高通量设置的建立筛选小分子能调节C-二GMP信令绿脓杆菌
June 30th, 2016
本文介绍了已经成功地建立筛选小分子的大文库其操纵在绿脓杆菌环状二-GMP的细胞水平的潜在能力，提供了抗菌药物发现和化合物测试一个新的强有力的工具的高通量测定法。
该程序的总体目标是通过高通量生物报告基因筛选来识别调节机会性病原体铜绿假单胞菌中第二信使环-di-GMP 细胞内水平的小分子。该方法可以通过环-di-GMP 调节帮助发现干扰铜绿假单胞菌生物信息和其他颗粒的小分子。该技术的主要优点是它非常坚固且用途广泛，可以在 48 小时内筛选 3， 500 多种化合物。
这项技术的影响延伸到开发可能对铜绿假单胞菌、免疫系统或现有抗生素敏感的新型疗法，同时对细菌施加较小的选择性压力。接种 5 毫升溶原肉汤或 LB 培养基，用单个铜绿假单胞菌落，7 摄氏度，以 200 rpm 振荡。然后，将 2 mL 过夜培养物转移到 1 升烧瓶中的 200 mL 新鲜 LB 培养基中，并在 37 摄氏度下以 200 rpm 振荡孵育。
从烧瓶中取出 1 毫升样品并使用分光光度计检查，每 30 分钟监测一次 600 纳米或 OD 600 的光密度。当 OD 600 达到 0.3 到 0.5 之间时，将 40 毫升培养物放入 50 毫升锥形离心管中。通过在 4 摄氏度下以 8000 rpm 离心 10 分钟来沉淀细胞。
弃去上清液，将细胞重悬于 40 毫升冰冷的无菌 300 毫摩尔蔗糖溶液中。第二次离心细胞后，重悬于 20 毫升冰冷的无菌 300 毫摩尔蔗糖溶液中再次离心细胞，并重悬于 400 微升 300 毫摩尔蔗糖溶液中。将细胞在冰上冷却 30 分钟，然后准备好进行电穿孔。
接下来，将 1 微升编码 CdrA 启动子的质粒溶液中，每微升 0.2 微克，该质粒溶液编码绿色荧光蛋白的基因中，加入到制备好的铜绿假单胞菌电感受态细胞中，溶于 1.5 毫升微量离心管中，该离心管已在冰上预冷。混合悬浮液并将其转移到预冷的 2 毫米电极间隙电穿孔比色皿中。用纸巾去除比色皿外部的水分，然后将比色皿放入电穿孔仪的样品室中。
用 2.5 千伏的电压、25 微法的电容和 200 欧姆的电阻对溶液进行脉冲。取下比色皿，加入 1 毫升 LB 培养基。然后，将细胞转移到无菌的 1.5 mL微量离心管中，并在 37 摄氏度下以 200 rpm 振荡孵育 2 小时。
孵育后，将 10 微升、50 微升和 100 微升等分试样的培养物涂布在装有氨苄青霉素的无菌 LB 琼脂平板上，并在 37 摄氏度下孵育平板过夜。通过在具有标准 GFP 通道的荧光显微镜下检查板来确认 GFP 表达。挑选一个菌落并接种 5 毫升 LB。过夜孵育后，将 0.5 mL 过夜培养物与 0.5 mL（50% 甘油）混合在 2 mL螺口管中，并在零下 80 摄氏度下储存。
筛选前两天，通过使用无菌接种环将细菌轻轻地涂抹在平板上，将制备好的铜绿假单胞菌菌株从零下 80 摄氏度的原液接种到 LB 琼脂平板上。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。筛选前一天晚上，将单个铜绿假单胞菌菌落从平板接种到管中的 10 毫升 LB 培养基中。
将预培养物在 37 摄氏度下孵育过夜，并以 200 rpm 的速度振荡。在筛选当天，先用新鲜的 LB 培养基将其稀释至 OD 600 为 1.0，然后进一步用 5%LB 稀释至 OD 600 为 04，从过夜预培养物中制备传代培养物。将无菌磁力搅拌棒加入容器中，并在磁力搅拌器上以最低速度在室温下搅拌培养物 30 分钟。
这使得细菌能够在分配到 384 孔板之前适应培养基。为了制备阳性对照，将 20 微升硫酸妥布霉素添加到 10 毫升制备的传代培养物中，并轻轻混合。将 40 微升阳性对照培养物移液到 A23 至 P23 孔中。
要制备阴性对照，请将 30 微升二甲基亚砜添加到 10 毫升制备的传代培养物中，然后轻轻混合。将 40 微升阴性对照培养物移液到 A24 至 P24 孔中。对于每个用小分子阻尼的板，将 40 微升稀释的过夜培养物接种到 A1 至 P22 孔中。
用透气盖密封板，并在 37 摄氏度下孵育 6 小时。在分光光度法测量前大约 30 分钟，将读板器预热至 37 摄氏度，以避免冷凝。读数前，轻轻地从板上取下透气盖密封。
然后在 600 纳米波长处测量光密度，设置为每孔 10 次闪烁，稳定时间为 0.2 秒。在测量荧光之前，根据阴性对照孔 A24 进行自动增益和焦距调整，并将增益目标值设置为 75%选择窗口右侧的焦距调整和通道 A。在最大激发波长为 485 纳米，最大发射波长为 520 纳米时测量来自 GFP 报告基因的荧光，设置为每孔闪烁 10 次，稳定时间为 0.2 秒。
从检查的所有板中收集数据。读板器控制软件会自动将数据读数保存为默认值。要分析数据，请单击控制软件中的 Mars 图标以打开统计分析包来查看读数。
通过双击感兴趣的板号来检索数据，以访问数据进行分析。使用稳健的 Z prime 分析评估分析的一致性和重现性。然后，计算生长抑制百分比并评估 c-di-GMP 细胞内水平的抑制百分比，如文本方案中所述。
该图描述了来自高通量筛选的 OD 600 和 GFP 的代表性原始数据。已将颜色渐变热图应用于井值，其中从暖到冷的颜色表示从低到高的值。分析生成的数据以检测抑制百分比，并在此处表示 OD 600 和 GFP 读数。
可能抑制生长和细胞内 c-di-GMP 的小分子往往为绿色，而可能促进生长和细胞内 c-di-GMP 水平的小分子往往为红色。散点图用于比较从每个测试的小分子获得的抑制百分比。每个小分子由一个小点表示，并显示 OD 600 和 GFP 读数中每个读数的抑制百分比分布。
选择正负 50% 截止值进行命中识别。潜在命中以红色突出显示。对每种感兴趣的化合物进行剂量反应测定。
在这里，在 10 点剂量反应测定中测试了两种鉴定的化合物，最高浓度为 2 毫摩尔，稀释系列为 2 倍。将四参数 logistic 函数拟合到数据，得到每种化合物的半数最大抑制浓度值，分别为 158 微摩尔和 193 微摩尔。一旦掌握，该技术可用于在 48 小时内筛选超过 3， 500 种化合物。
观看此视频后，您应该对如何稳健地筛选铜绿假单胞菌中干扰 cyclic-di-GMP 信号传导的化合物有很好的了解。在尝试此程序时，请务必记住在几天内进行筛查时保持筛查条件的可比性。在单点筛选之后，使用相同协议运行 dirsk 响应筛选可以验证命中。
这项技术为研究人员识别干扰铜绿假单胞菌信息和抗生素耐药性的潜在小分子铺平了道路。重要的是，该技术可以适用于任何感兴趣的细菌，并且可以修改以检查其他输出或输入，例如对细菌活力的影响。最后，不要忘记与铜绿假单胞菌一起工作可能是危险的。
执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备。
概览
本文描述了一种用于筛选小分子以操纵假单胞菌中循环二磷酸鸟苷水平的高通量测定法。该方法为抗菌药物发现和化合物测试提供了一个可靠的工具。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 药理学
- 抗菌药物发现
背景
- 循环二磷酸鸟苷是一种参与假单胞菌生物膜形成的第二信使。
- 调节其水平可以影响细菌行为和抗生素敏感性。
- 高通量筛选允许快速测试大型化合物库。
- 本研究旨在识别能够有效改变循环二磷酸鸟苷水平的小分子。
研究目的
- 建立高通量生物报告基因筛选以识别小分子。
- 揭示干扰假单胞菌生物信息的化合物。
- 开发可能增强细菌对免疫系统或抗生素敏感性的潜在疗法。
使用的方法
- 电转化假单胞菌细胞的制备。
- 在CdrA启动子控制下载入GFP的质粒的电转化。
- 在384孔板中高通量筛选小分子。
- 测量光密度和荧光以评估化合物效应。
主要结果
- 成功识别调节循环二磷酸鸟苷水平的小分子。
- 筛选方法的稳健性在48小时内测试超过3,500种化合物中得到验证。
- 基于识别的化合物开发新的抗菌疗法的潜力。
结论
- 高通量测定法是药物发现的有力工具。
- 识别的化合物可能导致假单胞菌感染的新型治疗方法。
- 该方法可以适应筛选其他病原体和化合物。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput screening of small molecules that modulate c-di-GMP signaling in Pseudomonas aeruginosa addresses a critical need for novel antibacterial strategies beyond traditional antibiotics. This robust, scalable workflow enables rapid identification of modulators impacting biofilm formation and antibiotic resistance, directly informing early-stage target validation and lead identification. The platform's adaptability and quantitative outputs support risk-adjusted portfolio decisions in antibacterial drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of c-di-GMP signaling as a druggable bacterial pathway.
- Supports functional validation of targets involved in biofilm regulation and resistance.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking compound effects to quantifiable pathway modulation.
- Provides predictive confidence for advancing hits into downstream validation.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible GFP-based bioreporter assay for high-throughput compound evaluation.
- Generates quantitative fluorescence and growth inhibition data for robust hit triage.
- Enables screening of over 3,500 compounds within 48 hours, supporting scalable library assessment.
- Establishes assay readiness for iterative screening and dose-response follow-up.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational goals by targeting bacterial biofilm mechanisms relevant to clinical resistance.
- Supports continuity from early discovery to preclinical validation of antibacterial candidates.
- Provides a platform adaptable to other pathogens and signaling pathways as needed.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput screening protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and target de-risking for antibacterial portfolios.
- Discovery Biology: Quantifies modulation of c-di-GMP signaling to clarify pathway relevance and target engagement.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for robust compound triage and assay standardization.
- Analytics: Delivers statistical outputs including Z prime analysis and percent inhibition for data-driven decision making.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by focusing on clinically relevant resistance mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to diverse bacterial systems and signaling targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in antibacterial discovery.
- Operational Value: Standardizes high-throughput workflows for reproducibility and scalability across compound libraries.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of antibacterial candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of leads targeting bacterial resistance pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, high-throughput screening, and fluorescence analytics.
- Needs access to plate readers with fluorescence and absorbance capabilities and robust data analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay conditions for reproducibility across screening campaigns.
- Adaptable to other bacterial species and signaling pathways with protocol modifications.
- Safety precautions are essential when handling P. aeruginosa due to its pathogenicity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Generation of GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain
4:21
Preparation of the Starter Culture for Inoculation
5:35
Inoculation and Incubation of the 384-well Plates Containing Small Molecules
6:33
Measurement and Analysis of Growth and Intracellular c-di-GMP Level
8:25
Results: Hits Obtained Following the High-throughput Screen against P. aeruginosa
10:07
Conclusion
