Name: 生理尺寸微流控培养装置中上皮细胞单层的制备和结构评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学习使用鬼笔环肽染色和共聚焦激光扫描显微镜技术，在生理尺寸微流控装置中制备和评估上皮细胞单层结构。该方法支持急性呼吸窘迫综合征和呼吸机诱导肺损伤的动态研究。

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作者感谢Alan Shepardson设计了用于微流控通道构建的3M胶粘剂和聚酯薄膜的切割图案，并测试了细胞培养基的流速和注射泵程序。本研究由NIH R01 HL0142702、NSF CBET 1706801以及Newcomb-Tulane学院院长资助项目提供资金支持。

本研究使用了NCI-H441人肺上皮细胞系（见材料表）。
1. 微流控通道中的细胞培养
<ol>
	<li>制造微流控通道，并按以下步骤进行预处理。
	<ol>
		<li>获取单通道流式阵列（参见 材料表）并将上层部分与聚碳酸酯底板分离。</li>
		<li>获取一块 #1.5 规格的矩形盖玻片（厚度 0.17 mm，尺寸为 60 mm × 22 mm）。将盖玻片置于超声波清洗仪中清洗表面，并在室温下用 0.1 mg/mL 多聚-D-赖氨酸溶液处理其中一侧 5 分钟，随后进行干燥 60 °C 30 分钟</li>
		<li>粘贴一层厚度为0.13 mm的双面胶（参见 材料表），激光切割以适配流体阵列上盖和流道的尺寸（50 mm 长，5 mm 宽），并将该膜贴合至流体阵列上盖，注意精确对齐流道的开孔位置17.</li>
		<li>粘贴一个0.1 mm厚的聚酯薄膜垫片（参见 材料列表），激光切割以适配流道阵列上部和流道的尺寸，将其粘贴至粘性胶带上，注意精确对齐通道的切口。</li>
		<li>重复步骤 1.1.3 和 1.1.4，直至达到所需通道高度（例如，对于 0.6 mm 的通道高度，使用两个垫片和三条粘性条）。</li>
		<li>将矩形盖玻片粘附于最底层的粘性带上，确保经多聚-D-赖氨酸处理的一面朝向粘性面。组装完成后，如图所示 图1，对构建物的顶部和底部施加牢固且均匀的压力，并保持1分钟。 
		注意：通道 enclosure 的构建，包括盖玻片、粘合剂、间隔物和流道阵列顶部，现已完成。</li>
		<li>使用注射器以去离子水冲洗通道，同时检查是否存在泄漏。</li>
		<li>在紫外（UV）灭菌器中对通道外壳灭菌30分钟18.</li>
		<li>使用无菌技术，用以下方法处理通道 2.0 µg/mL 人纤维连接蛋白（参见 材料表在磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育至少30分钟 37 °C19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤在微流控通道中进行细胞培养。
	<ol>
		<li>在无菌超净工作台中，使用微量移液器将含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中的NCI-H441细胞均匀悬浮液转移至目标容器（参见 材料表) 接种两个微流控通道，每个通道的细胞表面密度为150,000个细胞/cm²2.
		<ol>
			<li>对于 50 mm × 5 mm × 0.6 mm 的通道，使用 0.25 mL 的 2.5 × 106 将细胞悬液以每毫升细胞数填充至各通道及部分进样口。使用明场显微镜确认细胞在通道内分布均匀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分别在24 h和48 h培养两个通道 37 °C 含5% CO2 使用可编程注射泵（参见 材料表），从通道中抽出用过的培养基，并将新鲜培养基从无菌培养基储液池引入通道，储液池由剪开的20 mL注射器制成，开口端用石蜡膜覆盖。
		<ol>
			<li>细胞接种后静置10分钟，随后从储液器向通道内引入新鲜培养基，并以可变流速开始泵送 0.2 µL/min 并逐步增加到 10 µL/min 4小时，之后保持该速率20. 
			注意：该可变流速提供了培养条件，使细胞能够（1）在重力作用下沉降到培养表面，（2）黏附于培养表面，以及（3）形成融合的单层细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用甲醛溶液在微流控通道内进行细胞固定。 
	警告：甲醛具有毒性，必须在合适的化学通风橱中操作21.
	<ol>
		<li>在化学通风橱中，使用 PBS（无甲醇）中的 4% 甲醛配制甲醛溶液（参见 材料表) 分成两份各4 mL，第一份用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS；含Ca）稀释至1%甲醛浓度，第二份稀释至2%甲醛浓度2+ 和 Mg2+）作为稀释液。将甲醛溶液分别转移至5 mL注射器中，并做好相应标记。另取一支20 mL注射器，抽取20 mL DPBS。</li>
		<li>从培养装置上取下微流控通道，并将其放入化学通风橱中。</li>
		<li>组装固定和染色装置。
		<ol>
			<li>将一段10 cm的转接管连接至三通旋塞阀的侧端口 通过 一个雄性鲁尔锁转软管接头适配器（参见 材料表），然后将旋塞连接至流路阵列的入口端口。</li>
			<li>接下来，使用相同类型的软管接头适配器，将另一段10 cm的转移管连接到流路阵列的出口端口。</li>
			<li>最后，将两根转移管的自由端固定在适合盛装化学和生物危害性废弃物的容器中，例如已标记的空50 mL锥形离心管。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>旋转旋塞以关闭流路阵列的入口端口，并用 DPBS 冲洗废液管路。然后旋转旋塞以关闭废液管路，缓慢用 2 mL DPBS 洗涤细胞。每次更换新溶液时均重复冲洗步骤。将新溶液（或溶液的新浓度）引入通道。</li>
		<li>缓慢将2 mL的1%固定液推过通道，然后静置5分钟22.</li>
		<li>缓慢将2 mL的2%固定液推过通道，然后静置15分钟。</li>
		<li>用新鲜的DPBS缓慢向通道中加入2 mL，分三次进行（每次5分钟），以洗涤细胞。</li>
		<li>并行对两个微流控通道完成步骤1.3.3–1.3.7。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对微流控通道中的细胞进行染色、透化处理，并加入封片介质。
	<ol>
		<li>通过加入1 mg皂苷（见 材料表) 每毫升 DPBS 配制 4 mL 溶液，轻轻涡旋混匀23用20 mL注射器吸取8 mL DPBS。</li>
		<li>加入F-肌动蛋白染色试剂鬼笔环肽（phalloidin）和细胞核染色试剂Hoechst（参见 材料表将每种试剂各两滴（0.1 mL）加入 0.1% 皂苷溶液中，每毫升皂苷溶液加入两滴（0.1 mL）试剂。用铝箔包裹避光保存制备好的染色/透化溶液24.</li>
		<li>用少量染色/透化溶液（如步骤1.3.4所述）冲洗通道，然后向微流控通道中加入2 mL该溶液，并用铝箔覆盖通道，室温静置30 min。</li>
		<li>用 2 mL DPBS 冲洗染色/透化溶液，每次冲洗 5 分钟，重复两次。</li>
		<li>为获得更佳的图像质量，添加一种合适的封片介质（其折射率应与显微镜物镜油和盖玻片相近，参见 材料表) 注入通道。
		<ol>
			<li>使用微量移液器，向微流控通道的每个端口加入极少量的软固化抗荧光淬灭封片剂，确保底部表面完全覆盖，并且目标成像区域内无气泡残留25密封通道两端，并在明场显微镜下观察以验证细胞层的完整性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>并行对两个微流控通道完成步骤1.4.3至1.4.5。 
		注意：染色后应尽快成像，以获得最佳图像质量。若出现光漂白或需要长期保存样本，可使用具有抗淬灭或样本保存特性的其他封片剂。请注意，固化后较硬的封片剂会扭曲细胞的三维结构，进而影响细胞层的整体结构；因此，建议优先使用固化后较软的封片剂。26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤对微流控通道中的细胞进行成像。
	<ol>
		<li>调整共聚焦显微镜（参见 材料表) 设置，包括激光功率、增益、偏移，以及扫描速度、扫描区域、扫描格式、分辨率和针孔直径等扫描参数27.</li>
		<li>通过采集参考扫描图像和Z轴堆栈图像来测试成像位置，直至达到理想的图像参数和条件。依次使用更高倍率的物镜调整参数，直至达到40倍油镜物镜并完成优化。28.</li>
		<li>以流路阵列基板为参照，在五个位置构建Z轴堆栈：第一个电极（入口侧）的预期位置、中心与前一位置之间的中点、中心位置、中心与最后一个电极（出口侧）位置之间的中点，以及最后一个电极的位置，如图所示。 图2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行图像处理和数据分析。
	<ol>
		<li>使用共聚焦显微镜软件包导出XZ和YZ截面（参见 材料表).</li>
		<li>使用图像处理软件（参见 材料表) 并启用边缘检测功能（阈值为 15.0），使用 魔棒工具 图像之外，然后通过使用像素来排除细胞层的总横截面积 魔棒工具 细胞层外部的图像区域29.</li>
		<li>使用数据处理软件（参见 材料表），用总面积像素值减去外部区域像素值，得到横截面积像素值。</li>
		<li>将横截面积的像素值转换为 µm2 通过将像素值乘以平方的像素值 µm/pixel 值，由显微镜软件针对特定图像所示（0.31 µm/pixel 表示使用40倍油镜、无缩放、以1024p分辨率采集的Z轴层扫图像。</li>
		<li>计算数据的平均值和标准差，并绘制结果图表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="带有粘合条和垫片的微流控通道示意图；通道尺寸为50×5×0.6 mm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64148/64148fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：微流控通道结构的分解示意图。 顶部元件为流体阵列的上部，灰色薄片为粘合条，蓝色薄片为聚酯薄膜垫片，底部元件为矩形盖玻片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64148/64148fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微流控通道示意图；入口、中心、出口位置；流体动力学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64148/64148fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：沿微流控培养通道稳定分层区域的五个成像位置。 成像位置如下：靠近完整流控阵列上第一个电极位置的入口侧；入口侧位置与通道中心之间的中点；通道中心；通道中心与出口侧位置之间的中点；以及靠近完整流控阵列上最后一个电极位置的出口侧。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64148/64148fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 八孔腔室盖玻片中的细胞培养
<ol>
	<li>对八孔腔室盖玻片进行预处理。
	<ol>
		<li>获取一个无菌的八孔腔室盖玻片，其由#1.5盖玻片制成，并经过促进细胞黏附的表面处理（图3，参见材料表）。</li>
		<li>采用无菌操作技术，用含2.0 µg/mL人纤维连接蛋白的PBS溶液处理培养孔表面，在37 °C下孵育至少30分钟19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在腔室盖玻片中进行细胞培养，步骤如下。
	<ol>
		<li>在无菌超净工作台中，将NCI-H441细胞以RPMI 1640培养基（含10% FBS）均匀悬浮后，按81,000、162,000和324,000个细胞/mL的体积密度，分别取0.5 mL加入各培养孔中，使接种密度分别为45,000、90,000和180,000个细胞/cm2。使用明场显微镜确认细胞在孔内分布均匀。</li>
		<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养24小时、48小时和96小时，每天更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在八孔腔室盖玻片中进行甲醛固定。 
	注意：甲醛具有毒性，必须在合适的化学通风橱中操作21。
	<ol>
		<li>在化学通风橱中，用PBS（无甲醇）配制两份4%甲醛溶液，分别用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS；含Ca2+和Mg2+）稀释为1%和2%的甲醛溶液。</li>
		<li>将八孔腔室培养盖玻片从培养箱中取出，放入化学通风橱中。</li>
		<li>使用移液器沿每个孔的角落上部缓慢加入0.5 mL DPBS，轻柔洗涤细胞。</li>
		<li>使用移液器从孔的角落缓慢吸出原有液体。采用液体加入方法（步骤2.3.3），向每个孔中加入0.5 mL 1%固定液，静置5分钟22。</li>
		<li>采用步骤2.3.4所述的液体吸取方法，去除各孔中的原有液体。再采用步骤2.3.3所述的液体加入方法，向每个孔中加入0.5 mL 2%固定液，静置15分钟。</li>
		<li>采用液体加入和吸取方法（步骤2.3.3和2.3.4），在每个孔中分别加入并移除0.5 mL新鲜DPBS，重复三次，每次5分钟，以洗涤细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在八孔腔室盖玻片中进行染色、通透及封片剂添加。
	<ol>
		<li>通过将每毫升DPBS中加入1 mg皂苷，轻轻涡旋混匀，配制0.1%皂苷溶液23。</li>
		<li>向0.1%皂苷溶液中，每毫升加入两滴（0.1 mL）F-肌动蛋白染色鬼笔环肽试剂和两滴（0.1 mL）细胞核染色Hoechst试剂。用铝箔包裹避光保存所配制的溶液24。</li>
		<li>向每个孔中加入0.2 mL染色/通透溶液，并用铝箔覆盖腔室盖玻片，室温静置30分钟。</li>
		<li>用0.5 mL DPBS冲洗染色/通透溶液两次。</li>
		<li>为获得更佳的成像质量，向孔中加入合适的封片剂（其折射率应与显微镜物镜油和盖玻片尽可能匹配）。
		<ol>
			<li>使用移液器向每个孔中加入少量软固化抗荧光淬灭封片剂，确保底部表面完全覆盖，且目标成像区域内无气泡产生25。在明场显微镜下观察，确认细胞层完整性。 
			注：染色后应尽快成像以获得最佳图像质量。若发生光漂白或需要长期保存，可使用具有抗荧光淬灭或样品保存特性的其他封片剂。请注意，硬固化封片剂会扭曲细胞的三维结构，进而影响细胞层形态，因此推荐使用软固化封片剂26。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在八孔腔室盖玻片中进行成像。
	<ol>
		<li>调整共聚焦显微镜设置，包括激光功率、增益、偏移量，以及扫描速度、扫描区域、扫描格式、分辨率和针孔直径等扫描参数27。</li>
		<li>通过采集参考扫描图像及Z轴层扫图像，测试成像位置，直至达到理想的图像参数和条件。逐步使用更高倍数的物镜优化参数，直至40倍油镜达到并完成优化28。</li>
		<li>对每种接种密度与培养时间组合，构建三个随机位置的Z轴层扫图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行图像处理与数据分析。
	<ol>
		<li>使用共聚焦显微镜软件包导出XZ和YZ截面图像。</li>
		<li>使用具备边缘检测功能（阈值设为15.0）的图像处理软件，先在图像外部使用魔棒工具测量总图像面积（像素），再在细胞层外部区域使用魔棒工具测量扣除细胞层总截面积后的像素面积29。</li>
		<li>使用数据处理软件，将外部区域像素值从总面积像素值中减去，得到截面区域的像素值。</li>
		<li>将截面区域像素值转换为µm2：将像素值乘以显微镜软件中对应图像的µm/像素值的平方（例如，使用40倍油镜在1024p分辨率下无缩放采集的Z轴层扫图像，其µm/像素值为0.31 µm/像素）。</li>
		<li>计算均值和标准差，并绘制结果图表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="用于显微镜实验、细胞培养设置示意图的8孔板载玻片示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64148/64148fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：用于固定孔培养、染色和成像实验的八孔板载玻片示意图，该实验比较了初始细胞接种密度和培养时间对细胞层形成的影响。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64148/64148fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了在单通道微流控流动阵列的动态环境以及传统八孔腔室盖玻片的静态环境中，培养、交联固定、染色、通透化及共聚焦显微镜下可视化 NCI-H441 人肺上皮细胞的方法。在任何微流控细胞培养方案中，细胞培养基的流动条件都至关重要，因为高流速可能导致细胞被冲走，或干扰细胞单层的正常形成；而低流速则可能由于微流控通道的不可渗透特性及流动特性所导致的扩散限制，使细胞层因营养和氧气供应不足而“饥饿”或“窒息”30。通过首先设置10分钟的静置期（在此期间细胞仍悬浮于最初填充通道的培养基中），随后将流速逐步提升至0.2 µL/min，最终在4小时内逐步增加至10 µL/min，从而在促进细胞贴附与维持细胞存活之间实现平衡。
该方案中的另一个关键步骤是微流控通道的正确制备，包括构建和预处理。必须小心确保盖玻片正确安装到腔室结构上，以避免泄漏和潜在污染。正确固定盖玻片对于保证通道高度在不同构建单元的连续实验中保持一致且可准确重复也十分必要。由于所用粘合胶带的厚度公差及其相对可压缩性，可能会引入微小的变异。尽量减少任何变异将有助于提高实验结果的一致性。...

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种由于肺实质受损并导致损伤扩散而引发的急性疾病，其结果是肺泡出现肺水肿、气体交换不足以及继发性低氧血症1。这会启动一个促炎性细胞因子释放、中性粒细胞募集、毒性介质释放和组织损伤的循环过程，而这些损伤本身又会引发进一步的炎症反应2。此外，在ARDS期间发生的化学反应可能会使肺表面活性物质失活或功能受损，而肺表面活性物质本应起到稳定气道、防止因反复开放与塌陷（R/D）所造成损伤的作用，其功能障碍将导致周围肺实质承受进一步的应激与损伤3。当损伤达到一定程度时，可能需要机械通气以维持足够的全身氧合4。然而，机械通气本身也带来一系列挑战和创伤，包括可能导致呼吸机相关性肺损伤（VILI），其特征是由于过度膨胀（容积伤）和/或液体阻塞气道中气-液界面反复开放与塌陷（萎陷伤）所施加的机械应力，造成肺实质损伤5。在萎陷伤模型中，暴露于气-液界面（如液体阻塞的细支气管）的上皮细胞所经历的压力梯度，可能引发一种源于通透性改变的阻塞性反应（POOR），从而导致“越差越糟”（POOR-get-POORer）的恶性损伤循环6,7,8。
体外 实验可为这些现象提供微尺度层面的深入认识，但目前在具有生理相关尺寸的微流控通道环境中开展的研究仍面临多项挑战9。首先，优化细胞培养条件是微流控环境中开展细胞培养研究的一大障碍，因为只有在培养基流动参数、培养时间及其他培养条件处于一个较窄的交集范围内时，才能实现细胞层的最佳形成。这其中包括由微流控培养通道封装材料对氧气不透性所带来的扩散限制。因此，必须仔细考虑培养基的流动参数：过低的流速可能导致细胞缺氧，尤其是距离入口最远的细胞；而过高的流速则可能将细胞冲出培养通道，或导致细胞层发育不充分或不均匀。通过在气液界面（ALI）培养装置中使用透氧材料（如聚二甲基硅氧烷，PDMS），可在一定程度上缓解扩散限制；然而，许多传统的微流控培养通道（例如电阻抗检测细胞附着系统（ECIS）中的通道）由于其封装结构本身的特性，本质上是不透氧的10。本实验方案旨在提供一种用于分析在不透氧封装环境中培养的细胞层的技术方法。
在比较不同培养条件的细胞存活能力时，必须观察特定的细胞层特征，例如是否存在单层结构、表面拓扑形态、融合度以及层厚均匀性，以确定特定培养条件下生成的细胞层是否符合预期的技术要求，并与实验设计相关。可通过诸如ECIS（细胞外电容抗测量）等方法进行有限评估，该方法利用施加于培养在流动阵列金电极上的细胞绝缘膜的高频交流电（AC）所产生的电阻（即阻抗）所形成的电势（电压）变化进行测量。通过调节施加于细胞的交流电频率，可针对性地检测和分析细胞及细胞层的特定频率依赖性特性，如表面黏附强度、紧密连接形成情况以及细胞增殖或融合状态11。然而，这类间接测量方法在实验初期较难解释，且可能无法量化细胞层的所有相关特性。在相差显微镜下直接观察细胞层虽可揭示某些特性（如融合度）的本质，但许多关键特征（例如是否存在单层结构及层厚是否均匀）需要三维（3D）评估，而明场、相差或荧光显微成像技术无法实现这一目标12。
本研究的目的是开发一种丝状肌动蛋白（F-actin）染色技术，以通过成像手段验证单层细胞的存在，并利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估细胞层的均匀性。选择丝状肌动蛋白（F-actin）作为荧光染料偶联物的靶标，部分原因是F-actin紧密沿细胞膜分布，能够直观地近似显示整个细胞体积13。靶向F-actin的另一个重要优势在于，其染色结果能够直观揭示由细胞所受应力和应变引起的细胞骨架破坏或改变。采用不含甲醇的甲醛进行交联固定，以保持细胞及细胞层的形态结构，因为甲醇等脱水性固定剂往往会使细胞变扁平，严重扭曲细胞层并改变其特性14,15。
为了评估层状结构评价技术克服这些挑战的能力，将细胞分别在传统的八孔培养腔以及微流控通道中进行培养，以评估所形成的细胞层之间是否存在差异。对于固定式培养孔，采用八孔板载玻片培养单元。对于微流控培养，则优化了流体阵列（通道长度50 mm，宽度5 mm，深度0.6 mm），用于在与人类肺部呼吸区终末细支气管生理尺寸相关的环境中培养永生化人肺上皮细胞（NCI-H441）16。尽管本实验方案是基于ECIS流体阵列的培养环境设计的，但它也可适用于任何需要评估培养细胞层特性或培养条件的氧气不可渗透的动态培养环境。

<table><tbody><tr><td>A1R HD25 共聚焦显微镜系统</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.&lt;br/&gt; com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes 试剂（AlexaFluor 488 鬼笔环肽）</td><td>Invitrogen</td><td>R37110</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td></tr><tr><td>双衬垫压敏胶带</td><td>3M</td><td>468MP</td><td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td></tr><tr><td>Air-Tite&amp;nbsp;HSW Soft-Ject 一次性注射器</td><td>Air-Tite RL5</td><td>14-817-53</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml</td></tr><tr><td>BAISDY 4 密耳（0.1 毫米）厚 Mylar 片材</td><td>BAISDY</td><td>AS022</td><td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics&amp;nbsp;M 系列超声波清洗浴</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>15-336-100</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;人纤维连接蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40008</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true</td></tr><tr><td>含钙、镁的 DPBS</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133</td></tr><tr><td>ECIS 培养皿一次性电极阵列 8 x 10 ECIS 流动阵列</td><td>Applied BioPhysics</td><td>1F8x10E PC</td><td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td></tr><tr><td>Enterprise Technology Solutions 紫外线灭菌柜，白色</td><td>Enterprise Technology Solutions</td><td>50-211-1163</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079</td></tr><tr><td>Finnpipette F2 可调体积移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td></tr><tr><td>Fisherbrand 50 mL 易读塑料离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-21</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;盖玻片：矩形（#1.5）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-GP</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;一次性无菌注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458</td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td></tr><tr><td>Image-iT 固定液（4% 甲醛，无甲醇）</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td>ImageJ</td><td>ImageJ Fiji</td><td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>浸油 F 30 cc</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.&lt;br/&gt; com/products/accessories/immersion-oil/specifications</td></tr><tr><td>大容量立式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;培养箱，821 L，抛光不锈钢</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td></tr><tr><td>Laxco LMC-3000 系列明场复合显微镜系统</td><td>Laxco</td><td>LMC3BF1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td></tr><tr><td>Masterflex 接头，尼龙，直型，雄性鲁尔锁扣转软管接头，内径 1/16"；25 个/包</td><td>Masterflex</td><td>ZY-45505-31</td><td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;&lt;br/&gt; gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC&lt;br/&gt; UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k&lt;br/&gt; pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0&lt;br/&gt; udmwaAuDHEALw_wcB</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>0016</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td></tr><tr><td>National Target 全塑料一次性注射器</td><td>Thermo Scientific</td><td>03-377-24</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td></tr><tr><td>NCI-H441 人肺上皮细胞</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-174</td><td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td></tr><tr><td>NE-1600 六通道可编程注射泵</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-1600</td><td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements AR</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.&lt;br/&gt; com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 试剂（Hoechst 33342）</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 带腔室盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361</td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37441</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441</td></tr><tr><td>PendoTech 三通旋塞阀，聚砜材质，雄性/雌性鲁尔接口 × 雌性鲁尔支路</td><td>PendoTech</td><td>ZY-19406-49</td><td>https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Gibco</td><td>A3890401</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401</td></tr><tr><td>Reynolds 铝箔卷</td><td>Reynolds</td><td>458742928317</td><td>https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Millipore Sigma (Sigma Aldrich)</td><td>47036</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036</td></tr><tr><td>SlowFade Glass Soft-set 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>S36917-5X2ML</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 1300 系列 II 级 A2 型生物安全柜套装</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-100-752PM</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood</td></tr><tr><td>Tygon 传输软管，BioPharm 铂金硫化硅胶，内径 1/16" × 外径 1/8"；50 英尺</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01</td></tr></tbody></table>

生理尺寸微流控培养装置中上皮细胞单层的制备与结构评估

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

体外微流控实验在揭示急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和呼吸机相关性肺损伤（VILI）等疾病中发生的微生理现象方面具有巨大潜力。然而，目前在尺寸上与人类肺部终末细支气管生理条件相关的微流控通道中开展研究仍面临诸多挑战，尤其难以在特定培养环境中建立合适的细胞培养条件，例如培养基流速的控制。本方案介绍了一种基于成像的方法，用于评估在氧不可渗透、且尺寸与人类肺部终末细支气管生理条件相关的微流控通道中培养的NCI-H441人肺上皮细胞的结构。通过基于鬼笔环肽的丝状肌动蛋白（F-actin）染色，利用共聚焦激光扫描显微镜揭示细胞的细胞骨架结构，从而实现对单个细胞以及多层细胞的可视化观察。随后进行定量分析，以判断所采用的细胞培养条件是否形成了适合进一步实验的均一单层细胞。该方案详细描述了在微流控通道和传统固定孔板环境中进行细胞培养及细胞层评估的方法，包括通道构建、细胞培养及其必要条件、固定、通透化与染色、共聚焦显微成像、图像处理和数据分析。

本方法可用于可视化在微流控培养通道中培养的上皮细胞层，并通过在传统固定孔板细胞培养环境中的演示作为验证。所获得的图像在质量、信号强度和细胞靶标特异性方面会存在不同程度的差异。成功的图像应具有高对比度，可用于图像分析和数据量化，进而进行后续的统计学评估。失败的图像则会显得昏暗、模糊或不清晰，无法用于主观或定量评估。部分图像可能适用于主观判断细胞层特征，但仍不足以满足定量分析的质量要求。因此，实验操作过程中对本方案的遵循程度和操作细致程度将直接影响所得图像是否适合作为统计分析的数据来源。
图4 代表了该技术在微流控动态培养环境中的成功应用，并展示了两个微流控装置入口和出口处的图像采集结果。 图4A，B 提供培养 24 h 的细胞层示例，以及 图4C，D 展示了培养48小时的细胞层示例。 图5</str...

本方案介绍了一种基于鬼笔环肽的丝状肌动蛋白染色技术，并结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），用于观察微流控动态培养通道以及传统固定孔静态培养腔室中贴壁细胞层的结构。该方法有助于评估细胞层的融合度、单层形成情况以及层厚的均匀性。

体外微流控实验在揭示诸如……等条件下发生的微生理现象方面具有巨大潜力

本方案旨在降低细胞培养实验的入门门槛，使研究人员能够评估和表征在动态微流控环境中培养的贴壁细胞单层。该技术的主要优势在于，可对细胞单层特性进行定性和定量评价，为后续依赖于单层细胞的实验提供基础。本方法能够在体外重现肺泡上皮结构，从而可用于探索急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以及呼吸机相关性肺损伤（VILI）过程中的动态响应。首先，获取一个单通道流控阵列。在超声波清洗仪中清洗盖玻片表面。将盖玻片在室温下浸入聚-D-赖氨酸溶液中五分钟。然后在 60 °C 下干燥 30 分钟。接着，在 Mylar 间隔片上粘贴双面胶带。按照文稿中所述方法对盖玻片进行激光切割，并确保通道切口精确对齐。将矩形盖玻片贴附到底部最外侧的粘性胶带上。使用已剥离的粘性纸覆盖仍暴露的胶带部分。组装完成后，对整体结构施加均匀且稳固的压力。使用装有去离子水的注射器冲洗通道。将通道腔室置于紫外灭菌器中灭菌30分钟。采用无菌操作技术，用PBS配制的人纤连蛋白溶液处理通道，并在37摄氏度下孵育至少30分钟。在无菌超净工作台中，使用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基制备 NCI H441 细胞悬液。取 0.25 毫升该细胞悬液填充通道及部分进样口。利用明场显微镜观察，确认细胞已在通道内均匀分布。将培养基储液槽和旋塞阀连接至通道。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下开始培养通道。使用可编程注射泵，从通道中抽出废培养基，并将无菌培养基储液槽中的新鲜培养基通过通道入口注入通道。在化学通风橱中，将4%甲醛溶液用DPBS稀释，配制1%溶液，并储存于适当标记的离心管中。以类似方法配制2%甲醛溶液。将甲醛溶液转移至适当标记的5毫升注射器中。用一个独立的20毫升注射器吸取20毫升DPBS，用于后续洗涤步骤。接着，将微流控通道从培养装置中取出，并固定在化学通风橱中。为组装固定和染色装置，使用公型鲁尔锁扣转软管接头，将一段转移软管连接至三通旋塞阀的侧端口。然后将旋塞阀连接到流路阵列的入口端口。使用相同类型的软管接头，将另一段转移管连接到现有旋塞阀的出口端口。最后，将现在指定为废液管的两段转移管的自由端固定到适合盛装化学和生物危害性废弃物的废液容器中。确保旋塞关闭流路阵列的入口端口，并用DPBS冲洗废液管路。然后旋转旋塞以关闭废液管路，缓慢用2 mL DPBS洗涤细胞。再缓慢将2 mL 1%固定剂推过通道。静置5分钟，随后用2%固定剂重复处理。然后用新鲜的DPBS洗涤细胞三次，操作如前所述。按照文稿中的描述配制0.1%皂苷溶液。用20毫升注射器吸取额外的DPBS，用于后续洗涤步骤。用铝箔将试管包裹。向0.1%皂苷溶液中加入丝状肌动蛋白染色试剂鬼笔环肽（phalloidin）和细胞核染色试剂Hoechst。然后将溶液转移至用铝箔包裹的注射器中。用少量透化和染色溶液冲洗废液管路。随后向微流控通道中加入两毫升该溶液。用铝箔覆盖通道以避光。30分钟后，用两毫升DPBS冲洗通透溶液，每次5分钟，重复两次，然后轻轻干燥通道。使用微量移液器向微流控通道中加入少量软固化抗荧光淬灭封片剂，确保完全覆盖底部表面。然后将通道末端密封。使用明场显微镜快速验证细胞层的完整性，再将通道放入容器中避光保存。通过采集参考扫描图像和z轴层扫图像，测试成像位置，直至达到理想的成像参数和条件。以流道阵列基板为参考，在通道长度方向上的多个位置构建z轴层扫图像。最后，分析横截面数据、深度图数据以及任何其他相关特征，以评估细胞层的特性。该技术的成功应用可通过在距离入口和出口至少一厘米处的微流控动态培养环境中进行图像采集得以证明。在一次典型的培养时间实验中，当细胞培养24小时时，观察到成功的单层形成。然而，当培养时间延长至48小时时，则出现了不理想的多层结构。从五个微流控通道成像位置收集的数据还揭示了培养时间延长与横截面积增加之间的关系，表明在48小时内即可能发生不均匀的层状形成或过度生长。获得了微流控通道中央位置在培养24小时后的深度图，该图可用于对细胞层特征进行定性评估。本方案最关键的三个方面是：正确的通道构建、精确的培养与培养基流动条件，以及固定和染色装置的谨慎使用。在完成此操作后，可并行采用其他方法来验证所生成细胞单层的实验可行性，例如细胞电子基底阻抗传感（ECIS）或跨上皮电阻（TEER）。

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生物工程

生理尺寸微流控培养装置中上皮细胞单层的制备和结构评价

我们描述了一种用于制备微流控装置的方案，该装置可实现细胞捕获与培养。在此方法中，通过在微流控通道内设计具有特定图案的微结构（如沟槽），以形成低剪切应力区域，从而使细胞能够在其中停靠。...

一种带沟槽图案的微流控装置用于研究细胞行为

本方案描述了一种用于上皮细胞与细菌同时且局部共培养的微流控共培养模型。该模型可用于研究不同可溶性分子信号在发病机制中的作用，以及筛选潜在益生菌菌株的有效性。...

用于研究可溶性信号介导相互作用的上皮细胞与细菌微流控共培养

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。...

用于力学动态细胞培养的微加工平台

本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。...

在细胞外基质中构建三维上皮组织

三维（3D）细胞系统是研究器官发生的相关模型。本文提出一种基于水凝胶的胆管囊泡生成及其表征方法。该方案克服了三维结构表征的障碍，提供了一种简单且可靠的方法，用于评估囊泡形成效率、尺寸大小及其功能特性。...

功能性极化胆管上皮囊泡的生成与定量表征

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。...

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

本方案描述了开放式顶盖器官芯片（Open-Top Organ-Chip）的功能及其建立和成熟原代组织（皮肤、肺泡、气道和肠道）全层器官芯片培养所需的关键培养模式，为研究人类上皮/间充质与血管微环境界面的多种功能特性提供了机会。 体外.

在开放式器官芯片上重建人类上皮组织的细胞结构与功能

使用微尺度屏障组织平台（MicroSiM, µSiM）构建血脑屏障模型

本方案描述了一种可重构的基于膜的细胞培养平台，该平台将开放式孔板格式与流体流动功能相结合。该平台与标准操作流程兼容，能够在开放式孔板和微流控培养模式之间进行可逆转换，满足工程学与生物科学实验室的不同需求。...

将静态屏障组织模型转化为动态微生理系统

在此，我们展示了在基于纳米纤维膜的双层系统中与成纤维细胞共培养的上皮细胞能够稳定地黏附于膜上并生长。...

利用纳米纤维膜建立上皮细胞三维共培养模块

本文介绍一种用于构建独特双层微流控装置的实验方案，以研究上皮组织稳态的电机械调控机制。该装置可施加垂直于组织平面的静态生理性电流，影响细胞间黏附、增殖及细胞挤出过程。通过活细胞成像和机械应力测量，揭示这些生物学过程的作用机制。...

利用双层微流控装置揭示电机械调控在组织稳态中的作用

学习使用鬼笔环肽染色和共聚焦激光扫描显微镜技术，在生理尺寸微流控装置中制备和评估上皮细胞单层结构。该方法支持急性呼吸窘迫综合征和呼吸机诱导肺损伤的动态研究。

生理尺寸微流控培养装置中上皮细胞单层的制备与结构评估

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