核酸过滤分离：一种简单快速的DNA提取方法

该FINA方法（即核酸过滤分离法，Filtration Isolation of Nucleic Acids）的总体目标是通过快速简便的方式从复杂样本中分离基因组DNA，用于PCR扩增，且无需使用离心机等实验室仪器。这种基于纸质材料的快速DNA提取方法专为HIV前病毒DNA检测而开发，可整合至定量PCR诊断装置中。该技术的主要优势在于，样品前处理模块和PCR管可预先制备，因此DNA提取过程耗时不到两分钟。

我们最初开发该方法旨在将其整合到样本中，用于通过足跟采血进行HIV-1的婴幼儿早期诊断检测。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为移除双面胶带背面（用于将细胞捕获膜固定在PCR管壁上）的操作需要一定练习。本实验操作将由我实验室的高级技术员Jen Reed进行演示。

开始此操作前，需准备用于组装 FINA 样品制备模块所需的材料。通过裁剪一块 35 毫米 × 35 毫米、厚度为 2.6 毫米的 100% 棉质垫片来制备吸水垫。准备带有纸质背衬胶带的塑料石蜡膜。

裁剪一块25 mm × 50 mm的石蜡膜，然后使用锤子在膜的中心冲出一个直径为7.14 mm的孔。使用锤子冲出一个直径为8.35 mm的圆片，制备一个固定的玻璃血液分离膜或捕获圆盘。组装FINA样本制备模块时，用镊子将捕获圆盘放置在吸水垫的中心位置。

取下石蜡膜胶带的背衬，将其覆盖在捕获圆盘上，使石蜡胶带完全露出捕获圆盘的中心区域。通过轻微拉伸石蜡胶带以覆盖印迹垫，并用力按压石蜡胶带，使其牢固粘附在圆盘四周的印迹垫上，确保圆盘与印迹垫之间最大程度贴合。需要使用直径为5.1 mm的胶带圆片，将捕获膜固定在qPCR管侧壁，以防止膜阻碍实时PCR仪的荧光检测。

使用锤子从双面涂覆的聚酯诊断胶带片材上冲压出圆形胶带片，制备该胶带圆片。用镊子移除胶带贴纸衬垫的一侧。将胶带放入一个200微升PCR管中，使其粘附在管壁一侧并靠近管底。

移除第二个贴纸衬垫。此时试管已准备好接收制备好的样本圆盘。本视频将演示从加入8e5 LAV细胞的全血中检测前病毒DNA的过程。

将先前冷冻的8e5 LAV细胞沉淀物置于冰上解冻。用冻存液对细胞进行系列稀释，浓度范围为每微升1至400个细胞。从每个稀释液中吸取10微升细胞，加入微量离心管中。

向每支试管中加入 100 微升新鲜的 HIV-1 阴性 EDTA 抗凝全血样本，以建立标准曲线。轻轻弹击试管底部五次，充分混匀。开始 DNA 提取步骤时，通过加入 Triton X-100 至终浓度为 1%，裂解血细胞。

轻轻弹击管底5次以混匀，血液应变为半透明红色。将全部血样用移液器转移至捕获圆盘上。

石蜡胶带与捕获膜之间形成防水密封，可确保血液流经膜。接触膜与吸水垫组件之间保持良好接触，可确保样本快速毛细渗透。让样本充分浸透滤膜。

血液裂解液已渗入捕获圆盘，圆盘表面呈无光泽状。将600至1,000微升10 mmol氢氧化钠逐滴加入捕获圆盘。滤膜颜色将由红色变为白色，表明血红蛋白已被清除。

接下来将滤纸片从印迹垫上分离，并将其贴附到已准备好的PCR管中的胶带上。滤纸放置到PCR管后，应立即分析样品。按照方案文本所述配制qPCR预混液，并确保滤纸片完全被预混液覆盖，且在反应过程中始终固定在管壁一侧。

使用实时PCR仪进行扩增，具体操作如方案文本所述。若无法立即进行qPCR，可将滤膜置于含有硫酸钙干燥剂的盒子中，在室温下干燥过夜。次日，盖紧PCR管，放入含硅胶干燥剂的铝箔袋中，于室温保存直至进行分析。

该方法可实现从不同拷贝数的8e5 LAV细胞中高效扩增HIV-1前病毒。实线为HIV-1阴性全血样本中分别添加4,000、400、40和10个8e5 LAV细胞后，每个反应加入500拷贝内参的四次重复扩增曲线。虚线表示阈值。

下一张图表显示了从扩增曲线计算得到的定量循环值（Cq值）与每100微升全血中8e5个LAV细胞的对数拷贝数之间的标准曲线。计算得到的PCR扩增效率为103%。HIV前病毒DNA标准曲线的重复实验也显示出高度可重复的扩增结果。

此外，内参含有500拷贝的羟基丙酮酸还原酶，表明采用该方法提取血液时，无论样本中HIV-1前病毒拷贝数如何，均不会产生PCR抑制。实线代表扩增曲线，虚线代表阈值线。通过该流程，可从多种类型的标本中扩增目标基因。

例如，用于药物基因组学筛查的口腔拭子，或用于动物模型快速基因分型的血液样本。请注意，处理血液传播性病原体可能具有极高危险性，在进行该操作时必须始终采取通用防护措施。