Name: 通过光谱流式细胞仪由固态组织中分离出悬浮细胞系的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 学习光谱流式细胞仪技术，通过完整发射光谱区分荧光染料，将自发荧光作为独立参数处理，实现对小鼠肠道、心脏等实体器官悬浮细胞的精准分析，助力免疫学与干细胞生物学研究。

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我们感谢K. Futamura在光谱流式细胞术方面的技术与理论贡献，其还对本文稿进行了关键性审阅。我们还要感谢C. Ait-Mansour、P.-H. Commere、A. Bandeira和P. Pereira对本文稿的仔细阅读，以及他们提供的无尽技术建议与支持。我们同时感谢P. Pereira惠赠抗Vγ7-APC和Vδ4-生物素标记抗体。&#160;我们感谢巴斯德研究所教学中心&#160;为拍摄工作提供的接待与后勤支持。本研究得到了巴斯德研究所、法国国家健康与医学研究院（INSERM）、瑞士国家科学基金会和巴斯德Roux奖学金（S.S.）；葡萄牙科技基金会—SFRH/BD/74218/2010（M.V.）；以及巴黎狄德罗大学、法国国家科研署（ANR）Twothyme项目、ANR和“未来投资”计划REVIVE项目（A.C.）的资助。

所有实验均根据巴斯德研究所伦理宪章和欧盟指南进行，并获得法国农业部批准。
1. 成年小鼠器官单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>脾细胞的分离
	<ol>
		<li>通过颈椎脱位处死成年小鼠。在腹部正中线做切口，并用剪刀剪开皮肤。用镊子取出脾脏。</li>
		<li>将脾脏置于两片载玻片之间碾碎以分散细胞，并用5 mL含1%胎牛血清（FCS）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）稀释。</li>
		<li>在 120 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于5 mL含1%胎牛血清的HBSS中。使用台盼蓝活体染色法，并用布雷尔计数板进行细胞计数。 
		注意：应从一个成年脾脏中获得8000万个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从小肠中分离细胞
	<ol>
		<li>通过颈椎脱位法处死成年小鼠。使用剪刀在腹部正中线处的皮肤做一切口。用镊子一只手夹住小肠，另一手用剪刀在小肠两端进行剪切：首先在胃之后，然后在小肠末端、大肠之前。使用带针头的2 mL注射器，以1×Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗小肠。</li>
		<li>将小肠置于一张纸巾上，用一把锋利的剪刀小心地剪除派伊尔结。</li>
		<li>用剪刀将剪刀的一侧刀刃插入肠管，沿肠管长轴方向剪开。用锋利的剪刀将打开的肠管切成约1 cm长的小段。</li>
		<li>在30 mL含10% FCS的HBSS中，37 °C下持续搅拌孵育30分钟。</li>
		<li>将细胞悬液连同未完全解离的组织碎片一同转移至50 mL塑料管中，高速涡旋振荡5分钟。注意：组织不再进一步解离。</li>
		<li>在冰上孵育10分钟，使较大且未解离的碎片沉淀。</li>
		<li>收集上清液，并在120 × g离心7分钟以浓缩。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL含1% FCS的HBSS中。使用台盼蓝活体染色，通过血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。 
		注意：应从一名成人的小肠中获得约6000万个上皮内淋巴细胞（IELs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>面板设计策略
	<ol>
		<li>使用直接偶联荧光染料的抗体制备样本。 
		注意：所有抗体均经过预滴定，以获得细胞群体的最佳分辨效果（滴定值可能随抗体批次不同而有所变化）。用于19色染色 panel 染色脾细胞的抗体列于下表： 表1.</li>
		<li>构建用于流式细胞术的多色检测面板。由于此项工作可能具有挑战性，请遵循以下指南以优化面板设计：
		<ol>
			<li>检查仪器的光谱配置以及可使用的荧光染料。</li>
			<li>使用制造商提供的亮度指数/染色指数信息。 
			注意：亮度指数/染色指数是每种荧光染料的荧光强度相对于背景的相对指标。</li>
			<li>根据以下规则选择抗体：
			<ol>
				<li>对于表达量较低的蛋白质，选择最亮的荧光染料；对于表达量较高的蛋白质，选择最暗的荧光染料。 
				注意：例如，CD45、CD4 和 CD8 表达水平较高，可与弱荧光染料联用。</li>
				<li>首先选择荧光染料种类最少的抗体，以此开始设计抗体组合。</li>
				<li>尽可能选择在同一类细胞上表达的标记物所使用的荧光染料，其发射光谱重叠最小。 
				注意：串联结构（例如， PE-Cy5、PE-Cy7 和 PerCP-Cy5.5 应谨慎使用，因其更易受到光照降解。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于流式细胞术分析的细胞染色
	<ol>
		<li>准备一个5 mL离心管，内含1 × 106 脾细胞和一个含有1 × 10⁶的5 mL离心管6 肠细胞，并保持未染色状态以用作阴性对照。</li>
		<li>根据每个样本和每个检测组，准备并标记一个5 mL离心管 表1. 根据说明书配制抗体混合液， 表1，置于含1% FCS的HBSS中。</li>
		<li>转移 1 × 106 细胞——无论是脾细胞还是肠道细胞——加入至各5 mL离心管中。加入2 mL含1%胎牛血清的HBSS，4 °C、120 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于50 µL抗体混合液中。</li>
		<li>分两步标记脾细胞。首先，在5 mL离心管中加入50 µL含有PE-Cyanine 5、PerCP-Cyanine 5.5和PerCP标记抗体的混合液（含Fc受体阻断剂），4 °C避光孵育20分钟；随后，向该5 mL离心管中再加入50 µL含有其余所有抗体的混合液。 
		注意：该策略可限制空间位阻。</li>
		<li>在 4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
		<li>加入2 mL含1% FCS的HBSS，4 °C、120 × g离心5 min。弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL含0.5 µg/mL碘化丙啶（PI）的HBSS 1% FCS中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 每种荧光染料单独染色商品化补偿微珠（例如，UltraComp eBeads）的制备，下文简称微珠
<ol>
	<li>根据所用抗体的数量，准备并标记相应数量的5 mL离心管。每管加入1滴微珠，并向每管中加入1 µL抗体。 
	注意：此处使用的微珠（参见材料表）包含已染色（阳性）和未染色（阴性）的微珠。抗体需过量加入微珠中，以确保产生明亮的信号，从而为每种染料提供清晰的光谱特征。这是软件实现精确解谱所必需的。</li>
	<li>在4 °C避光孵育20分钟。</li>
	<li>加入2 mL含1% FCS的HBSS，以120 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL含1% FCS的HBSS中。</li>
</ol>
3. 胚胎小鼠心脏细胞悬液的制备
<ol>
	<li>胚胎解剖
	<ol>
		<li>提前计划获取妊娠雌鼠，于每日傍晚（17至19时）将2只雌鼠与1只雄鼠合笼交配（始终将雌鼠放入雄鼠笼中）。次日早晨，发现有阴道栓的雌鼠视为交配后0.5天。</li>
		<li>通过颈椎脱位法处死E17.5的妊娠雌鼠。通过用力按压小鼠足掌（趾捏反射）确认动物无反应。用70%乙醇润湿腹部，以达到消毒并防止小鼠毛发扩散的目的。</li>
		<li>使用剪刀在腹部中线处的皮肤上做一切口，并用手指将皮肤拉开。</li>
		<li>使用粗镊子和剪刀，从腹部中央向两侧牵拉并切开腹肌，以打开腹腔。 
		注意：小心操作，避免损伤位于腹膜肌肉正下方的小肠。</li>
		<li>在子宫体和卵巢水平处切断，取下带有胚胎的子宫角，将其浸入90 x 15 mm的培养皿中2 含50 mL DPBS的培养皿</li>
		<li>用精细镊子和剪刀在每个蜕膜之间进行切割，随后切开子宫肌层和卵黄囊，分离出每个胚胎。完整地取出胚胎，最后剪断脐带。</li>
		<li>用剪刀剪下E17.5胚胎的头部（断头），然后开始解剖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心脏的采集
	<ol>
		<li>将去头的胚胎浸泡在90 x 15 mm的培养皿中2 培养皿底部铺有湿润的纸巾作为垫料，并加入50 mL含1%胎牛血清（FCS）的HBSS溶液。</li>
		<li>在体视显微镜下，用粗镊子夹住每个胚胎，使其腹面朝上。</li>
		<li>用剪刀剪开右侧胸壁，小心打开胸腔，以避免损伤心脏。</li>
		<li>用粗镊子夹住肋骨以暴露心脏。</li>
		<li>用镊子夹住大血管（包含心脏进出的主要血管），将仍与肺和胸腺相连的心脏组织分开，并将其置于35 × 15 mm培养皿中2 含1% FCS的2 mL HBSS的培养皿</li>
		<li>使用精细镊子和手术刀将心脏从周围器官和结缔组织中分离出来。</li>
		<li>在新的35 × 15 mm培养皿中用2 mL含1% FCS的HBSS洗涤心脏，并置于冰上20 min，使心脏将心腔内的血液泵出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心肌细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>将200 µg/mL胶原酶预热至37 °C（溶于HBSS+/+中，后文简称酶解溶液）。 
		注意：用含钙镁的 HBSS+/+ 稀释胶原酶2+ 和 Mg2+ 阳离子）以最大化酶活性；胶原酶活性在不同批次间保持稳定。</li>
		<li>将浸泡心脏的洗涤液（HBSS 1% FCS）替换为1 mL预热的酶解液。</li>
		<li>在体视显微镜下，将心脏组织切碎成约1毫米大小3 使用精细镊子和手术刀将组织切成小块。加入另外1 mL预热的酶溶液，将剪碎的组织转移至带盖的5 mL离心管中。 
		注意：为获得最佳消化效果，每2 mL酶解液中最多放置5个E17.5心脏。若同时消化的心脏数量较多，应将其分装至不同的5 mL离心管中。</li>
		<li>将切碎的心脏组织在37 °C下孵育15分钟。 
		注意：将5 mL离心管（正确封闭）平放在培养箱中，以使组织在溶液中充分分散。
		<ol>
			<li>孵育结束时，使用P1000移液器在相同的酶溶液中上下吹打约20次，以匀浆组织。将5 mL离心管垂直放置，静置约3分钟，使剩余的组织碎片沉降。</li>
			<li>将上清液（含有悬浮的消化细胞）收集到50 mL离心管中，加入2 mL HBSS 10% FCS（体积与添加至组织碎片的酶溶液相同），并在继续消化过程中置于冰上保存。 
			注意：在剩余组织消化过程中，HBSS 10% FCS 溶液和冰对于抑制酶活性至关重要。</li>
			<li>向装有剩余组织碎片的5 mL离心管中加入2 mL预热的酶溶液，通过重复步骤3.3.4继续消化，直至观察不到组织碎片为止。 
			注意：大约经过4个消化循环即可完全解离心脏组织（5个E17.5胚胎心脏置于2 mL酶解溶液中）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将含有悬浮细胞的50 mL离心管在300 x g下离心10分钟，弃去上清液。</li>
		<li>重悬细胞沉淀，加入1 mL HBSS-/- 1% FCS，经70 µm尼龙滤网过滤细胞悬液。使用台盼蓝活体染色法，通过血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。 
		注意：用不含 Ca²⁺ 的 HBSS-/- 重悬细胞2+ 和 Mg2+ 阳离子）以减少细胞聚集。从一个E17.5心脏可获得800,000至1,000,000个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用荧光抗体染色心肌细胞 
	注意：所有抗体均经过预滴定，以获得细胞群体的最佳分辨效果（滴定浓度可能随抗体批次不同而有所变化）。心脏样本检测所用抗体列于下表： 表1.
	<ol>
		<li>将悬浮的心脏细胞分配至96孔板（圆底）中，均匀分配至所有需要的孔（每孔200 µL），在480 × g下短暂离心1分钟，弃去上清液。 
		注意：96 孔板（圆底）的所有孔均可使用。</li>
		<li>重悬沉淀，并在避光、4 °C条件下，用100 µL抗体混合液孵育心肌细胞20分钟即， CD45-PE、TER119-PE、CD31-Alexa 647 和 Sca-1-PE-Cyanine5) 溶于 HBSS-/- 1% FCS 中。</li>
		<li>通过加入 200 µL HBSS-/- 1% FCS 洗去心肌细胞中过量的抗体，并在 480 x g 条件下短时离心 1 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，并重复短时离心（步骤 3.4.3）。</li>
		<li>将细胞重悬于200 µL HBSS-/- 1% FCS中，并转移至已含有200 µL HBSS-/- 1% FCS的5 mL离心管中。</li>
		<li>采集前，加入400 µL含1% FCS和0.5 µg/mL PI的HBSS-/-，并通过70 µm尼龙滤网过滤细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用光谱流式细胞仪获取标记的脾脏、肠道和心脏细胞
<ol>
	<li>在采集数据之前，根据制造商的说明自动校准光谱流式细胞仪。在每次实验当天执行日常和每月的质量控制程序。</li>
	<li>当流式细胞仪准备就绪后，开始预览所有标记了抗体的细胞悬液样本。 
	注意：请勿采集。</li>
	<li>确保所有激光器按要求开启。调节FSC增益，使所有细胞在相应图中均可见。圈选细胞群体，并将此圈门应用于对应488 nm激光以及638/405 nm激光的两个光谱图。 
	注意：当荧光染料被638-nm激光激发时（即， 当638 nm激光开启时，存在一个遮蔽617–662 nm波长范围光的滤光片，以防止638 nm激光进入PMT。这会导致部分光谱信号丢失，从而降低在此波长范围内发射的相近染料之间的分辨能力。然而，若无需使用638 nm激光进行采集，可通过关闭该激光器来收集完整的信号。</li>
	<li>调节32通道光电倍增管（PMT）电压（%），使所有荧光染料的信号强度均处于y轴显示范围（1-10）之内6在分别显示488 nm和405/638 nm激发的两个不同光谱图中。 
	注意：必须经过培训才能识别所用所有荧光染料的光谱。</li>
	<li>开始采集样本。点击 &#34;预览&#34; 在屏幕上可视化细胞，然后点击 &#34;获取&#34; 以记录样本。最多保存 2 x 106 每个样本的事件数。</li>
	<li>获取染色样本后，依次获取经活体染料染色的样本以及用所有抗体单独染色的补偿微珠。单击“Preview”以在屏幕上预览细胞，然后单击“Acquire”以记录样本。 
	注意：所有样本和对照组均需保持相同的PMT电压（即， 珠子和未染色样品）；5,000 个事件已基本足够。</li>
	<li>最后，采集未染色细胞悬液的数据。点击 &#34;预览&#34; 在屏幕上观察细胞，然后在 &#34;获取&#34; 记录样本。 
	注意：在实验结束时获取未染色的样本可最大限度地减少荧光细胞的残留。</li>
	<li>按照制造商的说明清洁流式细胞仪，并在采集文件夹中关闭实验。 
	注意：只有在关闭实验后，才会 &#160;保存并可供分析。</li>
</ol>
5. 使用光谱流式细胞术软件分析数据
<ol>
	<li>在 &#34;配色方案&#34; 窗口的 &#34;分析&#34; 选项卡中，通过添加所用的每种荧光染料及其对应的标记物（从可用列表中选择或添加新参数）来登记面板中的所有参数。同时，包含自发荧光和细胞活力参数；所有选定的参数将显示在 &#34;解混&#34; 窗口</li>
	<li>选择第一个单染样本（使用补偿微珠制备） &#34;对照&#34; 窗下 &#34;试管列表&#34; 在“分析”选项卡中查看本实验的结果。在工作表中，单击 &#34;多边形设计工具&#34; 在FSC/SSC图上对微球群体设置门控。双击门控区域顶部，打开光谱图或点图，以在子图中显示被门控的微球。
	<ol>
		<li>在光谱图或点图上分别为阳性微珠和阴性微珠设置一个门。检查每种激光组合对应的阳性和阴性组分的完整光谱，通过连续设门并点击门以验证子代群体，排除异常值。将阴性和阳性门输入到 &#34;解混&#34; 窗。</li>
		<li>对每个单染色样品重复步骤5.2。 
		注意：阳性与阴性设门策略应与被分析的样本相对应，尽管程序允许将其应用于任意样本。无需为每个单染样本确定阴性组分，而应使用未染色微球样本设定通用阴性对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择未染色的细胞样本 &#34;试管列表&#34; 设计针对自发荧光细胞和非自发荧光细胞的门控策略。</li>
	<li>当所有参数（包括自发荧光和细胞活力）的阴性门和阳性门均被选定后 &#34;解混&#34; 窗口，单击 &#34;计算。&#34; 对需要分析的样本应用解混。</li>
	<li>通过设计门控并创建双参数图来分析数据。
	<ol>
		<li>首先，根据SSC与FSC设置门控，然后通过排除所有被活力标记物（PI与CD45）标记的细胞来去除死细胞。在剩余细胞中，按照针对每种细胞悬液所描述的策略，对所有目标细胞群设置门控。图1-3). 
		注意：如有必要，调整补偿参数 &#34;参考光谱调节器&#34; 此工具可用于解混后重新调整每种荧光染料阳性群体的中位值，以防算法未能完美完成该过程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Futamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+full-spectral+flow+cytometry+with+multiple+spectrally-adjacent+fluorescent+proteins+and+fluorochromes+and+visualization+of+in+vivo+cellular+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement.</a> Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).</li>
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<li>Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%2B+cardiac+progenitor+cells+and+heart-making%3A+a+critical+synopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis.</a> Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

传统的流式细胞术（FCM）基于检测荧光探针被激发后发射的光子。一种荧光染料在设计用于检测另一种荧光染料信号的检测器中产生的荧光发射，会引起物理上的信号重叠。这种发射光谱之间的溢出需要通过补偿进行校正。
光谱流式细胞术结合非混合去卷积算法进行数据处理，可实现发射峰相近但光谱形状不同的荧光染料组合使用，无需额外补偿。该分析算法将自发荧光视为独立参数，从实体组织细胞悬液中扣除非特异性荧光。
采用19种荧光染料组成荧光染料组合，仅使用两束激光（488 nm和405 nm）即可分析免疫细胞。实际上，当开启638 nm激光时，32通道光电倍增管（PMT）中对应于该激光激发波长的部分通道将无法使用。为了最大限度地利用PMT的检测能力，关闭了红色激光。对小鼠脾脏细胞进行了分析，能够检测到超过12种不同的细胞群体，其中部分细胞群占造血细胞的比例不足1%。
为了测试光谱流式细胞术处理自发荧光的能力，研究了两种可能影响分析结果的不同情况：一种是淋巴细胞被上皮细胞污染，另一种是分析具有自发荧光的...

在过去的几十年中，流式细胞术（FCM）已成为一种广泛应用的分析方法，是细胞表型研究中不可或缺的技术。可用于标记的荧光染料种类显著增加，尤其是可被紫激光（405 nm）激发的荧光染料例如， 荧光染料的种类不断增多（如 Brilliant Violet 和新型量子点染料），但可用荧光染料的增加也带来了发射光谱重叠的风险，需要耗费大量人力的补偿矩阵校正。流式细胞术（FCM）已广泛用于分析来自实体组织的细胞悬液，但自发荧光细胞的存在限制了对特异性标记细胞群体的分辨。
光谱流式细胞术（spectral FCM）的基本原理已在Futamura et al.1,2中详细报道。简而言之，本研究中使用的光谱流式细胞仪（见材料表）配备有405 nm、488 nm和638 nm激光器。该光谱流式细胞仪通过一个32通道线性阵列光电倍增管（32ch PMT）采集500 nm至800 nm范围内的全部发射荧光光谱，同时配备两个独立的光电倍增管分别用于420 nm至440 nm和450 nm至469 nm波段，从而取代传统的带通滤光片。488 nm激光光斑与405 nm/638 nm激光光斑在空间上相互分离，而405 nm与638 nm激光光斑则共线排列。对于每一个单独的颗粒，光谱流式细胞仪可检测由405 nm和488 nm激光激发产生的最多66个通道的荧光数据。当细胞被638 nm激光激发时，由于插入了遮挡638 nm激光进入光电倍增管的遮蔽片，仪器仅检测58个通道的荧光数据。光谱流式细胞仪采用基于加权最小二乘法（WLSM）的算法分析所获取的完整光谱数据，从而实现重叠荧光光谱的分离。单染色和未染色样本所产生的光谱被识别为基本参考光谱。多染色样本通过数学拟合进行解混，含有多种荧光标记的样本光谱被分解为其各个组分光谱的集合。在光谱技术中，这种“解混”过程3,4取代了传统补偿方法，即去除除检测特定染料之外所有检测器中的信号。
在本研究中，我们将19种荧光染料组合并应用于单一的21参数分析，以鉴定小鼠脾脏中主要的造血细胞亚群。此外，我们证明了光谱流式细胞术能够有效管理自发荧光信号，从而改善了对肠道上皮内淋巴细胞及胚胎心脏细胞的鉴定。事实上，在这些组织中，通过对自发荧光的处理，可将特异性荧光信号分配给那些在传统流式细胞术分析中会被排除的细胞。

<table><tbody><tr><td>小鼠</td><td>Janvier Labs</td><td>CD45.2</td><td>细胞来源</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>消毒</td></tr><tr><td>DPBS（含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，含Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>14040-174</td><td>胚胎收集</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液（含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，含Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）（HBSS+/+）</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>解离、消化和染色溶液</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液（不含Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，不含Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）（HBSS-/-）</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14175095</td><td>解离、消化和染色溶液</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>解离、消化和染色溶液</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td>酶解溶液</td></tr><tr><td>90 × 15 mm，&lt;br/&gt; 塑料组织培养培养皿</td><td>TPP</td><td>T93100</td><td>胚胎和心脏收集</td></tr><tr><td>35 × 15 mm，&lt;br/&gt; 塑料组织培养培养皿</td><td>TPP</td><td>T9340</td><td>心脏收集</td></tr><tr><td>精细虹膜剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>粗镊子（窄型镊子，弯曲，12 cm）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>精细镊子（Dumont 7号镊子）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>手术刀&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>21909-668</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 解剖显微镜</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>取样；目镜 W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>冷光源灯</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>取样；&lt;br/&gt; 配备两条鹅颈光纤</td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>VWR</td><td>60819-310</td><td>细胞消化</td></tr><tr><td>96孔板（圆底）</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td>细胞染色</td></tr><tr><td>尼龙网筛布（已灭菌），&lt;br/&gt; 50/50 mm 片状</td><td>SEFAR NITEX</td><td>SEFAR NITEX</td><td>细胞过滤</td></tr><tr><td>UltrasComp eBeads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光标记抗体</td><td>Biolegend</td><td>货号见下表</td><td>细胞染色</td></tr></tbody></table>

通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

流式细胞术在过去40年中被用于定义和分析淋巴细胞及其他造血细胞的表型。最初仅限于分析少数几种荧光染料，目前已有数十种不同的荧光染料，且可同时组合使用多达14至18种不同染料。然而，仍存在若干限制因素影响其分析能力。由于荧光探针种类繁多，数据处理变得日益复杂，需要构建大型多参数补偿矩阵。此外，现已开发出携带荧光蛋白的转基因小鼠模型，可用于检测和追踪不同组织中的特定细胞类型，因此需要通过流式细胞术分析来自实体器官的自发荧光细胞悬液。光谱流式细胞术通过区分宽波长范围内发射光谱的形状，解决了其中部分问题。该技术采用一种算法对数据进行分析，取代了传统的补偿矩阵，并将自发荧光作为一个独立参数进行处理。因此，光谱流式细胞术能够区分发射峰相近的荧光染料，并可在无需补偿的情况下实现多参数分析。
本方案描述了光谱流式细胞术分析，可实现21参数（19种荧光探针）表征，并能有效管理自发荧光信号，从而在稀有细胞群检测中提供高分辨率。本文展示的结果表明，相较于传统流式细胞术难以表征的组织（如心脏和肠道）中的细胞群体分析，光谱流式细胞术具有显著优势。因此，光谱流式细胞术展现了高性能传统流式细胞术所具备的多参数分析能力，同时无需进行补偿校正，并可实现对自发荧光的有效管理。

用于分析脾细胞的21参数光谱流式细胞术检测方案
图1 显示了应用19色荧光抗体组合对脾细胞进行检测所获得的结果，该组合包含识别T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞和髓系细胞亚群的不同抗体，其中CD45标记所有造血来源的有核细胞。该抗体组合还包括活力染料（PI）以及细胞大小（FSC）和颗粒度（SSC）参数。 图1A 显示参考荧光染料光谱。在排除CD45标记的死细胞后+ 门控（图1B），分析结果表明 CD3+ T细胞表达TcRβ链，并具有预期的CD4/CD8分布及CD25阳性细胞比例+ CD4 T细胞中的细胞。CD8 T细胞中表达CD44和Ly49D的细胞呈正态分布。CD19+ B细胞共同表达B220和MHCII，以及IgM和IgD，这是成熟脾B细胞的典型特征。NK1.1的一...

本文介绍了光谱流式细胞术，这是一种流式细胞术的新方法，利用发射光谱的形状来区分荧光染料。该方法采用一种算法替代补偿，并可将自发荧光作为一个独立参数进行处理。这种新方法使得对从实体器官中分离的细胞进行准确分析成为可能。

流式细胞术在过去40年中已被用于定义和分析淋巴细胞及其他造血细胞的表型。最初仅限于……

该光谱流式细胞术的总体目标是利用不同荧光染料的完整发射光谱来区分它们。此外，本方案能够将自发荧光作为一个独立参数加以利用，从而实现对从实体器官中分离的细胞进行准确分析。该方法有助于回答免疫学和干细胞生物学发育领域中的关键科学问题，例如如何鉴定稀有细胞群体。该技术的主要优势在于其独特的能力，可同时分析大量参数，并有效处理固体组织的自发荧光。尽管该方法常用于制备来源于小鼠肠道和心脏的单细胞悬液，但也可应用于其他器官，例如肺、骨骼肌、肝脏、脂肪和肾脏。首先，从小鼠成年个体中分离并清洗小肠。然后将组织置于一张纸巾上，使用锋利的剪刀小心地切除派伊尔结。沿肠管纵向剪开，并将其分割成每段长约1厘米的小段。随后，将组织转移至含有30毫升添加了10% FCS的HBSS的烧杯中，在37°C条件下持续振荡孵育30分钟。孵育完成后，将细胞悬液转移至15毫升塑料管中，剧烈涡旋振荡5分钟。然后将悬液置于冰上孵育10分钟，使未解离的大块组织碎片沉降。随后，将上清液转移至新管中，在120 × g条件下离心7分钟以收集细胞。离心成团后，将细胞重悬于10 mL含1% FCS的HBSS中，并使用血细胞计数板进行计数。细胞染色前，取1×10⁶个肠细胞转移至一个5 mL离心管中，用于制备阴性对照。制备待测样品时，在一个新的5 mL离心管中加入1×10⁶个肠细胞，随后加入2 mL含1% FCS的HBSS，将悬液在4°C、120 × g条件下离心5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于50微升抗体溶液中。用铝箔包裹试管，并在4°C下孵育20分钟。孵育结束后，向样品中加入2毫升含1% FCS的HBSS溶液，在4°C下以120 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL含0.5 µg/mL碘化丙啶的溶液中。将小鼠胚胎断头后，将其躯体置于已铺有预湿滤纸的培养皿中，皿内加入50 mL含1% FCS的HBSS溶液。在体视显微镜下，于胚胎胸部右侧做一切口，小心打开胸腔，注意避免损伤心脏。抓住大血管，取出与肺和胸腺相连的心脏。将器官转移至一个含有2毫升含1% FCS的HBSS溶液的35毫升培养皿中。随后，从周围器官和结缔组织中分离出心脏。清洗心脏后，将其浸入1毫升预热的酶解溶液中，在体视显微镜下用精细镊子和手术刀将器官切成每块约1立方毫米的小块。加入额外的1毫升预热酶解溶液，将组织碎片转移至一个带盖的5毫升离心管中。将样品置于37摄氏度下水平孵育15分钟。孵育完成后，使用 P1000 移液器反复吹打悬浮液，使组织充分匀浆。然后将样品垂直静置，直至未消化的组织碎片沉降。将上清液转移至 50 毫升离心管中。加入2 mL含10% FCS的HBSS，并将分离的细胞置于冰上。接着，向含有未消化组织沉淀的5 mL离心管中加入2 mL预热的酶解液，并继续消化组织，直至显微镜下观察不到残留组织，具体操作如前所述。将获得的细胞悬液在120 × g下离心10分钟。然后，弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升含1% FCS的HBSS中，HBSS中不含钙和镁阳离子。为染色心肌细胞，将200微升细胞悬液转移至圆底96孔板的孔中。以480 × g离心1分钟，然后弃去上清液。接下来，将心肌细胞重悬于100 µL抗体溶液中。用铝箔纸包裹培养板，在4°C下孵育20分钟。孵育完成后，用200 µL含1% FCS的无钙镁HBSS缓冲液洗涤心肌细胞，并在480 × g条件下离心1分钟。然后，将细胞重悬于200 µL含1% FCS且不含钙、镁离子的HBSS中，并将该悬液转移至预先加入200 µL含1% FCS且不含钙、镁离子的HBSS的5 mL试管中。最后，加入400 µL含1% FCS且不含钙、镁阳离子的HBSS，其中包含0.5 µg/mL碘化丙啶，然后将细胞悬液通过70 µm尼龙滤网过滤。为观察细胞，将染色后的样本上机进行流式细胞术分析，点击预览，随后通过点击采集记录样本中最多2×10⁶个事件。在分析选项卡中，打开颜色面板窗口，并通过添加荧光染料及其对应的标记物来登记所有研究参数。务必包含自发荧光和细胞活力参数。在控制窗口的试管列表中，分析第一个含有补偿微珠的单染样本。然后，在工作表中点击多边形设计工具，在FSC-SSC图中圈选微球群体。双击该门控以创建已圈选微球的子图。接着分别圈选阳性微球和阴性微球。通过连续设门并剔除每个阳性与阴性组分中的异常值，验证所选的子代细胞群体。然后，在解混窗口中上传阴性和阳性设门。接着，在样本管列表中选择未染色细胞样本，并分别设置自发荧光细胞和非自发荧光细胞的设门。在定义所有参数（包括自发荧光和细胞活力）的阴性与阳性门控后，点击“计算”，随后对已分析的样本应用解混处理。分析数据时，在SSC与FSC的散点图中圈选细胞门，并排除经碘化丙啶染色的死细胞。最后，确定所有目标细胞群的设门策略。此处展示的是从胎心分离的细胞经抗-TER119、抗-CD45和抗-Sca-1抗体染色后，通过流式细胞术和光谱细胞术分析的结果。在两台传统细胞仪中检测到一群自发荧光细胞，而在光谱细胞术中，这些细胞未被识别为自发荧光细胞，而是归属于CD45 TER119阴性细胞群。通过传统流式细胞术鉴定为自发荧光但非 CD31 阳性的细胞，随后被分析其心肌细胞特异性转录本的表达情况。在自发荧光细胞群体中检测到高水平的心肌肌钙蛋白和类似心房肌细胞的转录本，证实传统流式细胞术遗漏了大部分心肌细胞亚群。一旦掌握，若操作得当，该技术可在约八小时内完成。在进行该操作时，重要的是要牢记所有步骤均需在冰上及时完成，以确保细胞保持活性。在完成该操作后，可进一步开展细胞内蛋白检测及额外表面标志物的分析，以探究特定分子通路的相关问题。该技术为免疫学、发育生物学或干细胞生物学领域的研究人员探索并分离不同器官中的稀有细胞群体奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何从细胞组织中分离并染色细胞，以及如何通过光谱流式细胞术分析表面标志物的表达，从而克服细胞自发荧光带来的局限性。请务必注意，使用碘化丙啶具有极高的危险性，在进行该操作时应始终采取防护措施，例如穿戴个人防护装备（PPE）。

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科研

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生物学

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