核酸的分离过滤:一种简单快速的DNA提取方法

这种 FINA 方法代表核酸的过滤分离，其总体目标是快速简单地从复杂标本中分离基因组 DNA 以进行 PCR 扩增，而无需使用离心机等实验室仪器。这种基于 HIV 前病毒 DNA 的快速纸质 DNA 提取方法被开发用于掺入定量 PCR 诊断设备中。该技术的主要优点是可以提前制备样品制备模块和 PCR 管，因此 DNA 提取只需不到两分钟。

我们首先开发了这种方法，将其纳入样本中，以回答从脚跟血中对 HIV-1 的早期婴儿诊断测试。通常，刚接触这种方法的人可能会很困难，因为去除将细胞捕获膜固定在 PCR 管侧面的双面胶带的背衬需要练习。演示该程序的是我实验室的高级技术人员 Jen Reed。

通过准备组装 FINA 样品制备模块所需的材料来开始此过程。通过切割 35 毫米 x 35 毫米厚的 2.6% 棉垫来准备印迹垫。用纸背带准备塑料石蜡膜。

切下一块 25 x 50 mm 的石蜡薄膜，然后用锤子在胶带中心打一个直径为 7.14 mm 的孔。用锤子冲出直径为 8.35 mm 的圆圈，准备结合的玻璃、血液分离膜或捕获盘。要组装 FINA 样品制备模块，请使用镊子将捕获盘放在印迹垫的中心。

撕下石蜡胶片胶带的基材，并将其放在捕捉光盘上，以便整个石蜡胶带使捕捉光盘的中心暴露在外。通过稍微拉伸石蜡胶带以覆盖印迹垫，然后用力按压石蜡胶带以将其粘在转印膜板所有边缘的印迹垫上，确保转盘和印迹垫之间的最大接触。需要一个 5.1 mm 的胶带转盘将捕获膜锚定到 qPCR 管的侧面，以防止膜阻挡实时荧光定量 PCR 仪器的荧光检测。

用锤子从胶带的一张上打出一圈双面聚酯诊断胶带，以准备此胶带光盘。使用镊子去除胶带贴纸衬垫的一侧。将胶带放入 200 微升 PCR 管中，将其粘在管的一侧并朝向管的底部。

取下第二个贴纸衬垫。试管现在已准备好接收准备好的光盘。本视频将演示从加标 8e5 LAV 细胞的全血中检测前病毒 DNA。

在冰上解冻先前冷冻的 8e5 LAV 细胞沉淀。在冻存培养基中制备细胞的连续稀释液，浓度范围为 1 至 400 个细胞/μL。从每种稀释液中吸取 10 微升细胞放入微量离心管中。

向每管中加入 100 μL 新鲜的 HIV-1 阴性 eDTA 处理的全血样品，以形成标准曲线。轻轻弹动试管底部 5 次，混合。要开始 DNA 提取程序，通过添加 triton X-100 至最终浓度为 1% 来裂解血细胞。

轻轻弹动试管底部 5 次，混合。血液应变为半透明的红色。将整个血液标本移液到捕获盘上。

石蜡胶带和捕获膜之间的防水密封可确保血液流过膜。接触膜和印迹垫组件之间的良好接触可确保快速吸取样品。让样品浸泡通过过滤器。

血液裂解物已渗入捕获盘中，光盘呈垫状。将 600 至 1， 000 微升 10 mmol氢氧化钠滴加到捕获盘上。过滤器将从红色变为白色，表示血红蛋白清除。

接下来，将光盘与印迹垫分开，并将光盘贴在准备好的 PCR 管中的胶带上。将过滤器放入 PCR 管后，立即分析样品。按照方案文本中的说明制备 qPCR 预混液，并确保过滤器完全被预混液覆盖，并在整个反应过程中固定在试管的侧面。

如方案文本中所述，使用实时 PCR 设备进行扩增。或者，如果无法立即进行 qPCR，则在装有硫酸钙干燥剂的盒子中将过滤器干燥过夜。第二天，将 PCR 管盖上并放入装有二氧化硅干燥剂的铝箔袋中，并在室温下储存，直至准备好进行分析。

该方法允许从 8e5 LAV 细胞中以不同拷贝数高效扩增 HIV-1 前病毒。实线是从 HIV-1 阴性全血的四个重复中获得的扩增图，其中加标了 4、000、400、40 和 10 个 8e5 LAV 细胞，每个内部对照反应有 500 个拷贝。虚线表示阈值。

下一张图显示了根据扩增曲线计算的定量循环值的标准曲线vs. log每 100 μL 全血中 8e5 LAV 细胞的拷贝数。计算的 PCR 效率为 103%HIV 前病毒 DNA 标准曲线重复也具有高度可重复的扩增。

此外，存在 500 拷贝的羟基丙酮酸还原酶的内部对照表明，使用该方法提取血液不会产生 PCR 抑制，这与存在的 HIV-1 前病毒拷贝数无关。实线表示扩增曲线，虚线表示阈值。按照此程序，可以从各种样本类型中扩增 PCR 靶标，以检测您的目标基因。

例如，用于药物遗传学筛选的脸颊拭子或用于动物模型快速基因分型的血液。不要忘记，与血源性病原体一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取普遍的预防措施。