分离子宫先天淋巴细胞，用于流式细胞术分析

这是一种从怀孕和非怀孕小鼠中分离子宫淋巴细胞的方法。该方法可用于多种下游应用，如FACS表型分析，细胞分选，功能测定，RNA-seq和蛋白质组学。这里的方案演示了如何通过流式细胞术对1组子宫先天淋巴细胞进行表型分析。

我们的方法能够评估怀孕和非怀孕动物子宫组织中存在的不同淋巴细胞亚群的组成和功能特征。该协议允许分离子宫淋巴细胞，同时保持蛋白质的表面表达，细胞活力和功能。因此，它适用于一系列后续应用。

在实验开始时取出胎儿和收集白细胞在技术上是具有挑战性的步骤。由于这是一个漫长的实验，一旦达到抗体染色步骤，就需要特别注意和关注。首先，将从怀孕的C57黑六雌性小鼠收获的子宫组织转移到无菌培养皿中，然后使用无菌器械轻轻去除组织周围的脂肪，注意不要让组织干燥。

通过用无菌器械解剖每个植入部位来切除胎儿，然后将子宫返回到含有一毫升收集介质的原始五毫升收集管中。使用剪刀，将收集管中的组织切碎，然后将管子置于37摄氏度的水浴中。接下来向管中加入三毫升预热的酶消化混合物。

在37摄氏度下搅拌管子孵育30分钟，以增强酶消化活性。孵育完成后，涡旋管，并将其保持在冰上以抑制酶活性，然后将消化组织转移到正确标记的15毫升离心管中。用总共10毫升冰冷的五毫摩尔EDTA PBS溶液冲洗五毫升收集管，以收集所有剩余的组织并将其转移到15毫升离心管中。

将消化的组织样品以400倍G离心10分钟，弃去上清液，轻轻轻地轻地将沉淀在10毫升预热的5毫摩尔EDTA PBS溶液中重悬。为了减少细胞结块，将样品在37摄氏度下搅拌，然后在高处涡旋10秒。为了去除未关联组织中的细胞团块，将70微米的过滤器放在无菌的50毫升离心管的顶部，然后使用无菌的一毫升注射器的柱塞，迫使消化的组织通过过滤器进入管中。

用总共10毫升的冷PBS洗涤过滤器几次以收集所有细胞，然后在400倍G下花费50毫升离心管10分钟.丢弃上清液后，可以使用选项A或选项B分离先天淋巴细胞。对于选项A，使用移液器voy将沉淀重悬于5毫升80%等渗。然后使用移液器以低速速度，小心地将8毫升，每个呼叫溶液40%，覆盖在15毫升离心管中的重悬沉沉淀上。缓慢而连续地移液，将15毫升保持在约45度角。

在不干扰覆盖层的情况下，以850倍G离心管20分钟，在室温下具有中等加速度和最小断裂。离心完成后，小心地从离心机中取出管子，不要干扰每个调用层。接下来，在不干扰两个每次呼叫溶液的界面处的白细胞环的情况下，使用无菌的巴氏移液管丢弃除每个呼叫层顶部0.5至1毫升之外的所有白细胞环。

在尝试将吸入移液器的每次调用溶液的量保持在最低限度的同时，小心地收集白细胞环，并将细胞转移到新标记的15毫升离心管中。向细胞中加入10毫升无菌RPMI培养基，补充10%的热量和活化的FBS，然后在500倍G和4摄氏度下离心细胞5分钟。弃去上清液并继续红细胞裂解。

为了使用选项B分离细胞，在将消化的组织通过细胞过滤器并离心细胞悬浮液的结果后，如前所述，用8毫升35%等渗的每次调用和RPMI培养基重悬沉淀，并将细胞转移到15毫升管中。在室温下以940倍G离心管10分钟，具有中等加速度和最小断裂。然后使用吸气器或移液器，小心地吸出上清液，然后将沉淀重悬于14毫升RPMI培养基中，补充10%的热量和活化的FBS。

再次将样品在500倍G和4摄氏度下离心5分钟，然后通过抽吸丢弃上清液并进行红细胞裂解。为了裂解红细胞，将样品重悬于三毫升一个X红细胞裂解溶液中，并在室温下孵育三分钟，然后在样品中加入10毫升PBS以停止反应。丢弃上清液后，以400倍G离心管5分钟，再加入10毫升PBS并重复离心。

将沉淀重悬于一毫升RPMI培养基中，并补充有10%热灭活FBS，然后将细胞内悬浮液通过无菌的70微米细胞过滤器。计数后，细胞将细胞悬浮液的浓度调节到100微升PBS中的1至200万个细胞，然后进行染色和facs分析。子宫第一组ILCs包括常规NK细胞，组织驻留NK细胞和第一组ILCs，其百分比在生命和怀孕期间有所不同。

这些亚群可以使用流式细胞术进行区分，方法是首先对细胞的散射光能力进行门控，然后分离单个可购买的CD 45阳性CD 3阴性CD 19阴性细胞，然后鉴定NK 1.1和NKP 46阳性的第一组ILCs。在第一组ILCs中，CD49A阴性EM阳性是常规NK细胞。CD49A阳性Ems阳性细胞是组织驻留的NK细胞。

而CD49阳性Ems阴性细胞是第一组子宫ILCs。用抗NK P46和抗NK 1.1抗体染色脾脏和子宫淋巴细胞表明，脾淋巴细胞在其表面上表达的NKP 46量高于其子宫对应物。在酶解组织中，表面表位可以根据消化介质中使用的酶而改变。

例如，当使用liberase TM时，MHC CD49 NKG2A受体的染色效果较差。然而，用liberase DH消化可以保留1611抗体克隆对NKG2A的识别。妊娠第8.5天子宫组织样本中存在的第一组ILCs中约有6.5%来自血液。

血液污染物可以通过用与荧光染料偶联的抗CD45抗体进行活体内染色来排除。在设置时间会议时，您必须考虑到老鼠是夜间活动的。因此，它们应该在下午尽可能晚地设置，因为交配将在夜间发生。

此外，在选择雌性时，您必须确保它们没有阴道隔。我们通常进行流式细胞术分析，以观察细胞外部和细胞内的许多蛋白质。我们还进行核酸提取以研究基因表达，包括RNA测序。

我们还设法进行功能测定，以研究子宫先天淋巴细胞的反应。