Name: 分离子宫先天淋巴细胞，用于流式细胞术分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学习从怀孕和非怀孕小鼠子宫组织中分离先天淋巴细胞的方法，用于流式细胞术分析。该方案通过酶解消化和密度梯度离心技术，在保持细胞活力和功能的同时，实现淋巴细胞亚群的精确分型和功能研究。

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感谢此前和当前为此方法的开发提供帮助的团队成员，包括 Jean-Marc Doisne、Norman Shreeve、Iva Filipovic 和 Anita Qualls。本研究由惠康基金会（Wellcome Trust）[资助号 200841/Z/16/Z] 和英国医学研究理事会（MR/P001092/1）资助。为实现开放获取，作者已对本投稿所产生的任何作者接受稿版本应用了知识共享署名（CC BY）公共版权许可。&#160;

本文所述的所有动物实验均根据英国政府内政部颁发的PP2363781号许可证，依照《1986年动物（科学程序）法案》进行。以下方案包含多个部分，从小鼠饲养开始，到FACS分析染色结束。图3展示了该方案的主要步骤。方案中所用材料列于材料表中。
1. 小鼠的一般饲养、交配与解剖
<ol>
	<li>将7-14周龄的雌性小鼠置于特定病原体阴性（SPF）环境中，按每笼4-6只（根据笼具大小和动物体重调整）进行群养，持续10-14天，以诱导Lee-Boot效应，从而实现动情周期的同步化17。</li>
	<li>将种用雄性小鼠置于SPF环境中，单笼饲养，并确保每次交配后至少休息48小时（以保证精子再生）。建议使用3-4月龄、已有成功繁殖记录的成熟种鼠，因其繁殖性能通常优于年轻个体。</li>
	<li>为提高雌鼠受孕几率，可在交配前3天将雄鼠笼内的脏垫料放入雌鼠笼中。此举可通过暴露于雄鼠尿液信息素，触发Whitten效应18，从而实现动情周期同步并增强交配接受性。</li>
	<li>在第0天（D0），按每只种雄配两只雌鼠的比例设置交配组合；预期栓塞率为约20%-25%。 
	注：由于小鼠为夜行性动物，交配通常发生在夜间。</li>
	<li>交配次日早晨（D0.5），检查阴道栓的存在情况，其为交配完成的标志（图4）。阴道栓由雄性精液凝集形成，通常在交配后可持续存在8-24小时。应在清晨尽早检查。</li>
	<li>将发现有阴道栓的雌鼠集中转移至新笼中并做好标记，同时将雄鼠送回原笼休息。</li>
	<li>在交配后第9.5或10.5天（D9.5或D10.5），准备含1 mL无菌HBSS 1x（含Mg2+和Ca2+）的5 mL离心管用于组织采集，并置于冰上备用。</li>
	<li>通过颈椎脱位法实施安乐死，随后进行放血以确认死亡。</li>
	<li>若下游实验要求无菌操作，则应在无菌环境下进行。动物安乐死后立即用70%乙醇擦拭体表，并在超净工作台中使用无菌器械进行解剖。</li>
	<li>剥离妊娠子宫周围的子宫系膜脂肪组织（图5），将完整子宫放入已准备并正确标记的5 mL离心管中，保持管子置于冰上。</li>
</ol>
2. 子宫的机械和酶消化
<ol>
	<li>配制酶消化液：每子宫加入 3 mL 无菌 HBSS 1x 溶液，并添加终浓度为 30 µg/mL 的 DNA 酶和 0.1 Wünsch 单位 (WU)/mL 的 Liberase DH，或 0.52 WU/mL 的 Liberase TM。将溶液置于 37 °C 水浴中预热。 
	注意：Liberase TM 和 Liberase DH 均可使用。选择其中一种应基于其对后续流式细胞术分析中所用抗体识别表位的潜在影响。 
	注意：若使用冻干粉状酶，应在生物安全柜内操作。</li>
	<li>配制 20 mL 含 5 mM EDTA 的 PBS 溶液（不含 Ca2+/Mg2+）。将其中一半溶液置于 37 °C 水浴中预热，另一半置于冰上冷却。</li>
	<li>在超净工作台内，使用无菌器械在无菌培养皿中轻轻去除妊娠子宫周围的脂肪组织。注意避免组织干燥。</li>
	<li>使用无菌器械分离每个着床部位，取出胚胎（呈透明海马状结构，长约 1 mm）（图 6A）。弃去胚胎组织。</li>
	<li>将子宫放回原有的 5 mL 收集管中，直接在 5 mL 管内的收集液中用剪刀剪碎组织。各步骤间始终将收集管置于冰上。</li>
	<li>将含有剪碎组织的 5 mL 管置于 37 °C 水浴中孵育。</li>
	<li>向每个样本中加入 3 mL 预热的酶消化混合液，使管内液体总体积达到 4 mL（含 1 mL 原收集液与剪碎子宫组织，以及 3 mL 酶消化液）。将 5 mL 管在 37 °C 条件下振荡孵育 30 分钟，以增强酶消化活性。</li>
	<li>将 5 mL 管涡旋混匀后立即置于冰上，以抑制酶活性。随后将内容物转移至已正确标记的 15 mL 离心管中。</li>
	<li>使用 10 mL 冰冷的含 5 mM EDTA 的 PBS 溶液冲洗 5 mL 管，确保所有内容物均转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>将含有消化后组织的 15 mL 离心管在 400 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，轻轻弹击管底使沉淀松散，然后用 10 mL 预热至 37 °C 的含 5 mM EDTA 的 PBS 溶液重悬沉淀。</li>
	<li>将样本在 15 mL 离心管中于 37 °C 振荡孵育 15 分钟，以去除残留消化液并减少细胞聚集。</li>
	<li>将样本在高速下涡旋 10 秒，以进一步促进组织解离。</li>
</ol>
3. 将子宫处理成单细胞悬液
<ol>
	<li>使用无菌1 mL注射器的推杆，将消化后的组织通过70 µm细胞筛过滤至已正确标记且无菌的50 mL离心管中，以去除细胞团块和未解离的组织。</li>
	<li>用总共10 mL冷PBS多次冲洗细胞筛，以收集所有细胞。</li>
	<li>将50 mL离心管在400 × g条件下离心10分钟。 
	注意：后续步骤请选择选项A或选项B。与选项B相比，选项A可更有效地富集淋巴细胞，并减少碎片和基质细胞的污染。然而，由于细胞损失较少且样本间细胞得率的变异性较低，选项B可获得更高的免疫细胞得率。此外，选项B在技术操作上更为简便。因此，请根据实际需求选择使用选项A或选项B。
	<ol>
		<li>选项A的操作步骤如下：
		<ol>
			<li>为每个样本标记一个无菌15 mL离心管，每管中加入5 mL用PBS稀释的80% (v/v) 等渗Percoll溶液。</li>
			<li>离心后，弃去50 mL离心管中的上清液。使用移液器将每个沉淀物重悬于8 mL用PBS配制的40% (v/v) 等渗Percoll溶液中。</li>
			<li>以缓慢速度使用移液器，小心地将重悬于40% Percoll溶液中的沉淀物叠加至80% Percoll溶液上层。移液时应缓慢且连续，并将15 mL离心管倾斜约45°角（图6B）。</li>
			<li>在不扰动分层的情况下，将15 mL离心管在室温下以850 × g离心20分钟（中等加速度，最低刹车）。</li>
			<li>小心从离心机中取出离心管，避免扰动Percoll分层（图6C）。</li>
			<li>在不扰动两层Percoll溶液界面处的白细胞环的前提下，使用无菌巴斯德吸管弃去上层Percoll溶液，仅保留约0.5–1 mL。</li>
			<li>在尽量减少吸入Percoll溶液（总量不超过4–5 mL）的同时，小心收集界面处的白细胞环，并将细胞转移至新的已标记15 mL离心管中。</li>
			<li>向每个样本中补加10 mL含10%热灭活FBS的无菌RPMI-1640培养基。</li>
			<li>在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。</li>
			<li>弃去上清液，进行红细胞裂解。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选项B的操作步骤如下：
		<ol>
			<li>为每个样本标记一个无菌15 mL离心管。</li>
			<li>离心后，弃去50 mL离心管中的上清液。使用移液器将每个沉淀物重悬于8 mL用RPMI-1640培养基配制的35% (v/v) 等渗Percoll溶液中。</li>
			<li>将样本转移至15 mL离心管中。</li>
			<li>在室温下以940 × g离心10分钟（中等加速度，最低刹车）。</li>
			<li>使用吸液装置或移液器小心吸走上清液（切勿通过倒置离心管的方式弃液）。</li>
			<li>将沉淀物重悬于14 mL含10%热灭活FBS的RPMI-1640培养基中，随后在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。</li>
			<li>通过吸液方式弃去上清液，进行红细胞裂解。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 红细胞裂解
<ol>
	<li>为裂解红细胞，将样品重悬于 3 mL 1× 红细胞裂解液中，在室温下孵育 3 分钟。</li>
	<li>向样品中加入 10 mL PBS 以终止反应。</li>
	<li>以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 10 mL PBS，并重复步骤 4.3。</li>
	<li>将每份沉淀重悬于 1 mL RPMI-1640 培养基中，该培养基需添加 10% 热灭活的 FBS。</li>
	<li>用无菌的 70 µm 细胞滤网过滤样品。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将细胞悬液浓度调整为每 100 µL PBS 或培养基中含有 100 万至 200 万个细胞。</li>
</ol>
5. 面板设计策略与对照
注意：本文描述的抗体组合适用于在五激光 BD LSRFortessa 仪器上区分 uILC1、trNK 和 cNK 细胞。可根据需要进行微调，以研究不同的细胞群体或使用其他荧光染料。建议根据仪器配置，使用已滴定的抗体以实现最佳分离效果，参考制造商提供的荧光亮度指数，并对表达量较低的抗原（如 NKp46）使用最亮的荧光染料，同时遵循通用实验指南19。建议为 NKp46 设置荧光减一（Fluorescence Minus One, FMO）对照。
6. 先天性淋巴细胞用于FACS表型分析的染色
<ol>
	<li>将每孔100万至200万个细胞转移至圆底96孔板中。</li>
	<li>在4 °C条件下以400 × g离心3分钟，然后将上清液弹入水槽中弃去。</li>
	<li>使用多通道移液器将细胞沉淀重悬于100 µL不含蛋白和叠氮化钠的PBS中。 
	注意：确保后续步骤所用PBS中不含叠氮化钠、Tris或任何蛋白质。</li>
	<li>重复步骤6.2。</li>
	<li>将细胞重悬于50 µL用不含蛋白和叠氮化钠的PBS稀释的可固定活力染料中（1:1,000），在室温避光孵育30分钟。 
	注意：确保PBS中不含叠氮化钠、Tris或FBS、BSA等蛋白质，否则可能导致死细胞染色强度降低和/或活细胞背景染色增强。 
	注意：若活力染料为粉末状，应在通风橱内操作。</li>
	<li>每孔加入150 µL PBS，用多通道移液器重悬细胞，然后重复步骤6.2。</li>
	<li>将细胞重悬于25 µL FACS缓冲液（含1% BSA或2% FBS的PBS）中，并加入Fc受体阻断试剂，在4 °C孵育5分钟。</li>
	<li>加入25 µL表面抗体混合液。 
	注意：每次实验前均应对抗体进行滴定，并优化抗体组合。</li>
	<li>在室温避光孵育样品20分钟。</li>
	<li>每孔加入150 µL FACS缓冲液，充分混匀，然后重复步骤6.2。</li>
	<li>重复步骤6.10。 
	注意：后续步骤请选择选项A或选项B。若仅需对细胞表面标志物染色，请使用选项A；若需通过流式细胞术检测细胞内标志物，请使用选项B。
	<ol>
		<li>选项A的操作步骤如下：
		<ol>
			<li>每孔加入100 µL 4%多聚甲醛（PFA），重悬样品，在室温孵育20分钟。 
			注意：使用PFA时应在通风橱内操作。请参照安全说明书，妥善处理接触过多聚甲醛的废液或物品（如移液器头）。</li>
			<li>重复步骤6.2，共两次。 
			注意：此处含有PFA，不得通过弹入水槽方式弃去。应使用移液器吸取并按照安全说明书规定处理废弃物。</li>
			<li>将样品重悬于200 µL PBS中。</li>
			<li>将样品转移至标记好的FACS管中，并补加100 µL PBS。将FACS管置于冰上或冰箱中，直至进行流式分析。样品应在24小时内上机检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选项B的操作步骤如下：
		<ol>
			<li>每孔加入100 µL固定/破膜溶液（含多聚甲醛），重悬样品，在4 °C孵育20分钟。 
			注意：使用PFA时应在通风橱内操作。请参照安全说明书，妥善处理接触过多聚甲醛的废液或物品（如移液器头）。</li>
			<li>重复步骤6.2。 
			注意：此处含有PFA，不得通过弹入水槽方式弃去。应使用移液器吸取并按照安全说明书规定处理废弃物。</li>
			<li>加入200 µL 1×破膜/洗涤缓冲液，充分混匀，然后重复步骤6.2。</li>
			<li>重复步骤6.11.2.3。</li>
			<li>将固定和破膜后的细胞重悬于50 µL含细胞内染色抗体混合液的1×破膜/洗涤&#160;缓冲液中。</li>
			<li>在4 °C避光孵育30分钟。</li>
			<li>加入200 µL 1×破膜/洗涤溶液，充分混匀，然后重复步骤6.2。</li>
			<li>重复步骤6.11.2.7。</li>
			<li>将样品重悬于200 µL PBS中。</li>
			<li>将样品转移至标记好的FACS管中，并补加100 µL PBS。将FACS管置于冰上或冰箱中，直至进行流式分析。样品应在24小时内上机检测。 
			注意：完成本方案后，蜕膜细胞悬液即可用于FACS分析。建议尽可能采集更多事件数；为获得可靠结果，每个样本的亲代细胞群至少应获取1,000–3,000个事件。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+code+of+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological code of pregnancy.</a> Science. 365 (6456), New York, N.Y. 862-863 (2019).</li>
<li>Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+immunological+and+microbial+aspects+of+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">The unique immunological and microbial aspects of pregnancy.</a> Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).</li>
<li>Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCroy%2C+A+%22The+Guide+to+Investigation+of+Mouse+Pregnancy%22">The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy</a>. , Elsevier, Academic Press. (2014).</li>
<li>Filipovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definition+of+group+1+innate+lymphoid+cells+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus.</a> Nature Communications. 9 (1), 4492(2018).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DBA-lectin+reactivity+defines+mouse+uterine+natural+killer+cell+subsets+with+biased+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression.</a> Biology of Reproduction. 87 (4), 81(2012).</li>
<li>Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells%3A+active+regulators+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).</li>
<li>Gaynor, L. M., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%3A+Functional+distinctions+and+influence+on+pregnancy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice.</a> Frontiers in Immunology. 8, 467(2017).</li>
<li>Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells.</a> Frontiers in immunology. 10, 960(2019).</li>
<li>Wilkens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells+regulate+endometrial+bleeding+in+women+and+are+suppressed+by+the+progesterone+receptor+modulator+asoprisnil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil.</a> The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).</li>
<li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+%CE%B3+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification%2C+decidual+integrity%2C+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li>
<li>Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+direct+hemochorial+placentation+by+regulating+hypoxia-inducible+factor+dependent+trophoblast+lineage+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).</li>
<li>Crespo, ÂC., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+NK+cells+transfer+granulysin+to+selectively+kill+bacteria+in+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts.</a> Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).</li>
<li>Shmeleva, E. V., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+natural+killer+cells+at+the+intersection+between+reproduction+and+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity.</a> Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).</li>
<li>Kather, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neither+lymphotoxin+alpha+nor+lymphotoxin+beta+receptor+expression+is+required+for+biogenesis+of+lymphoid+aggregates+or+differentiation+of+natural+killer+cells+in+the+pregnant+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus.</a> Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).</li>
<li>Croy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).</li>
<li>Vander lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+et+Pharmacologica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta Physiologica et Pharmacologica Neerlandica. 5 (2), 213-215 (1956).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Licensing+of+natural+killer+cells+by+host+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules.</a> Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).</li>
<li>Doisne, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition%2C+development%2C+and+function+of+uterine+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells.</a> Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).</li>
<li>Peel, S. Fate of GMG Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeel%2C+S+%22Granulated+Metrial+Gland+Cells+Advances+in+Anatomy%2C+Embryology+and+Cell+Biology%22">Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology</a>. 115, Springer. Berlin. (1989).</li>
<li>Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%3A+a+specialized+differentiation+regulated+by+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones.</a> Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).</li>
<li>Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+receptor+repertoire+in+mouse+uterine+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells.</a> Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法包含若干关键步骤，将在下文进行讨论。第一个关键步骤是获得多个同步妊娠的个体，因为白细胞群体的相对频率会随着妊娠进程而变化。拥有相同妊娠天数的多只母鼠，可为同一实验提供生物学重复，或允许将来自各只母鼠的淋巴细胞合并，以获得下游应用所需的足够细胞数量。通过定时交配，研究人员可将受孕时间精确到24小时之内。尽管小鼠寿命约为2.5年，但其繁殖期通常从4至7周龄开始，持续至6至8月龄。由于较年轻的雌鼠通常产仔较少，因此一般在雌鼠达到6至8周龄、雄鼠达到8至10周龄时才开始交配。小鼠的动情期约持续15小时，每4至5天出现一次，典型的交配成功率（通过观察阴道栓判断，见图4）约为25%。因此，使用处于动情期的小鼠并预先规划足够的数量，对于获得特定实验所需的母鼠数量至关重要。动情周期的阶段可通过阴道涂片细胞学方法确定22。可通过在交配前使雄鼠休息48小时，以及利用惠滕效应（Whitten effect）18来提高阴道栓形成率。另一种方法是注射孕马血清，该血清可模拟内源性促卵泡激素的作用，促进卵母细胞成熟；42至50小时后，再注射人绒毛膜促性腺激素，以模拟内源性黄体生成素的作用，诱导排卵。这种激素处理方法可绕过对动情期的依赖，使几乎所有经处理的雌鼠均能接受交配。
第二个关键步骤是确保FACS染色的质量。流式细胞术中使用的抗体必须始终进行滴定，并在最佳浓度下使用，同时有必要确认酶消化不会切割关键的抗原表位。为了评估某种酶是否会切割特定表位，可以将同一样本分为两部分平行染色，其中一部分进行酶消化，另一部分进行机械消化。同样，使用适当的对照和单染样本对于获得可靠的数据至关重要。对于稀有事件，可使用微珠来制备单染样本。建议不要使用微珠来设定电压，而应使用包含淋巴细胞及其他白细胞（如脾细胞）的细胞群体。如果使用微珠，则必须对抗体进行滴定，以使染色后微珠的荧光强度与细胞的荧光强度相当。当难以区分某一特定标记物的阳性与阴性细胞时，也可使用FMO对照来辅助该标记物的设门。对于细胞内标记物，必须使用同型对照&#160;，因为细胞内染色可能导致未结合的残余抗体在洗涤步骤后仍保留在细胞内，从而增加背景信号。建议在细胞固定后的24小时内完成样本检测，以在FACS分析中获得最佳的表型结果，因为自发荧光会随时间显著增强，且某些抗体的荧光强度也可能随时间下降。
另一个需要考虑的关键因素是使用本方案获得的单细胞悬液的下游应用。对于功能检测，必须在无菌条件下操作。同样，对于后续的组学研究，必须在无菌以及无RNase、无DNase和无蛋白酶的环境中操作。
本文所述方案主要针对1型固有淋巴细胞（group 1 ILCs）的表型分析，但通过调整抗体组合，也可适用于其他细胞类型的表型分析。建议所有抗体均需在经酶消化和未经酶消化的细胞悬液中进行测试，以检测酶处理是否导致表面表位的丢失或改变。同样，可使用不同的酶进行组织消化以提高细胞得率，但必须仔细评估其对关键抗原表位的影响。尽管NKp46是脾脏自然杀伤（NK）细胞的良好标志物，且在所有实验室小鼠品系中均适用，但在C57BL/6小鼠中，子宫NK（uNK）细胞上的NKp46表达水平显著低于脾脏NK细胞。因此，最好同时对NK1.1和NKp46进行染色。若需直接比较多个器官，建议对所有样本采用相同的处理方式，即使对于脾脏或骨髓等无需酶消化的组织也应如此。尽管本方案适用于非妊娠子宫，但通过两相Percoll梯度分离淋巴细胞环将具有挑战性，且所获得的细胞数量可能过低，难以进行可靠的流式细胞术（FACS）分析，因此需要汇集来自多只非妊娠小鼠子宫的细胞23。
在解读数据时，需考虑本方案存在的一些局限性。与所有组织相同，来自血液的循环淋巴细胞将与组织驻留细胞一同被分离出来。如果数据解读要求排除循环淋巴细胞，可进行活体染色以标记循环细胞。此外，本方案的另一局限性在于部分细胞会丢失，因为并非所有细胞都能从组织中完全提取出来。最常见的问题及其解决方案见表2。
历史上，对组织中细胞的研究依赖于对组织切片的组织学检查。Sandra Peel 的优秀综述24总结了从100多年前直至20世纪80年代末所开展的研究工作。事实上，在淋巴细胞被发现之前半个多世纪发表的文献中，就已出现了后来被称为uNK细胞的细胞描述。因此，在1975年NK细胞被发现之前，这些uNK细胞曾被标记为母源性糖原细胞或颗粒状蜕膜腺细胞。Anne Croy 在该领域做出了重要贡献25，并慷慨地向研究团队传授了她所优化的解剖技术3，该技术至今仍在使用。尽管传统的组织学检查对于描述uNK细胞的形态和组织定位具有重要作用，但其仅能检测少数几种目标细胞标志物。2008年，一种基于流式细胞术的方法被报道，可同时检测子宫淋巴细胞上的多种标志物26，这本质上就是本文所描述的方法。近年来的技术，如空间转录组学和质谱流式成像，结合了组织学与流式细胞术的优势，分别实现了多个基因或蛋白质的同时检测，并保留了正常的组织结构架构。
本文所述方法具有多种应用，包括FACS表型分析、功能检测（如ELISPOT、脱颗粒或细胞毒性检测）、细胞分选以及后续的转录组学或蛋白质组学分析。基于该方法可进一步开发的应用包括在细胞分选或通过阴性耗竭富集后，对蜕膜NK细胞进行培养与扩增。目前尚无能够长期维持小鼠子宫NK（uNK）细胞活力和功能的培养扩增方案，而人类NK细胞则可通过添加IL-2或联合使用IL-12与IL-15实现7至14天的体外培养与扩增。若能优化适用于小鼠uNK细胞的此类培养方法，将为开展功能检测提供更多实验灵活性，并允许在更高细胞数量条件下测试多种实验条件。然而，已知培养条件可能改变淋巴细胞独特的表型，也可能影响其功能。

本文介绍一种从单个妊娠子宫中高效获取子宫固有淋巴细胞的简单方法。该方法可保持子宫固有淋巴细胞表面蛋白的表达及其功能活性，适用于后续多种实验应用，如流式细胞术表型分析、RNA测序、蛋白质组学或功能检测。本文重点介绍通过流式细胞术对第1组子宫固有淋巴细胞（uILCs）进行表型分析。
子宫由三层组成：内膜、肌层和浆膜（图1）。内膜是黏膜，衬于子宫腔内。由黄体产生的孕酮可将内膜转化为蜕膜。肌层由两层平滑肌构成，组成了子宫壁。浆膜为包裹子宫的浆膜层，并通过称为子宫阔韧带（mesometrium）的结构与腹膜相连。在子宫的横切面上，远离腔的一侧称为阔韧带侧（mesometrial side），靠近腔的一侧则称为对阔韧带侧（anti-mesometrial side）。多种母体白细胞分布于内膜和蜕膜中，包括多种类型的细胞，其中以固有免疫细胞占绝大多数。固有淋巴样细胞（ILCs）、巨噬细胞、树突状细胞（DC）、CD4+ 和 CD8+ T 淋巴细胞、调节性T细胞（Tregs）以及少量B细胞，均可能在妊娠期间子宫微环境的调控中发挥重要作用1,2。在小鼠中，子宫内的ILCs不仅存在于黏膜层，也存在于肌层。包括所有三类ILCs在内，子宫确实是固有淋巴样细胞第1组（group 1 ILCs）密度最高的器官。随着妊娠过程中子宫组织的结构重塑，子宫内白细胞的数量和比例也随之发生变化（参见 图2A 中关于第1组子宫ILC亚群百分比变化的示例）3,4。
本文中提到的小鼠均指近交系实验小鼠中的 C57BL/6 品系。远交系小鼠（如 NMRI 小鼠）由于繁殖率高，常被用于生殖研究。然而，为了获得一致的实验结果，必须使用近交系小鼠，而免疫学研究中最常用的遗传背景是 C57BL/6，也称为 B6。
在妊娠中期的B6品系母鼠中，约有30%的子宫白细胞为g1类子宫固有淋巴细胞（uILC），通过流式细胞术可将其定义为活的CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+细胞（图2B），包括促血管生成的组织驻留型NK细胞（trNK）、产生干扰素-γ（IFN-γ）的传统NK细胞（cNK）以及uILC14,5。在人类中，子宫NK细胞（uNK）的比例更高，在妊娠早期可达约70%6。人类与小鼠的uNK及uILC之间相似之处多于差异7,8。尽管需要注意两者之间的差异，但整合来自两种物种的信息仍具有重要意义。当结合人类与实验啮齿类动物中关于uILC的研究结果时，可以明确的是，NK细胞有助于实现对子宫生物学至关重要的稳态变化，包括维持动脉完整性9和螺旋动脉重塑10，以及促进滋养层细胞侵袭11,12。此外，它们还在抵御病原体方面发挥特定作用13,14。在小鼠和大鼠中，除了在着床部位周围的蜕膜中大量存在外，NK细胞还会暂时聚集于母体子宫肌层的两层肌肉之间，形成一种称为妊娠期子宫系膜淋巴细胞聚集体（MLAp）的结构15（图1B），该结构过去也被称为蜕膜腺，其具体功能尚待阐明。
本文详细描述了一种在实验室中用于从妊娠小鼠子宫中分离淋巴细胞的方法，该方法结合了机械性解离和酶消化。由于该方法使用整个子宫，因此在妊娠期间分离得到的子宫淋巴细胞是蜕膜和肌层细胞的混合物。进一步将蜕膜从子宫壁及其MLAp中分离是可行的，此前已有相关描述16。本文所述方法的开发旨在获取子宫淋巴细胞的同时，保持细胞表面蛋白的表达、细胞功能及活性。最终获得的是单细胞悬液，细胞碎片残留极少，在妊娠中期（10.5天）每只妊娠子宫通常可获得100万至500万个细胞。该方法的应用包括通过流式细胞术进行表型分析、后续转录组或蛋白质组研究所需的细胞分选，以及细胞内细胞因子产生、脱颗粒、ELISPOT或细胞毒性检测等功能性研究。本文所述方案主要聚焦于鉴定1型固有淋巴样细胞（group 1 ILCs），但通过微调流式细胞分析所用的抗体组合，也可适用于其他细胞类型，如其他固有淋巴样细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞（DC）或巨噬细胞。该方案还可用于从其他组织中分离细胞，或用于合并非妊娠子宫样本的细胞分离。

<table><tbody><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CD19 抗体</td><td>BD</td><td>562701</td><td></td></tr><tr><td>CD3 抗体</td><td>BD</td><td>562600</td><td></td></tr><tr><td>CD45 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td></td></tr><tr><td>CD49a 抗体</td><td>BD</td><td>740262</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche (Sigma)</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>EOMES 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-4875-82</td><td></td></tr><tr><td>Fc 阻断剂 Trustain fcx</td><td>BioLegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10217-106</td><td></td></tr><tr><td>Fix/Perm 缓冲液（BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化试剂盒组分）</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，含钙、含镁、无酚红</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche (Sigma)</td><td>5401089001</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液 Pharmlyse</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1 抗体</td><td>BioLegend</td><td>108739</td><td></td></tr><tr><td>NKp46&amp;nbsp; 抗体</td><td>BioLegend</td><td>137608</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛溶液（无甲醇）</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1026</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14030-048</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x（无 Ca²⁺ 或 Mg²⁺）</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR international</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 培养基 + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet 可固定活力染料</td><td>BioLegend</td><td>423113</td><td></td></tr></tbody></table>

子宫固有淋巴细胞的分离及其流式细胞术分析

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

本文介绍了一种通过流式细胞术从单个妊娠小鼠子宫中分离并表型分析第一组固有淋巴细胞（g1 uILCs）的简便方法。该方案详细描述了如何设置定时交配以获得多只同步妊娠的母鼠，妊娠子宫的机械和酶解消化过程，单细胞悬液的染色步骤，以及用于表型鉴定和区分g1 uILCs的FACS策略。尽管该方法不可避免地丢失了细胞在组织内分布的空间信息，但已成功应用于研究uILCs的异质性、其对影响妊娠的母体和胎儿因素的响应、基因表达谱及其功能。

为获得子宫白细胞的单细胞悬液，该方法的主要步骤如图3所示。在图2B中展示了用于鉴定B6小鼠中三群1型固有淋巴细胞（g1 ILCs）的基本FACS设门策略：uILC1（CD49a+Eomes-）、trNK（CD49a+Eomes+）和cNK（CD49a-Eomes+）细胞。可对这些细胞群体进行进一步分析，以研究g1 ILCs的多种表面及细胞内标志物。例如，可在使用抗NK1.1抗体刺激后，检测uILC1、trNK和cNK细胞中IFN-ɣ与自身MHC受体的共表达情况（图7）。
根据研究问题的不同，该方案（图3）和抗体组合均可进行调整。重要的是，建议在g1 ILC设门的FACS分析中同时使用抗NK1.1和抗NKp46抗体（图2B 和 Table 1）。需要注意的是，来源于血液、脾脏或肝脏的g1 ILC表面NKp46的表达水平高于子宫来源的g1 ILC（图8）。而NK1.1的表面染色可提供更好的区分效果，使子宫g1 ILC更容易设门（图8）。虽然NKp46在所有小鼠品系中均有表达，但抗NK1.1抗体PK136所识别的NKR-P1C抗原仅表达于部分小鼠品系，包括C57BL/6（即B6）、FVB/N和NZB，而在AKR、BALB/c、CBA/J、C3H、DBA/1、DBA/2、NOD、SJL或129品系中不表达。此外，如果研究人员计划研究关键的NK细胞受体（如MHC受体Ly49），则需注意实验室小鼠品系中存在的等位基因变异，这些变异重现了人类杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）的高度多态性。另外，如果需要使用NK1.1进行细胞刺激以开展功能性实验（如Kim, S. 等人20所述），建议使用抗NKp46抗体而非抗NK1.1抗体对细胞进行染色，因为交联型抗NK1.1抗体可能占据NKR-P1C抗原表位，或刺激后导致受体下调。无论是受体占据还是下调，都会阻碍使用相同抗体进行后续染色。
酶法组织解离常见的问题是消化介质中使用的酶会改变细胞表面表位。例如，若使用Liberase TM，则对MHC CD94:NKG2A受体的染色效果较差。然而，使用Liberase DH进行消化可保留16A11抗体克隆对NKG2A的识别能力（图9）。建议在流式细胞分析（FACS）所用抗体组合中，逐一检测各种酶对所有表位的影响。为此，可采用机械法解离获得的小鼠脾细胞悬液（将完整脾脏通过70 µm细胞筛）；将样品均分为两份或多份，分别在含酶或不含酶的培养基中孵育。
如前所述，妊娠第8.5天子宫组织样本中的g1 ILCs约有6.5%来源于血液。若需要排除血液来源的细胞，可采用Masopust实验室开发的血管内染色法21。图10展示了这一结果。用于血管内染色的抗CD45抗体可偶联至“废弃通道”（dump-channel）所用的荧光染料，从而在不占用额外荧光通道的情况下排除血液污染细胞。表2列出了常见问题及其解决方案。
<img alt="小鼠子宫横切面示意图；胚胎发育阶段；免疫细胞存在情况" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1小鼠子宫横切面。 (A小鼠子宫横切面（非妊娠期），显示定植于子宫内的多种母体白细胞. (B) 小鼠子宫横切面（妊娠第8.5天）。(C小鼠子宫横切面（妊娠第13.5天）。D) 小鼠与人类从胚泡阶段开始的胎盘形成过程比较。图片使用 BioRender.com 创建。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="谱系分化、图表、流式细胞术、NK细胞、ILC1、组织驻留NK细胞、年龄-妊娠分析、免疫学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：子宫g1 ILC1的亚群。 （A）小鼠在生命早期及妊娠期间子宫cNK、ILC1和trNK的比例。W - 周，gd - 妊娠天数。改编自Filipovic, I. 等人4的图表。（B）通过流式细胞术分析子宫第1组ILC亚群的设门策略。在妊娠第10.5天从小鼠子宫组织中分离淋巴细胞。使用含Liberase TM的消化液进行组织消化。根据细胞的光散射特性进行设门。通过FSC-A与FSC-H散点图排除双联体，仅进一步分析CD45+CD3-CD19-的活细胞。在CD45+CD3-CD19-活细胞中，将NK1.1+NKp46+细胞定义为第1组ILC。在第1组ILC中可区分出三个亚群：CD49a-Eomes+传统NK细胞（cNK）、CD49a+Eomes+组织驻留NK细胞（trNK）以及CD49a+Eomes-子宫ILC1（uILC1）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="从小鼠组织中分离细胞的实验流程图；包括酶消化、离心和FACS分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：实验方案主要步骤的示意图。（1）剥离妊娠子宫上的系膜脂肪组织。（2）移除胎儿；将子宫放回5 mL离心管中并剪碎组织。随后进行酶消化步骤：向每个样品中加入3 mL预热的酶消化液。将5 mL离心管在37 °C下振荡孵育30分钟。（3）（i）消化完成后，用10 mL冰上预冷的含5 mM EDTA的PBS溶液将5 mL离心管中的全部内容物冲洗至15 mL离心管中。（ii）将含有消化后组织的15 mL离心管在400 × g条件下离心10分钟。（iii）弃去上清液；轻轻弹击沉淀，用10 mL预热（37 °C）的含5 mM EDTA的PBS溶液重悬。（iv）将样品在15 mL离心管中于37 °C振荡孵育15分钟。（4）使用无菌1 mL注射器的推杆，将消化后的组织通过70 µm细胞筛滤入正确标记且无菌的50 mL离心管中，随后在400 × g条件下离心10分钟。（5）离心后，选择进行选项A（图中所示）或选项B。选项A：弃去50 mL离心管中的上清液，使用移液器将每份沉淀重悬于8 mL含40%（v/v）等渗Percoll的PBS溶液中。（6）（i）选项A继续：以低速使用移液器，小心地将重悬于40% Percoll溶液中的沉淀叠加至含有5 mL 80% Percoll溶液的15 mL离心管中。移液过程应缓慢且连续，并将15 mL离心管倾斜约45°角。（ii）在不扰动分层的前提下，将15 mL离心管在室温下以850 × g离心20分钟，采用中等加速度和慢速刹车。（7）离心后，小心收集白细胞环状层，尽量减少Percoll溶液的吸取量（总计不超过4–5 mL）。（8）进行红细胞裂解步骤。（9）使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数。（10）将每孔100万至200万个细胞转移至圆底96孔板中。（11）进行活率染料和抗体染色。（12）最后，将样品转移至标记好的FACS管中。在24小时内进行FACS分析前，将FACS管置于冰上或冰箱中保存。图像由BioRender.com绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig3v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="啮齿类动物皮肤炎症反应的比较，图A显示脓疱形成，图B显示愈合过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：C57BL/6雌性小鼠在交配后0.5天时存在（A）和缺失（B）阴道栓的情况。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="展示动物腹腔暴露手术步骤的解剖过程，科学实验操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：从小鼠体内解剖取出子宫。（A）将孕鼠用针固定在软质解剖板上，并用70%乙醇擦拭体表。沿蓝色虚线所示位置做两条纵向切口。（B）提起皮肤以暴露内脏器官，轻轻上推肠管以显露子宫。（C）在三个位置进行剪切以取下子宫：两处分别位于卵巢附近和宫颈处，如两条蓝色虚线和蓝色箭头所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="培养皿中分离的胚胎，Percoll梯度离心管，淋巴细胞分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：单细胞悬液的制备。（A）从着床部位机械分离胚胎。（B）Percoll梯度叠加；上层为含单细胞悬液的40% Percoll，下层为80% Percoll。（C）Percoll梯度离心后淋巴细胞环的形成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="分析NK细胞亚群中α-NK1.1、IFN-γ与CD107a标志物的流式细胞术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：第1组固有淋巴细胞（ILC）功能实验的代表性FACS分析。 在妊娠第9.5天从小鼠子宫组织中分离细胞，经Liberase DH消化液消化组织后，通过板结合抗体交联NK1.1刺激，检测表达识别自身MHC的NK受体（Ly49C、Ly49I和NKG2A）与不表达此类受体的第1组ILC中胞内IFN-ɣ和表面CD107a的表达情况。图中显示四个象限（角）的原始数值，以及表达自身受体的细胞中应答者与无自身受体的细胞中应答者的相对百分比（加粗数字）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示脾脏和子宫中自然杀伤细胞活性的流式细胞术直方图；数据分析比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 8"> 
图8：使用抗NKp46和抗NK1.1抗体对脾脏和子宫淋巴细胞进行染色。（A）从小鼠脾脏获得的细胞悬液和（B）妊娠第10.5天的子宫细胞悬液被分为两部分；一部分用NKp46-APC（红色）染色，另一部分用NK1.1-APC（蓝色）染色。注意，子宫淋巴细胞的NKp46染色在区分NKp46+和NKp46-细胞方面不如脾脏淋巴细胞清晰。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="消化酶处理对NKG2A表达影响的流式细胞术图谱：无酶、Liberase DH和Liberase TM处理组对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图9"> 
图9：经消化液孵育后NKG2A MFI（抗体克隆号：16A11）下降。 将C56BL/6小鼠脾细胞悬液分为三部分。其中一部分在Liberase DH消化液（含0.13 WU/mL Liberase DH和30 µg/mL DNA酶的HBSS）中孵育，另一部分在Liberase TM消化液（含0.52 WU/mL Liberase TM和30 µg/mL DNA酶的HBSS）中孵育。第三部分用纯HBSS在37 °C孵育30分钟。通过流式细胞术检测g1 ILCs上NKG2A标志物的表达。本图引自Shreeve N. 《子宫自然杀伤细胞抑制在妊娠中的作用》（学位论文）；导师：Colucci F，2020年。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；CD45-BUV395 与 CD45-AF647；子宫 g1 ILCs、血液、胸腺淋巴细胞" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62670/62670fig10.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图10"> 
图10：使用抗 CD45 抗体进行活体染色以排除血液来源的 g1 ILCs。 一只妊娠8.5天的C57BL/6雌性小鼠在静脉注射后3分钟被处死 3 µg CD45-AF647。采集子宫、全血和胸腺并制备用于FACS分析。X轴显示静脉内染色CD45-AF647的信号，Y轴显示信号来自 体外 染色CD45-BUV395。各亚群百分比显示于象限中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62670/62670fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>抗体 / 染料</td>
			<td>克隆号</td>
			<td>荧光素</td>
			<td>激光器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">1（倾弃通道）</td>
			<td>Zombie Violet Fixable Viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td rowspan="3">Violet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>1D3</td>
			<td>BV421</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>145-2C11</td>
			<td>BV421</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>CD45</td>
			<td>30-F11</td>
			<td>FITC</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>NK1.1</td>
			<td>PK136</td>
			<td>BV605</td>
			<td>Violet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>NKp46</td>
			<td>29A1.4</td>
			<td>APC</td>
			<td>Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>CD49a</td>
			<td>Ha31/8</td>
			<td>BUV395</td>
			<td>Ultraviolet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>EOMES</td>
			<td>Dan11mag</td>
			<td>PE</td>
			<td>Green</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于常规五激光流式细胞仪的FACS检测 panel 示例。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>问题</td>
			<td>可能原因</td>
			<td>建议</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">在两种 Percoll 溶液的界面处不可见细胞环</td>
			<td>Percoll 溶液分层效果差，或在样品操作过程中两种溶液层发生混合</td>
			<td>在叠加溶液时需格外小心，避免破坏80% Percoll垫层。操作样品时应注意：不要扰动Percoll界面</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>白细胞数量较少（例如使用未妊娠子宫时）</td>
			<td>即使界面处细胞数量非常少，也可能观察到界面。即使不可见细胞环，也应收集40%与80% Percoll溶液之间的液体，因为其中可能仍含有足够数量的细胞用于后续处理</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">红细胞裂解不完全</td>
			<td>细胞在裂解缓冲液中未充分重悬</td>
			<td>用移液器反复吹打细胞，以打散细胞团块并充分重悬于裂解缓冲液中</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>裂解液温度过低</td>
			<td>使用前将裂解液平衡至室温</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>可延长与裂解液孵育的时间至15分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>红细胞裂解步骤可重复进行</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">细胞得率低</td>
			<td>酶消化效果不佳</td>
			<td>检查所用酶是否过期，并确认其储存条件符合说明书要求</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤步骤中细胞丢失</td>
			<td>每次洗涤后检查细胞沉淀：离心后观察孔板底部是否可见不透明的细胞沉淀。使用V型底而非U型底板、使用摆动转子离心机、延长离心时间等措施可减少细胞丢失</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织样本中淋巴细胞数量较少（例如使用未妊娠子宫时）</td>
			<td>可合并多个子宫样本以获得足够的细胞事件数用于分析。可考虑采用本方案中的选项B进行细胞分离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>同一组小鼠获得的绝对白细胞数量变异较大</td>
			<td>在40%与80% Percoll溶液界面处收集细胞的操作不一致</td>
			<td>确保完整收集Percoll界面处的全部细胞组分。可考虑采用本方案中的选项B进行细胞分离</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无法检测到预期的淋巴细胞亚群/标记物，或某些细胞表面标记物的MFI异常偏低</td>
			<td>酶消化影响了某些表位的表面表达或导致其降解</td>
			<td>通过调整酶的种类（例如更换不同类型的Liberase或胶原酶）、孵育时间或酶浓度来优化酶消化条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>流式细胞仪中背景噪音过高</td>
			<td>细胞碎片比例较高或存在红细胞污染</td>
			<td>调整FSC阈值参数。可考虑采用本方案中的选项A进行细胞分离</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：故障排除指南。

这是一种从妊娠和非妊娠小鼠中分离子宫淋巴样细胞的方法。该方法可用于多种下游应用，如流式细胞术表型分析、细胞分选、功能检测、RNA测序和蛋白质组学。本方案展示了如何通过流式细胞术对子宫第一组天然淋巴细胞进行表型分析。

本文介绍了一种简单的方法，通过流式细胞术从单个妊娠期小鼠子宫中分离并表型分析第一组子宫固有淋巴细胞（g1 uILCs）。

本方法能够评估妊娠与非妊娠动物子宫组织中不同淋巴细胞亚群的组成及其功能特征。该方案可在保持细胞表面蛋白表达、细胞活力和功能性的前提下，实现子宫淋巴细胞的分离，因此适用于多种后续实验应用。实验初期的胚胎移除及白细胞收集在技术上具有挑战性。由于实验过程较长，一旦进入抗体染色步骤，需格外注意并保持专注。首先，将从怀孕的C57黑鼠雌性小鼠中采集的子宫组织转移至无菌培养皿中，然后使用无菌器械小心去除组织周围的脂肪，注意避免组织干燥。使用无菌器械分离每个植入部位以取出胎鼠，然后将子宫放回原先的5毫升收集管中，管内含有1毫升收集液。用剪刀将收集管中的组织剪碎，随后将试管置于37摄氏度水浴中。接着向试管中加入3毫升预热的酶消化液混合物。将离心管在37摄氏度下振荡孵育30分钟，以增强酶消化活性。孵育完成后，涡旋混匀离心管，并将其置于冰上以抑制酶活性，随后将消化后的组织转移至已正确标记的15毫升离心管中。用总共10毫升预冷的含5毫摩尔EDTA的PBS溶液冲洗5毫升收集管，以回收所有残留组织，并将其转移至15毫升离心管中。将消化后的组织样本在400 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，轻轻弹动沉淀物，然后将其重悬于10毫升预热的含5毫摩尔EDTA的PBS溶液中。为减少细胞聚集，将样本在37°C下振荡孵育，随后高速涡旋振荡10秒。为去除未完全解离组织中的细胞团块，将一个70微米细胞滤网置于无菌的50毫升离心管上，然后用无菌1毫升注射器的推杆将消化后的组织压过滤网进入管中。用总共10毫升冷PBS多次冲洗滤网以收集所有细胞，然后将50毫升离心管在400 × g条件下离心10分钟。弃去上清液后，可采用方案A或方案B分离固有淋巴细胞。对于方案A，使用移液器将沉淀重悬于5毫升80%等渗Percoll溶液中。然后以慢速用移液器将8毫升40% Percoll溶液小心地叠加到15毫升离心管中已重悬的沉淀上。移液时应缓慢且连续，并将15毫升离心管保持在约45度角。在不扰动上层液体的情况下，将离心管在室温下以850 × g离心20分钟，使用中等加速度和最小刹车。离心完成后，小心地从离心机中取出离心管，避免扰动各层细胞层。接下来，在不扰动两层细胞溶液界面处的白细胞环的前提下，使用无菌巴斯德吸管弃去上层细胞层中除0.5至1毫升以外的全部液体。在尽量减少每次吸取的溶液量的同时，小心收集白细胞环，并将细胞转移至一个新的已标记的15毫升离心管中。向细胞中加入10毫升含10%经热灭活处理的胎牛血清（FBS）的无菌RPMI培养基，然后在4°C条件下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，随后进行红细胞裂解。采用选项B分离细胞时，将消化后的组织经细胞筛过滤，并按前述方法离心获得细胞悬液后，用8毫升35%等渗 Percoll 与RPMI培养基重悬沉淀，将细胞转移至15毫升离心管中。在室温下以940 × g离心10分钟，离心条件为中等加速度和最小刹车。然后使用吸管或移液器小心吸除上清液，再将沉淀用14毫升添加了10%经热灭活的FBS的RPMI培养基重悬。将样品再次在500 × g、4 °C条件下离心五分钟，然后通过抽吸弃去上清液，接着进行红细胞裂解。为裂解红细胞，将样品重悬于3 mL 1×红细胞裂解液中，在室温下孵育3分钟，然后向样品中加入10 mL PBS以终止反应。弃去上清液后，在400 × g条件下离心5分钟，加入另外10 mL PBS，并重复离心步骤。将沉淀重悬于1 mL添加了10%热灭活FBS的RPMI培养基中，然后将细胞悬液通过无菌的70 µm细胞滤网。计数细胞后，将细胞悬液浓度调整为每100 µL PBS中含100万至200万个细胞，随后进行染色及流式细胞分析。子宫第一组固有淋巴细胞（ILC）包括传统自然杀伤（NK）细胞、组织驻留NK细胞以及第一组ILC，其比例在生命过程及妊娠期间有所变化。这些亚群可通过流式细胞术进行区分：首先根据细胞的光散射特性设门，然后分离出单个的、可购买的 CD45 阳性、CD3 阴性、CD19 阴性细胞，再鉴定出 NK1.1 和 NKp46 阳性的第一组固有淋巴细胞（group 1 ILCs）。在第一组固有淋巴细胞中，CD49a 阴性、Eomes 阳性细胞为传统自然杀伤细胞（conventional NK cells）；CD49a 阳性、Eomes 阳性细胞为组织驻留型自然杀伤细胞（tissue resident NK cells）。CD49阳性而Ems阴性的细胞为第一组子宫ILC细胞。使用抗NKp46和抗NK1.1抗体对脾脏和子宫淋巴细胞进行染色显示，脾脏淋巴细胞表面表达的NKp46水平高于子宫淋巴细胞。在酶法组织解离过程中，消化液中所用酶的种类可能会影响细胞表面表位的完整性。例如，使用liberase TM时，MHC CD49 NKG2A受体的染色效果较差。然而，使用liberase DH进行消化可保留1611抗体克隆对NKG2A的识别。在妊娠第8.5天的子宫组织样本中，约有6.5%的1型固有淋巴细胞（ILC）来源于血液。可通过使用与荧光染料偶联的抗CD45抗体进行活体染色来排除血液污染物。在设置交配时间时，必须考虑到小鼠为夜行性动物，因此应尽可能在下午晚些时候进行合笼，因为交配通常发生在夜间。在选择雌性个体时，也必须确保其没有阴道隔膜。我们通常进行流式细胞术分析，以检测细胞表面及细胞内部的多种蛋白质。我们还进行核酸提取，以研究基因表达，包括RNA测序。我们还进行了多种功能性实验，以研究子宫固有淋巴细胞的反应。

isolation-uterine-innate-lymphoid-cells-for-analysis-flow

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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