Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Ciona 胚胎瞬时转染技术的总体目标是研究形成蝌蚪样幼虫所需的基因调控和功能，利用其不变的细胞谱系和紧凑的无脊椎动物基因组，以深入了解脊索动物的起源。这种方法可以帮助回答分子遗传学领域的关键问题，例如与干细胞研究和药物发现相关的脊索动物发育计划的保守机制。该技术的主要优点是，通过胚胎电穿孔，您可以在一天内处理数百或数千个同步胚胎。

通常，由于脆弱的胚胎的去绒毛膜，并且开发有效的显微注射技术很棘手，因此刚接触这种方法的个体会很挣扎。首先在 18 摄氏度冷却的胚胎室中解剖 Ciona 成虫。用小剪刀在虹吸管的另一端和较短的虹吸管的一侧切开一个切口，虹吸管下方是输卵管和精子管。

拉长切口以露出输卵管。然后，用剪刀的尖端在输卵管上做一个精确的切口。用闭合的剪刀轻轻按压输卵管，然后剥去鸡蛋。

让鸡蛋直接滴入含有 HEPES 的人工海水的 6 孔板中。使用用 ASWH 预冲洗的巴斯德移液管收集和转移剩余的鸡蛋。要收集精子，请用剪刀剪断精子管，然后使用单独的巴斯德移液管收集浓缩的精子，并转移到 1.5 毫升的试管中。

通过在 1.5 毫升微量离心管中混合 1 毫升 ASWH 和 50 微升 Tris 来激活精子。然后，加入 20 微升浓缩精子，盖上盖子，倒置试管或使用巴斯德移液管轻轻混合。接下来，向每个卵子孔中加入 100 至 200 微升活化的精子溶液，并通过上下吹打充分混合，使卵子漂浮在培养基中。

通过收集受精卵并将其分配到玻璃管中来开始去绒毛膜化。用手动离心机，以 1200 倍 G 的速度旋转受精卵约 20 秒，然后慢慢停止离心机。用巴斯德移液管从颗粒中取出 ASWH。

向每管中的沉淀中加入 4 毫升活化的去绒毛膜溶液。使用经过自来水处理的巴斯德移液管轻轻上下移液，顶部放一个小橡胶梨，从而悬浮受精卵。溶液应在 1 到 3 分钟后变为淡黄色。

在去绒线过程中，使用巴斯德移液管去除一小份去绒线悬浮液。将一滴滴水滴在载玻片上，并在解剖显微镜下观察。上下移液合子悬液，每 20 到 30 秒检查一次载玻片。

首先，卵泡细胞分离，然后绒毛膜变黄和不透明，最后，它与受精卵分离。粉红色的去绒毛膜受精卵会沉到玻璃管的底部。一旦超过 50% 的受精卵被去绒毛膜，就用 ASWH 填充试管。

非常轻柔地离心约 10 到 15 秒，刚好足以沉淀已分离的受精卵。慢慢停止离心机。从玻璃管中取出几乎所有液体，包括任何漂浮物，并更换为 ASWH。

缓慢上下移液洗涤，然后像以前一样轻轻离心。再次洗涤，直到没有绒毛膜碎屑。重力沉淀洗涤液，使其在硅化 1.5 毫升试管中分离

沉淀后，将 ASWH 去除至试管上的 100 微升标记。现在使用巴斯德移液器将 250 μL 先前制备的甘露醇溶液中的 DNA 添加到一管受精卵中。轻轻混合，然后立即将混合物转移到 4 mm 电穿孔比色皿中。

将比色皿放入电穿孔支架中，在 50 伏电压下发出 16 毫秒的单脉冲。然后使用相同的巴斯德移液管从比色皿中取出受精卵，并将它们排出到含有新鲜过滤的 ASWH 的培养皿中。搅拌培养皿以展开受精卵。

在 ASWH 烧杯中冲洗移液器，然后继续下一个样品。对所有受精卵进行电泳后，在 15 至 20 摄氏度下培养受精卵。在 18 摄氏度的冷却室中设置微纵器。

将塑料管和针架连接到装满矿物油的 10 毫升玻璃注射器上。用油回填管路和持针器，并排出任何气泡。插入注射针，在针架中含有 0.5 微升注射液和绿色活性染料。

并将支架放在微型纵器上。调整持针器，使其沿直线相对于表面成 45 度角移动。将去绒毛膜的鸡蛋沿凹痕定向在小琼脂糖包被的培养皿中，以便可以在解剖显微镜下逐个注射鸡蛋。

如有必要，通过将针头轻轻推向放置在琼脂糖上的玻璃盖玻片来打破针尖。轻轻按压以验证针尖是否打开。将未受精的鸡蛋逐个注射，首先将针头引入鸡蛋中，然后轻轻吸气以打破鸡蛋膜。

然后，将绿色注射液注射到鸡蛋的中间，最大注射到细胞直径的三分之一。注射完所有鸡蛋后，取出针头，将注射的未受精鸡蛋转移到新鲜的培养皿中，并在 15 至 18 摄氏度下孵育直至受精。显微注射用于研究 Ciona 肠髓鞘转录因子或 MyT 在 Ciona 胚胎原肠阶段的调节。

通过原位杂交监测，在野生型的第六行神经板前体中观察到内源性表达。显微注射吗啉代以敲低早期胚胎因子，例如转录因子 Forkhead box A，可消除整体 MyT 表达。相反，MyT 表达在淋巴结下调时异位激活，表明淋巴结通常抑制这些外侧神经脊髓前体中的 MyT 表达。

转录因子 GATAa 用 Venus 标签标记，并用 pfog 驱动器电穿孔到外胚层卵裂球中。如图所示，GATAa 主要定位于细胞核，正如转录因子所预期的那样。而 Venus 表达无处不在。

看完这个视频，您应该对如何通过电穿孔对同步的 Ciona 受精卵进行瞬时转染，如何处理脆弱的去绒毛膜胚胎，以及如何找到正确的显微注射角度有了很好的了解。经过开发，这些技术为功能基因组学铺平了道路。探索基因功能、基因调控网络和保存发育模块，这对人类的组织形成也很重要。