使用工程 HEK 细胞筛选激活 MRGPRX2 的肽

今天，我们将演示一种筛选肽库的方法，与最近发现的主受体（即与Mas相关的G蛋白受体X2）（也称为MRGPRX2受体）相对。乳腺细胞是免疫系统不可分割的一部分，在先天和自适应免疫反应中起着至关重要的作用。桅杆细胞由抗原结合的Fc epsilon R1受体或最近发现的X2受体激活。

表面约束X2受体的激活，与多种免疫和发炎疾病有关，因此，了解该受体与其配体的结合机制非常重要。为此，我们开发了一个小型肽分子库，并筛选出它们对X2受体过度表达的异性氧化物。在这项研究中，使用简单多才多艺的阿兰宁扫描和氨基酸截断技术构建了肽库。

Heck293说，当用多肽激活时表达X2受体，而宽型六氧化硫则用作对照。在激活后的截断释放被监测，以研究基于X2的激活。实验中，Fura-2 AM 钙敏感染料的兴奋度为 340 和 380 纳米，而排放记录为 510 纳米。

钙结合后，荧光强度在340增加，而380纳米的荧光强度降低。然后，染料以340纳米的荧光强度与380纳米的荧光强度之比沉积。380比例的340，与细胞内钙的含量成正比，其价值，可以用格林凯维奇方程来计算。

检测到两种荧光强度的表率、稀释、光出血、染料泄漏和气味密度等实验因素的影响。因此，让我们毫不拖延地开始实验。通过截断 pam-12 误区中的 N 端、C 端和 N+C 端氨基酸，确定乳腺细胞 MRGPR X2 受体、发生器 N-截断、C-截断和 N+C-特伦特肽库的配体。

使用固体相肽合成合成肽。将端端端修改为设置潮汐组，将 C 端端修改为中间组。生成和丙氨酸可以肽库，通过取代各自的氨基酸的pam-12由阿兰宁，一次一个。

将端端终端修改为设置组，将 C 端端修改为中间组。通过补充高葡萄糖DMEM，用10%胎儿牛血清，2毫摩尔L-麸质胺，每毫升青霉素100单位，每毫升链霉素100微克，准备培养介质。除了发球的细胞起诉培养特征，375培养瓶在37摄氏度，5%CO2，直到他们是75至80%的汇合。

一旦75%的汇流，洗细胞，并添加两到三毫升的证明-C，以分离细胞。一旦细胞分离，收集在证明C细胞。加入六至九毫升新鲜介质。

在1620克下离心细胞三到五分钟。离心后，丢弃超高纳特收集颗粒。在新鲜培养中重新使用细胞。

根据所需的浓度稀释细胞。在200微升的细胞悬浮器中，浓度为20万个细胞，将安邦倒入每口井中，以寻求每口井4万个细胞。在37摄氏度、5%CO2的孵化器中24小时保护细胞。

使用 Fura-2 AM 染料进行实验。在 50 微克 Fura-2 AM 中加入 50 微升 DMSO，以准备富拉-2 AM 染料的一毫摩尔赤裸裸溶液。每毫升新鲜介质添加一毫摩尔Fula-2 AM染料的微升，以准备一种微摩尔染料浓度的稀释介质。

从孵化器中取出 96 井板并丢弃介质。用新鲜稀释介质替换介质。在每口井中加入200微升稀释介质。

在37摄氏度、5%CO2的孵化器中孵育细胞30-40分钟。当细胞被孵育时，设置板读取器。将温度设置为 37 摄氏度。

在设置中，选择 Flex。将阅读模式设置为荧光和底部读取。在波长中，将波长设置为 2。

将兴奋度设置为 340 纳米和 380 纳米。将排放设置为 510 纳米。将敏感性保留为默认值。

在计时中，将间隔设置为 3.9 秒。将运行时间设置为 94 秒，以获得 25 个读取数。接下来，选择检测板类型。

接下来，选择要阅读的井。在复合传输中，将传输到一个，初始卷到一百微升。将派佩特高度设置为百微升，体积设置为 50 微升，时间点设置为 36 秒以添加化合物，并倾向于读数。

接下来，选择复合源板类型。离开三叶草不使用。选择提示和派佩特提示布局。

对于复合柱和尖端柱，复合物将在复合板的第一列中转移。将提示列设置为一，将复合列设置为一。离开自动校准打开. 点击确定。孵化40分钟后，取出介质。

使用 XDB 缓冲器清洗细胞。添加一百微升 XDB 缓冲器，用于荧光读取。拿盘子读荧光。

当摄氏37度时，按阅读室，将检测板放入荧光板读卡器中。按源放置复合板。添加 200 微升受人尊敬的多肽离子体和 EGTA 来制备复合板，以转动 X 溶液。

按下小费，将提示框放入。使用黑色尖端以避免尖端自动荧光。一旦板被保留，如果你使用软件的设置和按阅读。

通过格林凯维奇方程从荧光比中确定钙浓度。显示的是pam好肽的荧光数据。可见，在36秒添加肽后，340纳米的荧光量会随着380纳米记录的减少而增加。

数据表示为 340 与 380 信号的比例。它们显示添加肽后信号增加。此图是激活肽的代表性数据。

图A显示激活肽的荧光信号。代表数据对应于补习板12肽是在创建投标周期基线后添加的，如 ado 所示。图B显示激励后荧光排放比为340纳米，激发后荧光发射比为380纳米。

此数字是空白代表数据。图 A 显示空白的荧光信号。HTB 是在稀释了 10 个喂食周期的基线后添加的，如 ado 所示。

图B显示了340纳米激发后荧光排放与380纳米激发后荧光发射的配给。此数字是染料校准标准的代表数据。图A显示，离子霉素被添加在第10读数，如ado显示，以获得最大的荧光在现金绑定状态。

EGPA 特里顿 X 百是在获得最小信号的 ado 显示的 20 读数后添加的。图B显示340纳米激发后的荧光排放与380纳米激发后的荧光排放比。这些值被进一步放在格林凯维奇方程中，以获得细胞内浓度缓存。

此图显示了代表肽的特征，以确认序列和纯度。图A显示具有代表性的肽序列WNK WAL的垂直质量为857.90染料稀释。这在质谱学中由 N 超过 Zed 比率显示。

图B显示，HPLC确认的肽纯度为99%。这种肽属于N+C截断肽库。最后，这里描述的方法是一种简单多才多艺的方法，可以高效和明亮地进行最后一次钙基筛查。

但是，有几个因素决定了数据的质量，因此，需要优化给定单元格仪器系统的构成。谢谢。