建立高通量筛选调控c-di-GMP信号通路小分子的实验体系 铜绿假单胞菌

本实验的总体目标是通过高通量生物报告系统筛选，鉴定能够调节机会性病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）细胞内第二信使环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）水平的小分子化合物。该方法有助于发现通过调节环二鸟苷酸水平来干扰铜绿假单胞菌生物被膜形成及其他相关过程的小分子物质。该技术的主要优势在于其高度的稳健性和通用性，可在48小时内完成对超过3,500种化合物的筛选。

该技术的应用前景包括开发新型治疗方法，这些方法可能使铜绿假单胞菌对免疫系统或现有抗生素更加敏感，同时对细菌施加更小的选择性压力。用单个铜绿假单胞菌菌落接种5毫升溶菌肉汤（Lysogeny Broth，简称LB培养基），在37摄氏度、200 rpm振荡条件下培养过夜。然后，将过夜培养物2毫升转移至1升锥形瓶中含200毫升新鲜LB培养基的容器内，在37摄氏度、200 rpm振荡条件下继续培养。

每隔30分钟，从锥形瓶中取出1毫升样品，使用分光光度计检测600纳米波长处的光密度（OD 600）。当OD 600达到0.3至0.5之间时，将40毫升培养物转移至50毫升圆锥形离心管中。在4°C条件下，以8000 rpm离心10分钟，使细胞沉淀。

弃去上清液，将细胞重悬于40毫升冰上预冷的无菌300毫摩尔蔗糖溶液中。再次离心细胞后，将其重悬于20毫升冰上预冷的无菌300毫摩尔蔗糖溶液中。再次离心细胞，并将其重悬于400微升300毫摩尔蔗糖溶液中。将细胞置于冰上冷却30分钟，之后即可用于电穿孔。

接下来，将1 µL浓度为0.2 µg/µL的质粒溶液（该质粒含有编码CdrA启动子的基因）加入到40 µL已制备好的铜绿假单胞菌电转化感受态细胞中，反应体系置于预冷的1.5 mL微量离心管内。混匀悬浮液后，将其转移至预冷的电极间隙为2 mm的电穿孔比色皿中。用纸巾擦去比色皿外壁的水分，然后将比色皿放入电穿孔仪的样品室中。

使用2.5千伏电压、25微法电容和200欧姆电阻对溶液进行电击。取出比色皿，加入1毫升LB培养基。然后将细胞转移至无菌的1.5毫升微量离心管中，在37摄氏度下以200 rpm振荡培养两小时。

孵育后，取10微升、50微升和100微升的菌液涂布于添加氨苄青霉素的无菌LB琼脂平板上，于37摄氏度培养过夜。使用标准GFP通道在荧光显微镜下观察平板，以确认GFP表达。挑取单菌落接种至5毫升LB培养基中。过夜培养后，将0.5毫升过夜培养物与0.5毫升50%甘油于2毫升螺旋盖管中混合，于-80摄氏度保存。

实验前两天，用无菌接种环将保存在负80摄氏度的铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）菌株轻轻涂布于LB琼脂平板上。在37摄氏度下孵育平板过夜。筛选前一天晚上，从平板上挑取单个铜绿假单胞菌菌落，接种至含有10毫升LB培养基的试管中。

将预培养物在37摄氏度、200 rpm振荡条件下过夜培养。在筛选当天，先用新鲜LB培养基将过夜预培养物稀释至OD 600为1.0，再用5% LB进一步稀释至OD 600为0.4，制备二级培养物。向容器中加入无菌磁力搅拌子，在室温下将培养物置于磁力搅拌器上以最低速度搅拌30分钟。

这一步可使细菌在接种到384孔板之前适应培养基环境。制备阳性对照时，将20 µL硫酸妥布霉素加入10 mL已制备好的亚培养液中，轻轻混匀。用移液器将40 µL阳性对照菌液加入A23至P23孔中。

制备阴性对照时，向10毫升已制备的继代培养液中加入30微升二甲基亚砜，轻轻混匀。用移液器将40微升阴性对照培养液加入A24至P24孔中。对于每块添加小分子化合物的培养板，将40微升稀释后的过夜培养液接种至A1至P22孔中。

使用透气盖密封板，并在 37 摄氏度下孵育 6 小时。在分光光度测定前约 30 分钟，将酶标仪预热至 37 摄氏度，以避免产生冷凝水。读数前轻轻移除板上的透气密封盖。

然后在波长600纳米下测定光密度，每孔设置10次闪光，平衡时间为0.2秒。在测定荧光之前，根据阴性对照孔A24进行自动增益和焦距调整，并将增益目标值设为75%。在窗口右侧选择焦距调整和通道A。在激发波长485纳米、发射波长520纳米的条件下测定GFP报告基因的荧光，每孔设置10次闪光，平衡时间为0.2秒。

收集所检测的所有培养板的数据。数据读数将由酶标仪控制软件自动默认保存。为分析数据，请在控制软件中点击 Mars 图标以打开统计分析软件包来查看读数。

双击感兴趣的平板编号以获取数据进行分析。使用稳健的Z'因子分析评估实验的均一性和可重复性。随后，根据文本方案中所述，计算生长抑制率，并评估细胞内c-di-GMP水平的抑制百分比。

该图展示了高通量筛选中 OD 600 和 GFP 的代表性原始数据。孔内数值已应用从热色到冷色表示低值到高值的彩色梯度热图。生成的数据已分析其抑制百分比，并在此分别展示 OD 600 和 GFP 的检测结果。

可能抑制生长和细胞内 c-di-GMP 水平的小分子通常以绿色表示，而可能促进生长和细胞内 c-di-GMP 水平的小分子通常以红色表示。散点图用于比较每种测试小分子获得的抑制百分比。每种小分子由一个小圆点表示，并分别显示 OD 600 和 GFP 检测结果的抑制百分比分布。

选择正负50%的截断值用于确定阳性结果。潜在的阳性化合物以红色高亮显示。对每个有潜力的化合物进行剂量-反应检测。

在此，对两种已鉴定化合物进行10个浓度点的剂量-反应检测，最高浓度为2毫摩尔，采用两倍稀释系列。通过四参数逻辑函数拟合数据，得到每种化合物的半数抑制浓度值分别为158微摩尔和193微摩尔。一旦掌握该技术，可在48小时内筛选超过3,500种化合物。

观看本视频后，您应能充分掌握如何稳健地筛选干扰环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）信号通路的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）化合物。在执行该实验流程时，需注意若在多日内进行筛选，应始终保持筛选条件的一致性。在完成单点筛选后，可采用相同方案进行剂量反应筛选，以验证筛选所得的阳性结果。

该技术为研究人员识别可干扰铜绿假单胞菌生物被膜形成及抗生素耐药性的潜在小分子提供了途径。重要的是，该技术可针对任何感兴趣的细菌进行适应性调整，并可修改以检测其他输出或输入参数，例如对细菌活力的影响。最后，请务必注意，操作铜绿假单胞菌可能存在生物安全风险。

进行该操作时，应始终采取佩戴个人防护装备等预防措施。