生理尺寸微流控培养装置中上皮细胞单层的制备和结构评价
July 1st, 2022
所提出的协议描述了基于鬼笔环肽的丝状肌动蛋白染色技术的开发和使用，该技术与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）一起可视化微流体动态培养通道和传统固定孔静态培养室中的贴壁细胞层结构。这种方法有助于评估细胞层融合度、单层形成和层厚均匀性。
该协议有助于降低细胞培养实验的进入门槛，并使研究人员能够评估和表征在动态微流体环境中培养的贴壁细胞单层。该技术的主要优点是它能够对细胞单层特征进行定性和定量评估，作为进一步单层依赖性实验的基础。该方法能够在体外重现肺泡上皮，从而可以探索急性呼吸窘迫综合征ARDS以及呼吸机诱导的肺损伤VILI期间的动态反应。
首先，获取单通道流阵列。在超声波浴中清洁盖玻片表面。将盖玻片在室温下浸入聚-d-赖氨酸中五分钟。
然后在60摄氏度下干燥30分钟。接下来，在聚酯薄膜垫片中粘贴双面粘合剂。按照手稿中的描述对盖玻片进行激光切割，并确保通道切口精确对齐。
将矩形盖玻片贴在最底部的胶带上。使用剥落的胶纸覆盖仍然暴露的粘合剂部分。组装完成后，对结构施加牢固且相等的压力。
使用装满去离子水的注射器冲洗通道。在紫外线消毒器中对通道外壳进行消毒 30 分钟。使用无菌技术，用PBS中制备的人纤连蛋白溶液处理通道，并在37摄氏度下孵育至少30分钟。
在无菌层流罩中，使用含有10%FBS的RPMI 1640培养基制备NCI H441细胞悬液。使用0.25毫升这种细胞悬浮液填充通道和部分端口。使用明场显微镜，验证细胞是否均匀分布在通道内。
将介质储液罐和旋塞阀添加到通道中。开始在37摄氏度下用5%的二氧化碳培养通道。使用可编程注射泵将用过的培养基从通道中抽出，并将新鲜培养基从连接到通道入口的无菌培养基储液器吸入通道。
在化学通风橱中，将4%的甲醛溶液稀释到DPBS中以产生1%的溶液并储存在适当标记的管中。以类似的方式制备2%甲醛溶液。将甲醛溶液转移到适当标记的五毫升注射器中。
将20毫升DPBS吸入单独的20毫升注射器中，该注射器将用于洗涤步骤。接下来，从培养装置中取出微流体通道并将其固定在化学通风橱中。要组装固定和染色设备，请通过公鲁尔锁连接到软管倒钩适配器将一段转移管连接到三通旋塞阀的侧端口。
然后将旋塞阀连接到流阵列的入口端口。使用相同类型的软管倒钩适配器将另一段传输管连接到现有旋塞阀的出口端口。最后，将现在指定为废物管线的两个传输管的自由端固定到化学和生物危害适当的废物容器中。
确保旋塞阀堵塞了流阵列入口，并用 DPBS 冲洗废物管路。然后转动旋塞阀以阻塞废物管，并用两毫升DPBS慢慢清洗细胞。慢慢地将两毫升1%的固定剂推入通道。
静置五分钟，然后用2%固定剂重复。然后如前所述，用新鲜的DPBS洗涤细胞三次。按照手稿中的说明制备0.1%皂苷溶液。
将额外的DPBS吸入20毫升注射器中，用于洗涤步骤。用铝箔盖住管子。将丝状肌动蛋白染笔环肽试剂和细胞核染色Hoechst试剂加入0.1%皂苷溶液中。
然后将溶液转移到箔纸覆盖的注射器中。用少量透化和染色溶液冲洗废物管路。然后将两毫升溶液引入微流体通道。
用铝箔覆盖通道以阻挡光线。30分钟后，用两毫升DPBS冲洗出透化溶液两次，每次五分钟，然后轻轻干燥通道。使用微量移液器，向微流体通道引入最少量的软固型防褪色封片剂，确保完全覆盖底面。
然后将末端密封到通道上。使用明场显微镜，快速验证细胞层的完整性，然后将通道存放在容器中以保护其免受光照。通过进行参考扫描和z-stack来测试成像位置，直到满足所需的图像参数和条件。
使用流阵列底板作为参考，沿通道长度在不同位置构建z堆栈。最后，分析横截面数据、深度图数据和任何其他相关特征以评估细胞层特性。该技术的成功使用在微流体动态培养环境中通过距离入口和出口至少一厘米的图像采集得到证明。
在代表性培养持续时间实验中，当细胞培养24小时时，观察到成功的单层生产。然而，当培养48小时时，观察到不希望的多层形成。从五个微流体通道成像位置中的每一个收集的数据还揭示了培养持续时间增加与横截面积增加之间的关系，表明培养后48小时内发生不均匀的层形成或过度生长。
获得了培养24小时的微流体通道内中心位置的深度图，这对于层特性的定性评估很有用。该协议的三个最关键方面是适当的通道构建，准确的培养和培养基流条件以及小心使用固定和染色设备。在此过程之后，可以并行使用其他方法来验证产生的细胞单层的实验活力，例如电池 - 基板阻抗传感，ECIS或跨上皮电阻，TEER。
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概述
本协议描述了一种基于菸酰胺的染色技术，用于使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可视化粘附细胞层。它有助于评估微流控和静态培养环境中的细胞层融合度和均匀性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 微流控
背景
- 细胞培养实验对各种生物学研究至关重要。
- 动态微流控环境可以更好地模拟生理条件。
- 评估细胞单层对于理解细胞反应至关重要。
- 该方法有助于研究ARDS和VILI等条件。
研究目的
- 降低细胞培养实验中研究人员的门槛。
- 实现细胞单层的定性和定量评估。
- 促进进一步依赖于单层的实验。
使用的方法
- 菸酰胺染色用于丝状-肌动蛋白可视化。
- 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）用于成像。
- 使用单通道流动阵列进行动态培养。
- 用多聚-d-赖氨酸处理盖玻片以促进细胞粘附。
主要结果
- 成功可视化不同培养条件下的粘附细胞层。
- 评估细胞层的融合度和厚度均匀性。
- 洞察急性呼吸道疾病期间的细胞反应。
- 建立了一种可靠的方法用于体外研究肺泡上皮。
结论
- 该技术为细胞培养研究提供了一个稳健的框架。
- 它增强了对动态环境中细胞行为的理解。
- 该方法适用于各种生物学研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Establishing uniform epithelial cell monolayers in physiologically relevant microfluidic devices is critical for predictive modeling of lung barrier function and injury mechanisms. This protocol enables quantitative and qualitative assessment of monolayer integrity, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in respiratory disease research. Reliable monolayer evaluation underpins translational continuity from discovery through preclinical model development for conditions such as ARDS and VILI.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous assessment of epithelial barrier formation in microphysiological systems.
- Supports mechanistic de-risking by confirming monolayer uniformity prior to functional assays.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of lung injury pathways in vitro.
Screening & Assay Development
- Provides standardized imaging and quantification of cell layer confluency for assay readiness.
- Ensures reproducibility and comparability across microfluidic and static culture platforms.
- Delivers quantitative outputs for downstream compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro barrier models with disease-relevant lung microenvironments.
- Enables continuity from cell-based discovery to preclinical validation of respiratory therapeutics.
- Supports risk-adjusted advancement by confirming model fidelity before functional testing.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model qualification, providing a foundation for lead identification and mechanistic studies in respiratory research.
- Discovery Biology: Validates epithelial monolayer formation to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Confirms assay readiness through quantitative imaging and layer uniformity metrics.
- Analytics: Generates reproducible structural data for cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by ensuring physiological relevance of cell layers.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse lung cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in barrier function studies and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across microfluidic culture experiments.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by ensuring model fidelity before functional or screening assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory disease programs through robust model qualification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly and cell culture techniques.
- Needs access to confocal microscopy and quantitative image analysis tools.
- Demands cross-team standardization of channel construction and staining protocols.
- Adaptable to various epithelial cell types with protocol optimization.
- Dependent on precise control of culture duration and media flow to avoid multilayer formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Microfluidic Channel Fabrication and Pre‐Treatment
1:49
Cell Culture in the Microfluidic Channel
2:35
Cell Fixation
4:11
Cell Staining and Mounting
5:25
Cell Imaging with Confocal Microscopy
5:55
Results: Culture Duration Effects on Monolayer Production
6:52
Conclusion
