子宫固有淋巴细胞的分离及其流式细胞术分析

本方法能够评估妊娠与非妊娠动物子宫组织中不同淋巴细胞亚群的组成及其功能特征。该方案可在保持细胞表面蛋白表达、细胞活力和功能性的前提下，实现子宫淋巴细胞的分离，因此适用于多种后续实验应用。

实验初期的胚胎移除及白细胞收集在技术上具有挑战性。由于实验过程较长，一旦进入抗体染色步骤，需格外注意并保持专注。首先，将从怀孕的C57黑鼠雌性小鼠中采集的子宫组织转移至无菌培养皿中，然后使用无菌器械小心去除组织周围的脂肪，注意避免组织干燥。

使用无菌器械分离每个植入部位以取出胎鼠，然后将子宫放回原先的5毫升收集管中，管内含有1毫升收集液。用剪刀将收集管中的组织剪碎，随后将试管置于37摄氏度水浴中。接着向试管中加入3毫升预热的酶消化液混合物。

将离心管在37摄氏度下振荡孵育30分钟，以增强酶消化活性。孵育完成后，涡旋混匀离心管，并将其置于冰上以抑制酶活性，随后将消化后的组织转移至已正确标记的15毫升离心管中。用总共10毫升预冷的含5毫摩尔EDTA的PBS溶液冲洗5毫升收集管，以回收所有残留组织，并将其转移至15毫升离心管中。

将消化后的组织样本在400 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，轻轻弹动沉淀物，然后将其重悬于10毫升预热的含5毫摩尔EDTA的PBS溶液中。为减少细胞聚集，将样本在37°C下振荡孵育，随后高速涡旋振荡10秒。为去除未完全解离组织中的细胞团块，将一个70微米细胞滤网置于无菌的50毫升离心管上，然后用无菌1毫升注射器的推杆将消化后的组织压过滤网进入管中。

用总共10毫升冷PBS多次冲洗滤网以收集所有细胞，然后将50毫升离心管在400 × g条件下离心10分钟。弃去上清液后，可采用方案A或方案B分离固有淋巴细胞。对于方案A，使用移液器将沉淀重悬于5毫升80%等渗Percoll溶液中。然后以慢速用移液器将8毫升40% Percoll溶液小心地叠加到15毫升离心管中已重悬的沉淀上。移液时应缓慢且连续，并将15毫升离心管保持在约45度角。

在不扰动上层液体的情况下，将离心管在室温下以850 × g离心20分钟，使用中等加速度和最小刹车。离心完成后，小心地从离心机中取出离心管，避免扰动各层细胞层。接下来，在不扰动两层细胞溶液界面处的白细胞环的前提下，使用无菌巴斯德吸管弃去上层细胞层中除0.5至1毫升以外的全部液体。

在尽量减少每次吸取的溶液量的同时，小心收集白细胞环，并将细胞转移至一个新的已标记的15毫升离心管中。向细胞中加入10毫升含10%经热灭活处理的胎牛血清（FBS）的无菌RPMI培养基，然后在4°C条件下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，随后进行红细胞裂解。

采用选项B分离细胞时，将消化后的组织经细胞筛过滤，并按前述方法离心获得细胞悬液后，用8毫升35%等渗 Percoll 与RPMI培养基重悬沉淀，将细胞转移至15毫升离心管中。在室温下以940 × g离心10分钟，离心条件为中等加速度和最小刹车。然后使用吸管或移液器小心吸除上清液，再将沉淀用14毫升添加了10%经热灭活的FBS的RPMI培养基重悬。

将样品再次在500 × g、4 °C条件下离心五分钟，然后通过抽吸弃去上清液，接着进行红细胞裂解。为裂解红细胞，将样品重悬于3 mL 1×红细胞裂解液中，在室温下孵育3分钟，然后向样品中加入10 mL PBS以终止反应。弃去上清液后，在400 × g条件下离心5分钟，加入另外10 mL PBS，并重复离心步骤。

将沉淀重悬于1 mL添加了10%热灭活FBS的RPMI培养基中，然后将细胞悬液通过无菌的70 µm细胞滤网。计数细胞后，将细胞悬液浓度调整为每100 µL PBS中含100万至200万个细胞，随后进行染色及流式细胞分析。子宫第一组固有淋巴细胞（ILC）包括传统自然杀伤（NK）细胞、组织驻留NK细胞以及第一组ILC，其比例在生命过程及妊娠期间有所变化。

这些亚群可通过流式细胞术进行区分：首先根据细胞的光散射特性设门，然后分离出单个的、可购买的 CD45 阳性、CD3 阴性、CD19 阴性细胞，再鉴定出 NK1.1 和 NKp46 阳性的第一组固有淋巴细胞（group 1 ILCs）。在第一组固有淋巴细胞中，CD49a 阴性、Eomes 阳性细胞为传统自然杀伤细胞（conventional NK cells）；CD49a 阳性、Eomes 阳性细胞为组织驻留型自然杀伤细胞（tissue resident NK cells）。

CD49阳性而Ems阴性的细胞为第一组子宫ILC细胞。使用抗NKp46和抗NK1.1抗体对脾脏和子宫淋巴细胞进行染色显示，脾脏淋巴细胞表面表达的NKp46水平高于子宫淋巴细胞。在酶法组织解离过程中，消化液中所用酶的种类可能会影响细胞表面表位的完整性。

例如，使用liberase TM时，MHC CD49 NKG2A受体的染色效果较差。然而，使用liberase DH进行消化可保留1611抗体克隆对NKG2A的识别。在妊娠第8.5天的子宫组织样本中，约有6.5%的1型固有淋巴细胞（ILC）来源于血液。

可通过使用与荧光染料偶联的抗CD45抗体进行活体染色来排除血液污染物。在设置交配时间时，必须考虑到小鼠为夜行性动物，因此应尽可能在下午晚些时候进行合笼，因为交配通常发生在夜间。

在选择雌性个体时，也必须确保其没有阴道隔膜。我们通常进行流式细胞术分析，以检测细胞表面及细胞内部的多种蛋白质。我们还进行核酸提取，以研究基因表达，包括RNA测序。

我们还进行了多种功能性实验，以研究子宫固有淋巴细胞的反应。