通过光谱流式细胞仪由固态组织中分离出悬浮细胞系的分析

这种光谱细胞术技术的总体目标是使用其整个发射光谱来区分不同的荧光染料。此外，该协议可以将自发荧光作为独立参数实施，从而允许对从实体器官中分离的细胞进行适当分析。这种方法可以帮助回答免疫学和干细胞生物学发展领域的关键问题，例如如何识别稀有细胞群。

该技术的主要优点是它具有同时分析大量参数并管理实体组织自发荧光的独特能力。虽然这种方法用于制备来源于肠道和心脏的单细胞悬液，但它也可以应用于其他器官，例如肺、骨骼、肌肉、肝脏、脂肪和肾脏。首先，分离并清洗成年小鼠的小肠。

然后，将纸巾放在纸巾上，并使用锋利的剪刀小心地去除 Peyer 的贴片。纵向切开肠子，分成一厘米的小块。然后，将组织转移到装有 30 毫升 HBSS 并添加 10% FCS 的烧杯中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

孵育完成后，将细胞悬液转移到 15 mL 塑料管中，并剧烈涡旋 5 分钟。然后，将悬浮液在冰上孵育 10 分钟，让未解离的大片段沉淀。然后，将上清液转移到新试管中，以 120 倍 G 离心细胞 7 分钟。

沉淀后，我们将细胞悬浮在 10 毫升 1% FCS 的 HBSS 中，并使用 Neubauer 室对其进行计数。在细胞染色之前，将 1 乘以 10 至第六肠细胞转移到 5 毫升试管中以制备阴性对照。制备样品时，向第六个肠细胞中加入 1 乘以 10，然后将 2 毫升含 1% FCS 的 HBSS 加入新的 5 毫升试管中，并在 4 摄氏度下以 120 倍 G 离心悬浮液 5 分钟。

弃去上清液后，我们将细胞悬浮在 50 μL 抗体溶液中。包裹铝箔管，将细胞在 4 摄氏度下孵育 20 分钟。孵育完成后，向样品中加入 2 毫升 1% FCS 的 HBSS 溶液，并以 120 倍 G 和 4 摄氏度离心 5 分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于 200 微升 0.5 微克/毫升碘化丙啶溶液中。将小鼠胚胎斩首后，将其身体浸泡在培养皿中，衬有预先湿润的纸巾，并填充 50 毫升 1% FCS 的 HBSS 溶液。在立体显微镜下，在胚胎胸部的右侧切开一个切口，小心地打开胸部，避免损伤心脏。

抓住大血管，拔出与肺和胸腺相连的心脏。将器官转移到一个 35 毫升培养皿中，培养皿中装有两毫升 1% 的 HBSS 中的 FCS。然后，将心脏与周围器官和结缔组织隔离。

清洗心脏后，将其浸泡在一毫升预热的酶溶液中，并使用细镊子和手术刀，在立体显微镜下将器官切成一立方毫米的小块。再加入 1 毫升预热的酶溶液，并将碎片组织转移到加盖的 5 毫升试管中。将样品在 37 摄氏度的水平位置孵育 15 分钟。

孵育完成后，用 P1000 移液器重复移液悬浮液，使组织匀浆。然后，将样品垂直放置放在一边，直到未消化的组织碎片沉淀。将上清液转移至 50 mL 试管中。

在 HBSS 中加入 2 毫升 10% FCS，并将分离的细胞保持在冰上。接下来，将 2 毫升预热的酶溶液添加到含有未消化组织沉淀物的 5 毫升试管中，并如前所述继续消化组织，直到没有观察到残留组织。将获得的细胞悬液以 120 倍 G 离心 10 分钟。

然后，弃去上清液，将细胞重悬于一毫升 1% FCS 的 HBSS 中，不含钙和镁阳离子。为了对心脏细胞进行染色，将 200 微升细胞悬液转移到圆底 96 孔板的孔中。将板以 480 倍 G 离心 1 分钟，然后弃去上清液。

接下来，将心肌细胞重悬于 100 μL 抗体溶液中。用铝箔包裹板，并在 4 摄氏度下孵育 20 分钟。孵育完成后，在不含钙和镁的 HBSS 中用 200 微升 1% FCS 洗涤心肌细胞，并以 480 倍 G 离心悬浮液 1 分钟。

然后，将细胞重悬于 200 微升 1% FCS 的不含钙和镁离子的 HBSS 中，并将悬浮液转移到预填充有 200 微升 1% FCS 的不含钙和镁的 HBSS 的 5 毫升试管中。最后，在不含钙和镁阳离子的 HBSS 中加入 400 微升 1% FCS，每毫升含有 0.5 微克碘化丙啶，并通过 70 微尼龙网过滤细胞悬液。要观察细胞，请将染色样品上样到流式细胞术中，然后单击预览，然后单击 acquire（获取）记录样品中最多两乘以 10 到第 6 个事件。

在分析选项卡中，打开调色板窗口，并通过添加荧光染料及其相应的标记来注册所有研究的参数。确保包括自发荧光和活力参数。在控制窗口的试管列表中，分析第一个包含补偿微珠的单染色样品。

然后，在工作表中，单击多边形设计工具，并在 FSC SSC 图中对珠子数量进行门控。双击门以创建门控微珠的子图。然后分别对正磁珠和负磁珠进行门控。

通过连续设门和消除每个正负馏分中的异常值来验证选定的子群体。然后，在 un-mixing 窗口中上传负门和正门。接下来，在试管列表中选择未染色的细胞样品，并为自发荧光和非自发荧光细胞设计单独的门。

为所有参数（包括自发荧光和活力）定义负门和阳性门后，单击"计算"。然后，对分析的样品进行解混。为了分析数据，在 SSC 与 FSC 的图中对细胞设门，并排除碘化丙啶染色的死细胞。

最后，确定所有感兴趣群体的门。这里介绍的是从胎心分离并经抗 TER119、抗 CD45 和抗 Sca-1 抗体染色的细胞的流式细胞术和光谱细胞术分析的结果。通过两个常规细胞仪检测自发荧光细胞的亚群，而在光谱细胞术中，这些细胞未被定义为自发荧光，并且包含在 CD45 TER119 阴性群体中。

然后分析通过常规流式细胞术鉴定为自发荧光的细胞，而不是 CD31 阳性细胞，以检测心肌细胞特异性转录物的表达。在自发荧光细胞群中发现高水平的心肌肌钙蛋白和心房肌细胞（如火车转录物），证实了传统流式细胞术中遗漏了大部分心肌细胞。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在大约 8 小时内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住所有步骤都应在冰上及时进行，以确保细胞保持活力。按照这些程序，可以进行细胞内蛋白质和其他表面标志物的分析，以回答有关特定分子途径的问题。这项技术为免疫学和发育或干细胞生物学领域的研究人员探索和分离来自不同器官的稀有群体铺平了道路。

观看本视频后，您应该对如何从细胞组织中分离和染色细胞，以及如何通过光谱流式细胞术分析表面标志物表达有很好的了解，从而克服细胞自发荧光带来的限制。不要忘记，使用碘化丙啶可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如使用 PPE。