨海默病（AD）中小胶质细胞表型改变之间的关系。该方案允许利用抗体标记AD小鼠模型中的Aβ斑块 体内 荧光染料甲氧基-X04的注射。甲氧基-X04是一种刚果红衍生物，可轻易穿过血脑屏障进入脑实质，并以高亲和力结合β-折叠片层结构。由于该染料具有荧光特性，可用于 体内 使用双光子显微镜检测Aβ斑块沉积4一旦与Aβ结合，methoxy-X04不会从斑块上解离或重新分布，且能长期保持其荧光信号。通常通过外周给药，以实现对脑部动态的无创成像。5荧光在醛类固定后仍然保留，可用于相关死后分析，包括研究Aβ斑块周围神经元的死亡情况6.
本方案利用甲氧基-X04的特性，筛选出在特定感兴趣区域（海马CA1区、辐射层和 lacunosum-moleculare 层）出现Aβ斑块的APPSWE/PS1A246E小鼠（APP-PS1；共同表达APP基因Lys670Asn/Met671Leu双突变及人源早老素PS1-A264E变异体）脑切片7，随后对小胶质细胞标志物离子化钙结合接头分子1（IBA1）进行包埋前免疫染色，以通过电子显微镜观察小胶质细胞胞体及突起。小鼠在经心脏灌流固定前24小时接受腹腔注射甲氧基-X04溶液&#160;。使用振动切片机获取冠状面脑组织切片。选取包含海马CA1区的切片，在荧光显微镜下筛查辐射层和 lacunosum-moleculare 层中是否存在Aβ斑块。随后对选定的脑切片进行IBA1免疫染色、四氧化锇后固定及塑料树脂包埋。本方案完成后，切片可长期保存而无进一步的超微结构降解，随时可用于超薄切片及超微结构观察。重要的是，即使经过不同抗体的免疫染色（例如本方案中的IBA1染色），Aβ斑块仍保持荧光特性。在四氧化锇后固定后，斑块区域会比周围神经组织更暗，该现象与甲氧基-X04染色无关，有助于精确识别需用透射电子显微镜观察的感兴趣区域，通常可定位至数平方毫米范围内。
这种关联性方法为在超微结构水平上识别特定脑区提供了高效途径。在研究早期阿尔茨海默病（AD）病理时尤其有用，因为特定脑区或脑层可能仅含有少量Aβ斑块，且仅存在于少数组织切片中。在这些情况下，若仅为了获得少数含有Aβ斑块且位置正确的组织切片，而在多张脑切片上进行Aβ免疫染色（以及与其他细胞标志物如IBA1的双重标记），效率将非常低下。此外，在处死动物并进行组织处理前，对活体小鼠注射methoxy-X04不会影响超微结构的保存。相比之下，其他方法如对固定组织切片进行刚果红、硫黄素S、硫黄素T或methoxy-X04的死后染色，需在乙醇中进行染色分化8-11，这会引起渗透压应激并破坏超微结构。此外，刚果红已被证实为人类致癌物12。

<table><tbody><tr><td>甲氧基-X04</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4920</td><td>每片含10 mg底物</td></tr><tr><td>丙二醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W294004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>氯化钠 NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris Hydrochloride）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP153500</td><td></td></tr><tr><td>丙烯醛</td><td>Sigma</td><td>110221</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>颗粒状多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Fisher</td><td>09-790-14F</td><td></td></tr><tr><td>带管路的蠕动泵</td><td>ColeParmer</td><td>cp.78023-00</td><td></td></tr><tr><td>Excel 翼状采血针 25&amp;nbsp;G</td><td>Becton Dickinson</td><td>367341</td><td></td></tr><tr><td>超细镊子</td><td>F.S.T</td><td>11152-10</td><td>尖端形状：弯曲</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14090-09</td><td>尖端形状：直头</td></tr><tr><td>哈特曼止血钳</td><td>F.S.T</td><td>13003-10</td><td>尖端形状：弯曲</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>F.S.T</td><td>14004-16</td><td>尖端形状：直头</td></tr><tr><td>显微解剖剪</td><td>ROBOZ 外科器械商店</td><td>5818</td><td></td></tr><tr><td>玻璃闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>74515-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000 S 振动切片机</td><td>Leica Biosystems&amp;nbsp;</td><td>14047235612</td><td></td></tr><tr><td>振动切片刀片</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>71990</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP230-4</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢，30%</td><td>J.T.BAKER</td><td>cat: 2186-01</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma</td><td>480886</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-500ML</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），第五组分</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001H24</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 IBA1 抗体&amp;nbsp;</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111066046</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒（标准型）</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）</td><td>Sigma</td><td>D5905-50TAB</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>四氧化锇，4% 溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td>注意：有毒</td></tr><tr><td>Durcupan&amp;trade; ACM 单组分 A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td>树脂 注意：有毒</td></tr><tr><td>Durcupan&amp;trade; ACM 单组分 B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td>固化剂 注意：有毒</td></tr><tr><td>Durcupan&amp;trade; ACM 单组分 C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td>增塑剂 注意：有毒</td></tr><tr><td>Durcupan&amp;trade; ACM 单组分 D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td>促进剂 注意：有毒</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>LesAlcoolsdeComerce</td><td>151-01-15N</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷</td><td>Sigma</td><td>110205</td><td>注意：腐蚀性</td></tr><tr><td>铝制称量皿</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70048-01</td><td></td></tr><tr><td>ACLAR&amp;reg;&amp;ndash;氟聚合物薄膜</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50425</td><td></td></tr><tr><td>烘箱/培养箱</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

本文提供了一种详细的实验方案，用于在进行包埋前免疫染色（特异性针对小胶质细胞表达的钙结合蛋白离子化钙结合接头分子1（IBA1））以及电镜（EM）组织处理之前，鉴定阿尔茨海默病小鼠模型脑切片中的淀粉样蛋白Aβ斑块。甲氧基-X04是一种可穿透血脑屏障并选择性结合致密核心Aβ斑块中β-折叠片层结构的荧光染料。在动物处死及脑组织固定前注射甲氧基-X04，可实现对含斑块脑切片的预先筛选和选择，从而避免后续耗时操作在无斑块的切片上浪费资源。当研究特定脑区或脑层中早期阿尔茨海默病病理时，该方法尤为有用，因为在这些区域中斑块数量可能极少，仅存在于少数切片中。死后使用刚果红、硫黄素S或硫黄素T（甚至甲氧基-X04）对组织切片进行处理也可标记β-折叠片层结构，但需要使用乙醇进行大量脱色以去除多余染料，而这些步骤会破坏超微结构的保存。此外，若对目标区域的所有脑切片均进行Aβ（及其他细胞标志物如IBA1）标记，则仅少数切片在正确位置含有Aβ斑块，效率低下。重要的是，在完成电镜组织处理后，Aβ斑块仍可见，从而能够精确定位需用电子显微镜观察的区域（通常精确到数平方毫米范围内）。

本部分展示了在实验方案不同关键步骤中可获得的结果。具体而言，结果示例显示了特定脑区和感兴趣层内含有甲氧基-X04染色斑块的脑切片：海马CA1区、辐射层以及 lacunosum-moleculare 层。通过联合使用紫外光和明场滤光片，可依次观察到斑块以及海马的区域性和层状结构（图1）。所选脑切片随后进行免疫染色并进一步处理用于电镜观察，同时持续追踪其Aβ斑块，需注意的是，免疫染色后这些斑块仍保持荧光特性，而在经四氧化锇处理及包埋后，其颜色会比周围神经组织更深（图1）。这使得研究人员能够根据斑块的位置确定需用电子显微镜观察的区域（通常为数平方毫米）。此外，本文还描述了一种改进的IBA1抗体对小胶质细胞进行包埋前免疫染色的实验方案。该方案可极为清晰地显示小胶质细胞的胞体、粗大及细小突起（图2），并确保抗体在脑切片中的良好穿透。因此，该方法有助于在超微结构水平上识别小胶质细胞的胞体与突起，并研究其与Aβ斑块之间的相互作用（图3和图4）。...

本文介绍了一种利用甲氧基-X04对阿尔茨海默病小鼠模型中的淀粉样Aβ斑块进行可视化成像的实验方案。甲氧基-X04可穿过血脑屏障，并特异性结合致密核心Aβ斑块中的β-折叠片层结构，从而可在进行免疫染色及电镜制样前对含斑块的组织切片进行预筛选。

本文提供了一种详细的方案，用于在进行预包埋免疫电镜标记前，鉴定阿尔茨海默病小鼠模型脑切片中的淀粉样蛋白Aβ斑块。

本实验的总体目标是在进行包埋前免疫染色及透射电镜组织处理之前，鉴定阿尔茨海默病小鼠模型脑切片中的β-淀粉样蛋白斑块。该方法有助于回答神经免疫学领域中的关键问题，例如小胶质细胞与靠近淀粉样β斑块的突触之间的相互作用。该技术的主要优势在于，能够预先筛选出在特定脑区和层次中含有淀粉样β斑块的脑组织切片。尽管该方法可应用于阿尔茨海默病，也可应用于任何存在淀粉样变性的其他疾病或组织。首先，配制浓度为 5 毫克/毫升的甲氧基-X04 化合物溶液。使用微量天平称取 5 毫克甲氧基-X04。在通风橱中，将甲氧基 X04 溶解于 100 微升 DMSO 中，搅拌至形成澄清的绿色溶液。在搅拌过程中依次加入 450 微升丙二醇和 450 微升磷酸盐缓冲液。将溶液在 4 摄氏度下持续混合过夜。第二天应可见黄绿色乳状物。注射甲氧基-X04后，按批准的方法给予每公斤体重10毫克的剂量，并在预定时间点处死动物，用预冷的PBS缓冲液冲洗经多聚甲醛固定的脑组织三次。然后，使用锋利的剃刀刀片切除嗅球，并将脑组织沿冠状面切成两到三块高度大致相等的组织块，所有组织块可同时进行切片，以加快实验进程。将脑组织块粘附到固定于托盘中的标本板上，确保光滑的切面牢固地贴附在标本板表面。向托盘中加入PBS溶液，直至整个脑组织表面完全浸没。将托盘放入振动切片机中，并调整振动切片机参数以获得50微米厚的切片。开始切片，若需立即进行筛选，使用细毛笔将切片转移至磷酸盐缓冲液（PBS）中。或者，可将切片置于含有冷冻保护液的玻璃小瓶中，于20摄氏度保存。借助小鼠脑立体定位图谱，选取包含目标区域的脑切片，并将每张切片放入24孔细胞培养板的孔中，置于冷冻保护液内。接着，使用一次性移液器将一滴PBS滴加到显微镜载玻片上，然后将脑切片放置于液滴中。在荧光显微镜下观察切片，识别含有甲氧基-X04标记的Aβ斑块的区域。在不移动显微镜载物台的情况下，分别在明场和荧光模式下采集目标区域的图像。每幅图像必须在两种模式下显示相同区域，以便将斑块与组织切片的结构区域相对应。根据动物编号保存并命名所采集的图像。同时记录培养板中的孔位编号以及所拍摄图像的视野位置。成像完成后，立即将切片放回指定的孔中。按照相同的操作流程依次检查下一个切片，以避免切片干燥。为对齐图像，在 ImageJ 中打开同一 ROI 的明场和紫外场图像。然后使用 MosaicJ 插件对齐两张图像的边缘。根据孔板编号将对齐并合并后的图像保存在对应动物编号的文件夹中。将同一动物不同脑区的图像进行整合，以识别和定位目标区域中的斑块。筛选过程完成后，将已检测的切片置于含有冷冻保护剂的24孔细胞培养板中，于20摄氏度保存，直至进行免疫染色或进一步处理。首先，在玻璃小瓶中用磷酸盐缓冲液配制1%四氧化锇溶液。由于四氧化锇具有光敏感性，需用铝箔包裹玻璃小瓶，以保护溶液免受光照。在磷酸盐缓冲液洗涤后，移除切片上的缓冲液，并使用细毛刷将切片展平。在添加四氧化锇之前，务必立即展平切片，因为切片中的任何褶皱都会变得永久性，而在四氧化锇固定后尝试展平组织只会导致切片破裂。使用移液管逐滴加入四氧化锇至切片，直至切片完全浸没。用铝箔覆盖孔板以避光，室温孵育30分钟。孵育期间，在一次性烧杯中制备塑料树脂。按顺序将各组分混合，使用 10 毫升血清移液管充分混匀，直至获得均匀的颜色。将配制好的混合液转移至铝制称量皿中。待组织切片脱水后，将置于其中。孵育时间结束后，将切片依次浸入浓度递增的乙醇中脱水，每次两分钟。将脱水后的切片从24孔培养板转移至20毫升玻璃小瓶中。然后将切片浸入丙酮氧化物中三次，每次两分钟，以去除残留的乙醇。接下来，使用弯头玻璃移液管尖端或细小的画笔将切片从丙烯酸氧化物溶液中转移至塑料树脂中，并在室温下静置过夜以完成浸透。浸透完成后，将装有样品的铝制称量皿放入50至60摄氏度的烘箱中加热10至15分钟。若需将切片包埋于三氟氯乙烯共聚物膜片上，应先用细小画笔在切片表面均匀涂布一层薄树脂。然后，将铝制称量皿中的组织切片逐片转移至PCTFE膜片上，小心去除组织周围的多余树脂，注意不要扰动组织。将一个称量皿中的所有切片转移至PCTFE膜片后，在其上方覆盖第二张PCTFE膜片，使组织和树脂夹在两张膜片之间，形成夹心结构。在55至60摄氏度的培养箱中使树脂聚合三天。组织即可用于超薄切片及超微结构观察。以下图像显示了同一海马区切片分别采用明场和荧光模式进行的双重成像。在明场下观察目标区域和层次。使用340至380纳米的紫外滤光片可成功定位Aβ斑块。该图像显示的是进行IBA1预包埋免疫染色前的海马组织切片。虚线标出了一个可见的斑块。该图像显示了同一区域在进行IBA1预包埋免疫染色及透射电子显微镜处理后的结果。请注意，经电子显微镜组织处理后，虚线圈出的斑块仍然可见。一旦掌握，若操作得当，该方案可在一周内完成。在进行此操作时，重要的是要牢记每一步都必须严格进行，以降低污染及其他结构降解的风险，这些因素均会影响样品的质量。切勿忘记，使用锇时可能具有极高危险性，因此在执行该操作时，应始终采取预防措施，例如穿戴实验服和手套。请务必根据您所在机构的指南，在实验结束使用后将其丢弃。

相关光学显微镜与电子显微镜技术研究小胶质细胞与β-淀粉样蛋白斑块的相互作用

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