使用工程 HEK 细胞筛选激活 MRGPRX2 的肽
2021年11月6日
介绍了通过 MRGPRX2 受体生成短肽库以激活桅杆细胞的技术。相关技术简单、便宜，可扩展到其他细胞受体。
今天，我们将演示一种筛选肽库的方法，与最近发现的主受体（即与Mas相关的G蛋白受体X2）（也称为MRGPRX2受体）相对。乳腺细胞是免疫系统不可分割的一部分，在先天和自适应免疫反应中起着至关重要的作用。桅杆细胞由抗原结合的Fc epsilon R1受体或最近发现的X2受体激活。
表面约束X2受体的激活，与多种免疫和发炎疾病有关，因此，了解该受体与其配体的结合机制非常重要。为此，我们开发了一个小型肽分子库，并筛选出它们对X2受体过度表达的异性氧化物。在这项研究中，使用简单多才多艺的阿兰宁扫描和氨基酸截断技术构建了肽库。
Heck293说，当用多肽激活时表达X2受体，而宽型六氧化硫则用作对照。在激活后的截断释放被监测，以研究基于X2的激活。实验中，Fura-2 AM 钙敏感染料的兴奋度为 340 和 380 纳米，而排放记录为 510 纳米。
钙结合后，荧光强度在340增加，而380纳米的荧光强度降低。然后，染料以340纳米的荧光强度与380纳米的荧光强度之比沉积。380比例的340，与细胞内钙的含量成正比，其价值，可以用格林凯维奇方程来计算。
检测到两种荧光强度的表率、稀释、光出血、染料泄漏和气味密度等实验因素的影响。因此，让我们毫不拖延地开始实验。通过截断 pam-12 误区中的 N 端、C 端和 N+C 端氨基酸，确定乳腺细胞 MRGPR X2 受体、发生器 N-截断、C-截断和 N+C-特伦特肽库的配体。
使用固体相肽合成合成肽。将端端端修改为设置潮汐组，将 C 端端修改为中间组。生成和丙氨酸可以肽库，通过取代各自的氨基酸的pam-12由阿兰宁，一次一个。
将端端终端修改为设置组，将 C 端端修改为中间组。通过补充高葡萄糖DMEM，用10%胎儿牛血清，2毫摩尔L-麸质胺，每毫升青霉素100单位，每毫升链霉素100微克，准备培养介质。除了发球的细胞起诉培养特征，375培养瓶在37摄氏度，5%CO2，直到他们是75至80%的汇合。
一旦75%的汇流，洗细胞，并添加两到三毫升的证明-C，以分离细胞。一旦细胞分离，收集在证明C细胞。加入六至九毫升新鲜介质。
在1620克下离心细胞三到五分钟。离心后，丢弃超高纳特收集颗粒。在新鲜培养中重新使用细胞。
根据所需的浓度稀释细胞。在200微升的细胞悬浮器中，浓度为20万个细胞，将安邦倒入每口井中，以寻求每口井4万个细胞。在37摄氏度、5%CO2的孵化器中24小时保护细胞。
使用 Fura-2 AM 染料进行实验。在 50 微克 Fura-2 AM 中加入 50 微升 DMSO，以准备富拉-2 AM 染料的一毫摩尔赤裸裸溶液。每毫升新鲜介质添加一毫摩尔Fula-2 AM染料的微升，以准备一种微摩尔染料浓度的稀释介质。
从孵化器中取出 96 井板并丢弃介质。用新鲜稀释介质替换介质。在每口井中加入200微升稀释介质。
在37摄氏度、5%CO2的孵化器中孵育细胞30-40分钟。当细胞被孵育时，设置板读取器。将温度设置为 37 摄氏度。
在设置中，选择 Flex。将阅读模式设置为荧光和底部读取。在波长中，将波长设置为 2。
将兴奋度设置为 340 纳米和 380 纳米。将排放设置为 510 纳米。将敏感性保留为默认值。
在计时中，将间隔设置为 3.9 秒。将运行时间设置为 94 秒，以获得 25 个读取数。接下来，选择检测板类型。
接下来，选择要阅读的井。在复合传输中，将传输到一个，初始卷到一百微升。将派佩特高度设置为百微升，体积设置为 50 微升，时间点设置为 36 秒以添加化合物，并倾向于读数。
接下来，选择复合源板类型。离开三叶草不使用。选择提示和派佩特提示布局。
对于复合柱和尖端柱，复合物将在复合板的第一列中转移。将提示列设置为一，将复合列设置为一。离开自动校准打开. 点击确定。孵化40分钟后，取出介质。
使用 XDB 缓冲器清洗细胞。添加一百微升 XDB 缓冲器，用于荧光读取。拿盘子读荧光。
当摄氏37度时，按阅读室，将检测板放入荧光板读卡器中。按源放置复合板。添加 200 微升受人尊敬的多肽离子体和 EGTA 来制备复合板，以转动 X 溶液。
按下小费，将提示框放入。使用黑色尖端以避免尖端自动荧光。一旦板被保留，如果你使用软件的设置和按阅读。
通过格林凯维奇方程从荧光比中确定钙浓度。显示的是pam好肽的荧光数据。可见，在36秒添加肽后，340纳米的荧光量会随着380纳米记录的减少而增加。
数据表示为 340 与 380 信号的比例。它们显示添加肽后信号增加。此图是激活肽的代表性数据。
图A显示激活肽的荧光信号。代表数据对应于补习板12肽是在创建投标周期基线后添加的，如 ado 所示。图B显示激励后荧光排放比为340纳米，激发后荧光发射比为380纳米。
此数字是空白代表数据。图 A 显示空白的荧光信号。HTB 是在稀释了 10 个喂食周期的基线后添加的，如 ado 所示。
图B显示了340纳米激发后荧光排放与380纳米激发后荧光发射的配给。此数字是染料校准标准的代表数据。图A显示，离子霉素被添加在第10读数，如ado显示，以获得最大的荧光在现金绑定状态。
EGPA 特里顿 X 百是在获得最小信号的 ado 显示的 20 读数后添加的。图B显示340纳米激发后的荧光排放与380纳米激发后的荧光排放比。这些值被进一步放在格林凯维奇方程中，以获得细胞内浓度缓存。
此图显示了代表肽的特征，以确认序列和纯度。图A显示具有代表性的肽序列WNK WAL的垂直质量为857.90染料稀释。这在质谱学中由 N 超过 Zed 比率显示。
图B显示，HPLC确认的肽纯度为99%。这种肽属于N+C截断肽库。最后，这里描述的方法是一种简单多才多艺的方法，可以高效和明亮地进行最后一次钙基筛查。
但是，有几个因素决定了数据的质量，因此，需要优化给定单元格仪器系统的构成。谢谢。
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概述
本文描述了生成一系列能够通过MRGPRX2受体激活肥大细胞的短肽库的技术。这些方法简单直接、成本效益高，并可适用于其他细胞受体。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 肽化学
背景
- 肥大细胞对免疫反应至关重要。
- MRGPRX2受体的激活与多种疾病相关。
- 理解受体-配体相互作用对于治疗开发至关重要。
- 肽库可用于探索这些相互作用。
研究目的
- 筛选肽库以识别MRGPRX2受体的激活物。
- 阐明肽与受体的结合机制。
- 为肥大细胞激活途径提供洞见。
使用的方法
- 使用丙氨酸扫描构建肽库。
- 采用氨基酸截短技术。
- 对细胞上过表达的MRGPRX2受体进行筛选。
- 评估肽-受体相互作用。
主要结果
- 鉴定有效激活MRGPRX2的肽。
- 洞见各种肽的结合亲和力。
- 展示肽库方法的多功能性。
- 理解免疫反应的潜在应用。
结论
- 该研究提供了肽库生成的框架。
- 研究结果有助于理解肥大细胞激活。
- 方法可适用于其他受体和应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of peptide ligands for MRGPRX2 is critical for advancing immune-modulating therapeutics and de-risking early discovery portfolios. The use of engineered HEK293 cells expressing MRGPRX2 enables scalable, reproducible screening that overcomes the limitations of primary mast cell systems. This approach supports predictive confidence in target validation and informs downstream assay development for immune receptor drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of MRGPRX2 ligand specificity using engineered cell models.
- Supports mechanistic de-risking by isolating receptor-ligand interactions in a controlled system.
- Facilitates functional target validation through quantitative calcium flux readouts.
- Provides a platform for portfolio triage based on ligand activity profiles.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, scalable cell-based assays for peptide library screening.
- Standardizes quantitative measurement of receptor activation via Fura-2 fluorescence ratios.
- Enables reproducible, high-throughput workflows suitable for compound evaluation.
- Supports assay transferability and platform reuse across discovery teams.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ligand identification with disease-relevant immune pathways regulated by MRGPRX2.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by confirming ligand activity in engineered systems.
- Reduces translational risk by enabling early functional characterization of candidate peptides.
Pipeline & Workflow Integration
This screening method positions engineered HEK293-MRGPRX2 assays at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and scalable compound screening.
- Discovery Biology: Quantitative calcium flux assays clarify receptor activation mechanisms and support biological de-risking.
- Screening: High-throughput, reproducible readouts enable robust comparison of peptide variants and controls.
- Analytics: Fluorescence ratio measurements and Grynkiewicz equation outputs provide standardized, quantitative data for decision-making.
- Translational Research: Functional ligand identification informs downstream disease model selection and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The platform is adaptable for other GPCR targets, supporting broader portfolio screening needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-ligand interactions and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines assay standardization, reproducibility, and scalability for peptide screening.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early, robust functional validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell engineering, peptide synthesis, and fluorescence-based assay design.
- Needs access to fluorescence plate readers and analytical infrastructure for quantitative calcium measurements.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data analysis protocols.
- May require adaptation of assay parameters for different cell lines or receptor targets.
- Data quality depends on optimization of dye loading, cell density, and minimization of artifacts such as photobleaching.
