Name: 高通量设置的建立筛选小分子能调节C-二GMP信令绿脓杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 了解高通量筛选小分子调节铜绿假单胞菌环二鸟苷酸信号的方法。该技术可在48小时内筛选超过3500种化合物，为抗菌药物发现提供强大工具。

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我们感谢Tolker-Nielsen实验室慷慨提供了用于开发筛选方法的报告基因构建体。同时感谢Ryan实验室成员对本文提出的宝贵意见和审阅。作者的研究工作部分得到了惠康信托基金（Wellcome Trust）的资助，其中包括授予R.P.R.的WT100204AIA高级研究员基金以及授予K.N.R.的093714/Z/10/Z博士奖学金。

注意：纯化的 c-di-GMP 报告质粒的克隆与转化步骤在其他文献中有讨论12。
1. 生成表达GFP标记的c-di-GMP报告系统的P. aeruginosa菌株
<ol>
	<li>接种一单菌落于5 ml的溶菌肉汤（LB）培养基中 P. aeruginosa 并在过夜孵育于 37 °C 以 200 rpm 振荡培养。</li>
	<li>将2 ml过夜培养物转移至1 L锥形瓶中的200 ml新鲜LB培养基中，并在 37 °C 以 200 rpm 振荡培养。</li>
	<li>监测 600 nm 处的光密度（OD600每30分钟从烧瓶中取1 ml样品，使用分光光度计检测（方法如前所述）12).</li>
	<li>当 OD600 当OD值达到0.3 - 0.5时，将40 ml培养液转移至50 ml锥形离心管中。</li>
	<li>8,000 rpm 离心 10 分钟，使细胞沉淀 4 °C弃去上清液，将细胞重悬于40 ml预冷的无菌300 mM蔗糖溶液中。</li>
	<li>再次按照步骤1.5所述条件离心，沉淀细胞，并将细胞重悬于20 ml预冷的无菌300 mM蔗糖溶液中。</li>
	<li>按照步骤1.5所述离心方法最后一次收集细胞沉淀，并重新悬浮于 400 µl 冰冷无菌的300 mM蔗糖溶液。 
	注意：此时细胞密度应约为 1 x 1011 每毫升菌落形成单位（CFU/ml）</li>
	<li>将细胞在冰上冷却 30 min，随后即可用于电穿孔。</li>
	<li>添加 1 µl 的 0.2 µg/µl pCdrA::gfpC 质粒 12 溶液至 40 µl 的 P. aeruginosa 将上述制备的电转感受态细胞加入预冷的1.5 ml微量离心管中，冰上操作。混匀后转移至预冷的、电极间隙为2 mm的电穿孔比色皿中。 
	注：pCdrA::gfpCpUCP22Not-PcdrARBSII-gfp(Mut3)-T0- T1，Ampr Gmr，可对细胞内 c-di-GMP 水平提供荧光读出信号 P. aeruginosa 菌株，由Rybtke开发并验证 等12.</li>
	<li>用纸巾擦干比色皿外壁的水分，将比色皿放入电穿孔仪的样品室中。以2.5 kV电压、电容 25 µF 200 Ω的电阻。</li>
	<li>取出比色皿，加入1 ml LB培养基。然后将细胞转移至一支无菌的1.5 ml微量离心管中，在37°C下孵育2小时 37 °C 以 200 rpm 振荡。</li>
	<li>铺展 10 µl, 50 µl 和 100 µl 含氨苄青霉素（浓度为 100 µg/ml，并将培养板置于相应条件下孵育 37 °C 过夜。</li>
	<li>通过荧光显微镜在标准GFP通道（激发波长485 nm，发射波长520 nm）下观察平板，确认GFP表达，并挑取单菌落接种于5 ml LB培养基中。按步骤1.1所述条件过夜培养。取0.5 ml过夜培养物与0.5 ml 50%甘油混合于2 ml螺口管中，于-80 °C保存80 °C.</li>
</ol>
2. 接种用起始培养物的制备
<ol>
	<li>实验前两天，用无菌接种环将含有 pCdrA::gfpC 质粒的 P. aeruginosa 菌株从 -80 °C 保存液中转接至 LB 琼脂平板（添加浓度为 100 µg/ml 的氨苄青霉素），并在平板表面均匀涂布。于 37 °C 培养箱中过夜培养。</li>
	<li>筛选前一天晚上，从平板上挑取单个 P. aeruginosa 菌落，接种于含有 10 ml LB 液体培养基（添加浓度为 100 µg/ml 的氨苄青霉素）的试管中，于 37 °C、200 rpm 摇床中过夜培养，制备预培养物。</li>
	<li>筛选当天，将过夜预培养物用新鲜 LB 培养基稀释至 OD600 为 1.0，再用 5% LB 培养基进一步稀释至 OD600 为 0.04（稀释比例 1:25），制备子培养物。 
	注意：接种培养基的总体积取决于待测平板的数量。5% LB 培养基通过将 100% LB 用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至所需浓度制备而成。重要的是，该培养基（5% LB）可使 P. aeruginosa 中的 pCdrA::gfpC 持续激活。</li>
	<li>向容器中加入无菌磁力搅拌子，在室温下将菌液置于磁力搅拌器上以最低速度搅拌 30 分钟，使细菌在分装至 384 孔板前适应培养基环境。</li>
</ol>
3. 小分子384孔板的接种与培养
注意：无菌操作和良好的无菌技术对以下步骤至关重要。
<ol>
	<li>制备阳性对照（100% 抑制）：向第 2.3 步制备的 10 ml 菌液（足够用于最多 12 块板）中加入 20 µl 妥布霉素硫酸盐（25 mg/ml），轻轻混匀。用移液器将 40 µl 阳性对照菌液加入 A23 - P23 孔中（图 2）。</li>
	<li>制备阴性对照（0% 抑制）：向第 2.3 步制备的 10 ml 菌液（足够用于最多 12 块板）中加入 30 µl 二甲基亚砜（DMSO），轻轻混匀。用移液器将 40 µl 阴性对照菌液加入 A24 - P24 孔中（图 2）。</li>
	<li>对于每一块含有小分子的板，将第 2.3 步所述的过夜培养物稀释液各 40 µl 接种至 A1 - P22 孔中（图 2）。 
	注意：可使用液体处理机器人完成此操作。由于细菌培养物具有异质性，在加样过程中必须持续进行适度振荡，以确保细菌在培养基中均匀分布。为此，在加样期间应使用磁力搅拌器持续搅拌第 2.4 步中已适应温度的菌液。</li>
	<li>用透气封板膜密封培养板，并在 37 °C 下孵育 6 小时。 
	注意：使用透气封板膜对于维持全部 384 个孔内环境的一致性至关重要，可避免孔板内出现氧气梯度。</li>
</ol>
4. 生长（OD600）和细胞内c-di-GMP水平（GFP）的测定
<ol>
	<li>在进行分光光度测量前约30分钟，将酶标仪预热至37 °C，以避免产生冷凝水。</li>
	<li>读数前轻轻取下透气性盖膜。设置每孔10次闪光，稳定时间为0.2秒，于波长600 nm处测定光密度。</li>
	<li>在测量荧光之前，基于A24孔（阴性对照）进行自动增益和焦点调整，并将增益目标值设为75%（图2）。
	<ol>
		<li>在酶标仪控制软件中，点击“开始测量”，然后点击“焦点与增益调整/板编号”选项卡。</li>
		<li>在窗口右侧选择“焦点调整”和“通道A”。</li>
		<li>选择“增益调整”和“选定孔”，在“目标值”栏中输入“75”。最后，在点击“开始调整”前，在板布局中选择A24孔。调整完成后，点击“开始测量”。</li>
		<li>使用每孔10次闪光、稳定时间0.2秒的设置，在激发/发射最大值为485/520 nm的条件下测定GFP报告基因的荧光强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集所有检测板的数据。注意：数据读数默认由酶标仪控制软件自动保存。
	<ol>
		<li>在控制软件中点击“Mars”图标，打开统计分析软件包以查看读数。</li>
		<li>通过双击感兴趣的板编号，调取相应数据进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用稳健的 z' 分析评估检测方法的均一性和可重复性，这是高通量筛选中最常见的质量评估指标。使用以下公式计算稳健 z' 值： 
	<img alt="稳健 z' 分数公式，中位数绝对偏差，统计分析方法，方程。" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 1"> 
	其中 MAD（中位数绝对偏差）是标准偏差的估计值，p 代表阳性对照（100% 抑制），n 代表阴性对照（0% 抑制），适用于 OD600 和 GFP 数值。注意：当稳健 z' 值（基于 OD600 和 GFP 原始数据分别计算）大于或等于 0.5 时，认为该检测方法性能优良。</li>
	<li>使用以下公式计算生长抑制率： 
	<img alt="实验数据分析中 OD600 的抑制公式，显示百分比计算方程。" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 2"> 
	其中 XiOD600 为每个样品孔的 OD600 测量值。若 % 抑制OD600 ＞ 0，表示生长抑制剂；若 % 抑制OD600 ＜ 0，表示生长促进剂。</li>
	<li>使用以下公式评估细胞内 c-di-GMP 水平的抑制百分比（任意荧光强度单位的变化已根据细胞密度变化进行校正）： 
	<img alt="GFP 抑制百分比公式，静态图像，用于生化分析和研究。" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 3"> <img alt="色谱过程方程，组分计算，研究分析图示，GFP 表达研究。" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 4"> 
	其中 XiGFP 为每个样品孔的 GFP 测量值。若 % 抑制GFP ＞ 0，表示 c-di-GMP 抑制剂；若 % 抑制GFP ＜ 0，表示 c-di-GMP 促进剂。</li>
	<li>以每块板样品孔读数的中位数 ±3 MAD（即中位数的 3 倍 MAD）设定阳性信号检测阈值，假设数据点呈正态分布。注意：如有需要，也可选择 ±50% 抑制作为截断值，以获得更可重复且准确的剂量反应检测结果。</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recover+the+lost+art+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recover the lost art of drug discovery.</a> Nature. 485, 439-440 (2012).</li>
<li>Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cyclic+di-GMP+Signaling%3A+A+Strategy+to+Control+Biofilm+Formation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Design%22%5BJournal%5D)">Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation?</a> Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).</li>
<li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+c-di-GMP+signaling+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Principles of c-di-GMP signaling in bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 263-273 (2009).</li>
<li>Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+the+PilZ+don%27t+work%3A+effectors+for+cyclic+di-GMP+action+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Microbiol%22%5BJournal%5D)">When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria.</a> Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).</li>
<li>Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP%3A+the+First+25+Years+of+a+Universal+Bacterial+Second+Messenger%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).</li>
<li>Boyd, C. D., GA, O. 'T. oole <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+Messenger+Regulation+of+Biofilm+Formation%3A+Breakthroughs+in+Understanding+c-di-GMP+Effector+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).</li>
<li>Ryan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HD-GYP+domain+proteins+regulate+biofilm+formation+and+virulence+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).</li>
<li>Christensen, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Foreign-Body+Biofilm+Infections+through+Reduction+of+the+Cyclic+Di-GMP+Level+in+the+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria.</a> Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Comm. 5, (2014).</li>
<li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Small+Molecules+That+Antagonize+Diguanylate+Cyclase+Enzymes+To+Inhibit+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).</li>
<li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+molecules+inhibiting+diguanylate+cyclases+to+control+bacterial+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development.</a> Biofouling. 30, 17-28 (2014).</li>
<li>Rybtke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-Based+Reporter+for+Gauging+Cyclic+Di-GMP+Levels+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22App+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa.</a> App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了改善细菌感染的治疗，显然需要更深入地理解细菌在分子调控层面的行为。本文所述方法将有助于微生物学家、生物化学家和临床医生发现那些有可能调控或干扰细菌细胞内第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）浓度的小分子。该方法利用一种 recently developed GFP 生物传感器来监测细菌细胞内的 c-di-GMP 水平 P. aeruginosa12该生物报告系统已得到验证，重要的是，在5% LB的PBS培养条件下，其不会影响所用菌株的生长。利用全细胞筛选方法鉴定可改变c-di-GMP水平的小分子 体内 克服了基于靶点的药物发现中分子穿透细菌膜的主要难题，特别是穿透革兰氏阴性菌膜的难题。重要的是，该检测方法表现出极高的稳健性，迄今为止所有筛选实验中，z' 值 consistently 高于 0.5。采用本方案进行筛选将发现若干可抑制和/或促进细胞内 c-di-GMP 水平的小分子 P. aeruginosa此外，该检测方法还有望鉴定出具有杀菌或抑菌作用的化合物，这些化合物会导致OD值下降600 读出
尽管实验方案部分未予讨论，但实验准备过程中有几个重要事项需要考虑。必须牢记，GFP 生物报告系统基于质粒构建。尽管该报告质粒在 P. aeruginosa中具有高度稳定性，但在连续传代过程中仍可能丢失，因此必须使用从-80 °C甘油保藏菌种新划线的菌株，并且检测荧光表达至关重要。在整个筛选过程中维持一致的培养条件也非常关键，因为这些条件的任何波动都可能对筛选结果产生连锁影响。这包括确保培养基和抗生素预先批量制备，并在整个筛选过程中统一使用。细菌培养物生长不均（基于OD600读数）是此类高通量筛选中最常见的问题之一。这可能是由于边缘效应，或向孔板中加入的菌液不均一所致。针对前者，孵育过程中必须使用透气封板膜；针对后者，建议使用至少三倍于管路死体积的菌液对液体处理设备的管路进行预润洗。分液过程中磁力搅拌器必须保持最低转速。在实验过程中，为确保384孔板中细菌生长的一致性，监测和储存条件极为重要，应避免在孵育期间堆叠孔板，因为这可能导致不必要的氧气梯度，从而引起生长模式的偏移。还需注意，作为阴性对照使用的DMSO溶剂不应抑制目标菌株的生长。在正式筛选前，使用目标菌株进行一次模拟筛选，可有效避免上述多数生长相关问题。数据解读同样需要审慎考虑，因为c-di-GMP抑制效果是通过任意荧光强度单位的变化来计算的，且必须校正细胞密度变化的影响。鉴于此，也应考虑采用不同的数学公式来评估这些实验的数据输出。&#160;例如，某化合物可能表现为c-di-GMP抑制剂，但实际上可能是生长抑制剂，反之亦然，因此对筛选出的阳性结果需进行谨慎解读。
在开发和实施这种高通量细胞筛选方法时，必须考虑若干缺陷和局限性。例如，该生物报告系统通过荧光探针间接检测细胞内c-di-GMP水平，而筛选中使用的小分子可能会影响该探针的检测性能。另一个相关问题是，基于细胞的检测方法无法提供有关细胞内c-di-GMP水平变化机制的信息。因此，实验中获得的重要结果必须通过高效液相色谱-质谱联用技术进行验证，该方法被公认为 &#34;金标准&#34; 用于检测细菌内c-di-GMP水平波动的方法。此外，本方法仅能提供有关培养条件下细菌行为的信息 体外，因为细菌细胞在宿主环境条件下生长时（体内) 由于该环境的影响，细菌会迅速改变其活性。此外，使用GFP生物报告系统进行筛选时，无法考虑细菌细胞的生理状态。然而，该方案可调整为在筛选过程中通过显微镜对单个孔进行实时监测。
尽管存在上述考虑和局限性，该高通量检测方法仍然是筛选能够干扰细胞内 c-di-GMP 水平的小分子的有效手段。由于已有大量微生物物种（包括多种细菌病原体）被用于研究细胞内 c-di-GMP 水平的调控机制，因此本实验方案可应用于多种细菌物种，并可拓展至更复杂的多物种细菌模型研究。通过调整培养条件，该检测方法可轻松优化以适用于其他细菌物种；也可通过使用不同的生物报告系统，适配于检测其他输出信号。根据感兴趣的生长阶段，可采用不同的孵育时间。然而，在扩大实验规模或提高通量时，必须注意细菌在微孔板制备和检测读数过程中仍会持续生长。因此，建议每次使用本方案最多同时处理 15 块微孔板。此外，使用超过 384 孔的微孔板可能无法保证细菌生长的均一性，需要进一步优化。当减少微孔板数量时，使用电子移液器手动接种可能比使用液体处理机器人更为合适。显然，鉴于抗生物膜化合物可干扰 c-di-GMP 信号通路，本方案可用于研究能够分散生物膜的小分子。该方案还可被重新开发，用于探究细菌生理学的多个方面。由于 c-di-GMP 信号通路在大多数细菌中普遍存在，通过本方案研究这些生物体的生理特性，可识别不同的化学刺激物，并确定其作用机制是否依赖于 c-di-GMP 信号通路。
总之，本实验方案中所介绍的方法具有高度的稳健性和广泛的应用性，将有助于在多种生物系统中鉴定出调控环二鸟苷酸（c-di-GMP）信号通路的化学分子。

临床上重要抗生素的细菌耐药性迅速发展，是目前全球医疗专业人员面临的主要问题之一。传统抗生素的失效促使人们开始寻找能够干扰细菌毒力及疾病进展相关过程的新型化学物质1。其中，利用细胞内第二信使环状二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）的调控系统，近年来已成为一个具有前景的靶点2-4。已有研究证实，这种全局性第二信使信号分子可调控多种功能，包括抗生素耐药性、黏附、生物膜形成以及疾病发生2-4。
目前认为，细菌细胞内 c-di-GMP 的细胞水平由其合成与降解共同调控：含有 GGDEF 结构域的双鸟苷酸环化酶（DGCs）利用两分子 GTP 合成 c-di-GMP，而含有 EAL 或 HD-GYP 结构域的磷酸二酯酶（PDEs）则催化 c-di-GMP 的降解（详见文献 (3, 5)）。含有这些结构域的蛋白质通常还包含其他信号传导结构域，表明其在 c-di-GMP 转换中的活性可能直接受到或间接受到环境或细胞信号的调控3,5。因此，c-di-GMP 信号通路的功能是将多种环境信号的感知与细菌表型的改变相连接。c-di-GMP 通过多种机制在转录、转录后及翻译后水平上对细菌基因表达发挥调控作用4。
c-di-GMP 在许多细菌细胞中的一个重要影响是决定细菌的“生活方式”，特别是调控游动的浮游细胞与附着于表面或形成多细胞生物膜结构的固着细胞之间的转换3,5。通常，细胞内较高的 c-di-GMP 水平与生物膜形成和固着生活方式相关，而较低的细胞内水平则在许多细菌病原体中促进运动性和毒力因子的合成3,5。因此，更深入地了解 c-di-GMP 信号传导机制，可能为抑制细菌病原体的生物膜形成和毒力提供策略。然而，这一任务极具挑战性，因为大多数细菌基因组编码大量含有 GGDEF、EAL 和/或 HD-GYP 结构域的蛋白质（例如 P. aeruginosa 拥有超过 40 种此类蛋白）以及多种效应因子6,7。
然而，尽管存在这种复杂性，最近的证据表明，通过调控c-di-GMP信号通路的策略，可能被开发用于预防耐药性感染的发生，或使其对免疫系统敏感，或通过与经典抗生素联合使用实现有效治疗2与此一致的是，已有实验证实，人工降低细胞内c-di-GMP水平可导致 体外培养的 P. aeruginosa 导致生物膜形成减少以及对抗微生物药物的敏感性增加，而 P. aeruginosa小鼠腹腔内硅胶植入物上形成的生物膜可采用类似方式分散8-11.
在此，我们介绍一种基于荧光的高通量报告基因检测方法，用于筛选可能调节细胞内c-di-GMP水平的小分子 P. aeruginosa (图1该检测基于利用先前开发的GFP报告系统测定细胞内c-di-GMP水平，该报告系统的表达在转录水平上与c-di-GMP响应元件相偶联 cdrA 启动子12. 本方案描述了报告基因载体在 P. aeruginosa 目标菌株、化合物平板制备、384孔板培养接种、生长条件，以及数据采集、管理和分析的详细信息（图1总体而言，该实验方案将有助于研究人员鉴定出可能靶向细菌中 c-di-GMP 信号通路的新化合物，并可用于深入理解相关生物学机制的研究。 P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>胰蛋白胨肉汤（Lennox）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>含琼脂的胰蛋白胨肉汤（Lennox）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-25G</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>妥布霉素硫酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1783-100MG</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Genesys 10S 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermoscientific</td><td>840-208100</td><td></td></tr><tr><td>2 mm 间隙电穿孔比色皿</td><td>Bio-Rad</td><td>1652092</td><td></td></tr><tr><td>BioRad GenePulser XCell 电穿孔仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1652662</td><td></td></tr><tr><td>Leica 荧光体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>BRAND 磁力搅拌子，PTFE 材质，圆柱形带枢轴环（使用前需高压灭菌）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z328952-10EA</td><td></td></tr><tr><td>384 孔，白色孔壁，透明底板</td><td>Greiner</td><td>781098</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi 试剂分配器</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi 管路</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073290</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO II 16 通道电子移液器</td><td>Integra Biosciences</td><td>4642</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 无菌一次性试剂储液槽</td><td>Fisher Scientific</td><td>12399175</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal 透气膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MKBQ1886</td><td></td></tr><tr><td>Pherastar 酶标仪（软件版本：4.00 R4，固件版本：1.13）</td><td>BMG Labtech</td><td>Pherastar FS</td><td></td></tr></tbody></table>

建立高通量筛选调控c-di-gmp信号通路小分子的实验体系 铜绿假单胞菌

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

细菌对传统抗生素的耐药性促使研究人员致力于在新近发现的调控通路中寻找新的药物靶点。利用细胞内环二鸟苷酸（c-di-GMP）作为第二信使的调控系统便是其中一类潜在靶点。c-di-GMP 是一种几乎存在于所有细菌中的信号分子，可调控多种生物学过程，包括抗生素耐药性、生物膜形成以及毒力。目前对 c-di-GMP 信号通路如何调控耐药性生物膜发育机制的理解提示，通过改变细胞内该核苷酸的浓度或干扰其信号传导通路，可能抑制生物膜的形成，或增强生物膜对抗生素的敏感性。本文介绍一种基于绿色荧光蛋白（GFP）的简单高通量生物报告系统，其表达受 c-di-GMP 响应型启动子 cdrA 的调控，可用于快速筛选能够调节铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）细胞内 c-di-GMP 水平的小分子化合物。该方法在 48 小时内可筛选超过 3,500 种化合物，并可适用于多种微生物体系。

此处所述的方法可使单名研究人员在48小时内高效且成功地筛选平均约3,500种化合物。高通量筛选方案的概览以流程图形式展示于 图1在本研究中，我们在终浓度下，针对符合五规则的化合物文库进行了筛选，以寻找潜在的c-di-GMP调节化合物 600 µM然而，目前有许多市售的类药物和非类药物化合物库可用于该检测。这些化合物库可以是针对细菌的化合物，也可以是随机混合的化合物，但每种文库都具有预先确定的理化性质和特征，例如本实验中筛选的这一化合物库，其含有极性官能团和多个立体生成中心。在本方案中，根据所示布局，将细菌与化合物、抗生素阳性对照以及DMSO溶剂对照一同接种到微孔板中 图2. 图3 展示了以单个文库孔板为例的初筛结果。代表性OD600 和GFP原始数据如图所示 图3A 和 3B，分别对应。颜色梯度热图采用从热（红色）到冷（绿色）的颜色表示低至高的OD值600/GFP 值已应用于各孔的数值。热图通过电子表格软件生成，采用三色阶条件格式，颜色跨度从最低的 OD600/GFP 读数直至最高 OD600/GFP 读数。低 OD600 GFP 值相对于 DMSO 阴性对照分别表示对生长和 c-di-GMP 水平的抑制，而相对于 DMSO 阴性对照的较高值则分别表示对生长和 c-di-GMP 水平的促进。OD 的稳健 z' 值600 和GFP根据方案中提供的公式（5.1）进行计算。由于二者均高于0.5（分别为0.694和0.761），表明实验质量可靠，数据可进一步分析。生长抑制率（OD600细胞内c-di-GMP水平（GFP）和相对荧光强度（RFU）通过方案中提供的公式（5.2、5.3）进行计算。代表性数据如图所示。 图 4A 和 4B 分别为。已对孔内数值应用颜色梯度热图，颜色从热（红色）到冷（绿色）表示抑制率从低到高。抑制率的散点图(OD600/GFP) 基于初筛结果，来自各个孔的数据被绘制在 图5A 和 5B 用于 OD600 以及GFP数据。选择±50%作为阈值（以虚线表示）用于阳性结果判定。基于该阈值识别出的潜在阳性结果以红点标示。从该检测中可区分出两类感兴趣的化合物。在检测中鉴定出的阳性结果 图5A 是能够抑制细菌生长的化合物，而筛选中鉴定出的阳性结果 图5B 是可能具有调节细胞内 c-di-GMP 水平能力的化合物。本实验已鉴定出两种代表性阳性化合物：化合物 A，一种潜在的生长抑制剂；以及化合物 B，一种潜在的 c-di-GMP 抑制剂。化合物 A 对应于 F8 孔 图3 和 4 生长抑制率为72.5%。环二鸟苷单磷酸（cyclic di-GMP）水平也出现预期的相应抑制。化合物B对应于孔K3 图3 和 4 且使环二-GMP水平降低了61%，而生长未发生改变。选出的阳性化合物进一步通过10个浓度点的剂量-反应实验进行验证，最高浓度为2 mM，并进行两倍系列稀释。IC50 根据剂量-反应曲线计算得出数值（图6A和B).
<img alt="高通量筛选（HTS）工作流程图；从接种到数据挖掘，分析结果。" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 概述：在P. aeruginosa中筛选可调节细胞内c-di-GMP水平的小分子化合物的高通量实验设置。 本图展示了本实验所用方案的逐步流程。将铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）单菌落于LB起始培养基中过夜培养。使用试剂分配器将菌液接种至含有待筛选化合物的384孔板中。将384孔板孵育6小时后，测定OD600和GFP值。通过这些检测信号，可鉴定出影响细胞内c-di-GMP水平的化合物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化合物筛选微孔板布局示意图，显示对照；图例：蓝色、红色、绿色。" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小分子筛选实验所用的 384 孔板图谱。 文库中的化合物（浅蓝色）被分配至 A1–P22 孔中。“阳性对照”（红色）为终浓度 50 µg/ml 的妥布霉素硫酸盐，加入 A23–P23 孔中；“阴性对照”（绿色）为终浓度 1% 的 DMSO，加入 A24–P24 孔中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微孔板热图、OD600和GFP原始数据、实验结果、荧光强度。" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 一个384孔筛选板的代表性结果。 代表性原始数据包括OD600（A）和GFP（B）。已对孔位数值应用了颜色梯度热图，颜色从热（红色：OD600 = 0.65 或 GFP = 250,000）到冷（绿色：OD600 = 0.10 或 GFP = 40,000），表示数值由低到高。相对于DMSO阴性对照，OD600/GFP读数较低的孔倾向于呈现红色，而OD600/GFP读数较高的孔则倾向于呈现绿色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抑制率热图、OD600、GFP；实验数据分析、比较图表。" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 384孔板中计算的抑制百分比的代表性结果。 分析的%抑制数据分别展示于OD600（A）和GFP（B）的检测结果中。孔位数值采用颜色梯度热图表示，颜色从热（红色：OD600 = -150% 或 GFP = -20%）到冷（绿色：OD600 = 100% 或 GFP = 100%），表示抑制程度由低到高。可能抑制细菌生长和细胞内c-di-GMP水平的小分子通常呈现绿色，而可能促进生长和细胞内c-di-GMP水平的小分子则通常呈现红色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化合物抑制率分析；抑制率与化合物编号的散点图，异常值检测。" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 各测试小分子化合物的 % 抑制率(OD600/GFP) 代表性散点图。每个小分子用一个点表示，分别展示了 OD600（A）和 GFP（B）检测信号的抑制率分布情况。以 ±50% 作为阈值用于筛选潜在活性化合物。潜在阳性结果以红色高亮显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="剂量-反应曲线分析；IC&lt;sub&gt;50&lt;/sub&gt; 图比较；浓度与抑制率关系图" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 剂量-反应实验的代表性结果。 从前期筛选中鉴定出的两种化合物（潜在生长抑制剂A和潜在c-di-GMP抑制剂B）在10个浓度点的剂量-反应实验中进一步测试，最高浓度为2 mM，并进行两倍系列稀释。通过拟合四参数逻辑函数，得到的IC50值分别为158 µM和193 µM。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种已成功建立的高通量检测方法，可用于筛选大量小分子化合物文库，以评估其调控细胞内环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）水平的潜在能力 铜绿假单胞菌为抗菌药物发现和化合物筛选提供了一种新的强大工具。

建立高通量筛选调控c-di-GMP信号通路小分子的实验体系 铜绿假单胞菌

细菌对传统抗生素的耐药性促使研究人员致力于在新近发现的调控通路中寻找新的药物靶点。

本实验的总体目标是通过高通量生物报告系统筛选，鉴定能够调节机会性病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）细胞内第二信使环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）水平的小分子化合物。该方法有助于发现通过调节环二鸟苷酸水平来干扰铜绿假单胞菌生物被膜形成及其他相关过程的小分子物质。该技术的主要优势在于其高度的稳健性和通用性，可在48小时内完成对超过3,500种化合物的筛选。该技术的应用前景包括开发新型治疗方法，这些方法可能使铜绿假单胞菌对免疫系统或现有抗生素更加敏感，同时对细菌施加更小的选择性压力。用单个铜绿假单胞菌菌落接种5毫升溶菌肉汤（Lysogeny Broth，简称LB培养基），在37摄氏度、200 rpm振荡条件下培养过夜。然后，将过夜培养物2毫升转移至1升锥形瓶中含200毫升新鲜LB培养基的容器内，在37摄氏度、200 rpm振荡条件下继续培养。每隔30分钟，从锥形瓶中取出1毫升样品，使用分光光度计检测600纳米波长处的光密度（OD 600）。当OD 600达到0.3至0.5之间时，将40毫升培养物转移至50毫升圆锥形离心管中。在4°C条件下，以8000 rpm离心10分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，将细胞重悬于40毫升冰上预冷的无菌300毫摩尔蔗糖溶液中。再次离心细胞后，将其重悬于20毫升冰上预冷的无菌300毫摩尔蔗糖溶液中。再次离心细胞，并将其重悬于400微升300毫摩尔蔗糖溶液中。将细胞置于冰上冷却30分钟，之后即可用于电穿孔。接下来，将1 µL浓度为0.2 µg/µL的质粒溶液（该质粒含有编码CdrA启动子的基因）加入到40 µL已制备好的铜绿假单胞菌电转化感受态细胞中，反应体系置于预冷的1.5 mL微量离心管内。混匀悬浮液后，将其转移至预冷的电极间隙为2 mm的电穿孔比色皿中。用纸巾擦去比色皿外壁的水分，然后将比色皿放入电穿孔仪的样品室中。使用2.5千伏电压、25微法电容和200欧姆电阻对溶液进行电击。取出比色皿，加入1毫升LB培养基。然后将细胞转移至无菌的1.5毫升微量离心管中，在37摄氏度下以200 rpm振荡培养两小时。孵育后，取10微升、50微升和100微升的菌液涂布于添加氨苄青霉素的无菌LB琼脂平板上，于37摄氏度培养过夜。使用标准GFP通道在荧光显微镜下观察平板，以确认GFP表达。挑取单菌落接种至5毫升LB培养基中。过夜培养后，将0.5毫升过夜培养物与0.5毫升50%甘油于2毫升螺旋盖管中混合，于-80摄氏度保存。实验前两天，用无菌接种环将保存在负80摄氏度的铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）菌株轻轻涂布于LB琼脂平板上。在37摄氏度下孵育平板过夜。筛选前一天晚上，从平板上挑取单个铜绿假单胞菌菌落，接种至含有10毫升LB培养基的试管中。将预培养物在37摄氏度、200 rpm振荡条件下过夜培养。在筛选当天，先用新鲜LB培养基将过夜预培养物稀释至OD 600为1.0，再用5% LB进一步稀释至OD 600为0.4，制备二级培养物。向容器中加入无菌磁力搅拌子，在室温下将培养物置于磁力搅拌器上以最低速度搅拌30分钟。这一步可使细菌在接种到384孔板之前适应培养基环境。制备阳性对照时，将20 µL硫酸妥布霉素加入10 mL已制备好的亚培养液中，轻轻混匀。用移液器将40 µL阳性对照菌液加入A23至P23孔中。制备阴性对照时，向10毫升已制备的继代培养液中加入30微升二甲基亚砜，轻轻混匀。用移液器将40微升阴性对照培养液加入A24至P24孔中。对于每块添加小分子化合物的培养板，将40微升稀释后的过夜培养液接种至A1至P22孔中。使用透气盖密封板，并在 37 摄氏度下孵育 6 小时。在分光光度测定前约 30 分钟，将酶标仪预热至 37 摄氏度，以避免产生冷凝水。读数前轻轻移除板上的透气密封盖。然后在波长600纳米下测定光密度，每孔设置10次闪光，平衡时间为0.2秒。在测定荧光之前，根据阴性对照孔A24进行自动增益和焦距调整，并将增益目标值设为75%。在窗口右侧选择焦距调整和通道A。在激发波长485纳米、发射波长520纳米的条件下测定GFP报告基因的荧光，每孔设置10次闪光，平衡时间为0.2秒。收集所检测的所有培养板的数据。数据读数将由酶标仪控制软件自动默认保存。为分析数据，请在控制软件中点击 Mars 图标以打开统计分析软件包来查看读数。双击感兴趣的平板编号以获取数据进行分析。使用稳健的Z'因子分析评估实验的均一性和可重复性。随后，根据文本方案中所述，计算生长抑制率，并评估细胞内c-di-GMP水平的抑制百分比。该图展示了高通量筛选中 OD 600 和 GFP 的代表性原始数据。孔内数值已应用从热色到冷色表示低值到高值的彩色梯度热图。生成的数据已分析其抑制百分比，并在此分别展示 OD 600 和 GFP 的检测结果。可能抑制生长和细胞内 c-di-GMP 水平的小分子通常以绿色表示，而可能促进生长和细胞内 c-di-GMP 水平的小分子通常以红色表示。散点图用于比较每种测试小分子获得的抑制百分比。每种小分子由一个小圆点表示，并分别显示 OD 600 和 GFP 检测结果的抑制百分比分布。选择正负50%的截断值用于确定阳性结果。潜在的阳性化合物以红色高亮显示。对每个有潜力的化合物进行剂量-反应检测。在此，对两种已鉴定化合物进行10个浓度点的剂量-反应检测，最高浓度为2毫摩尔，采用两倍稀释系列。通过四参数逻辑函数拟合数据，得到每种化合物的半数抑制浓度值分别为158微摩尔和193微摩尔。一旦掌握该技术，可在48小时内筛选超过3,500种化合物。观看本视频后，您应能充分掌握如何稳健地筛选干扰环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）信号通路的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）化合物。在执行该实验流程时，需注意若在多日内进行筛选，应始终保持筛选条件的一致性。在完成单点筛选后，可采用相同方案进行剂量反应筛选，以验证筛选所得的阳性结果。该技术为研究人员识别可干扰铜绿假单胞菌生物被膜形成及抗生素耐药性的潜在小分子提供了途径。重要的是，该技术可针对任何感兴趣的细菌进行适应性调整，并可修改以检测其他输出或输入参数，例如对细菌活力的影响。最后，请务必注意，操作铜绿假单胞菌可能存在生物安全风险。进行该操作时，应始终采取佩戴个人防护装备等预防措施。

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