胞嘧啶修饰形式使用敏感免疫组化检测
August 16th, 2016
在本文中，我们描述了一种灵敏的免疫化学方法，用于基于使用过氧化物酶偶联的二抗和酪胺信号放大来绘制 5mC 氧化衍生物的空间分布。
该免疫化学方案的总体目标是基于使用过氧化物酶偶联的二抗和酪胺信号放大，评估修饰形式的胞嘧啶在各种组织和细胞环境中的空间分布。这种方法克服了其他技术的局限性，这些技术不提供理解修饰形式的胞嘧啶的生物学功能所需的空间信息。此外，该方法允许将修饰形式的胞嘧啶与蛋白质谱系标记物共检测，并可用于研究它们的核定位。
要开始此程序，将野生型 CD1 小鼠胚胎和成年脑组织的再水化组织切片在室温下置于冰冷的 4% PFA 或 4% FA 中 15 分钟，以固定它们。然后，在室温下用 PBS 洗涤切片 5 分钟，去除多余的固定剂。接下来，将组织切片放入装满 PBX 的 Coplin 染色缸中，在室温下透化组织切片 30 分钟。
随后，通过在 PBT 中短暂洗涤切片来去除多余的 PBX。现在，将透化切片置于 2 N HCl 中，在室温下放置 60 分钟以进行 DNA 脱嘌呤。然后，在室温下将切片转移到 10 毫摩尔 Tris-Hcl 中 30 分钟以中和 HCl。
或者，在 PBS 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。在室温下将切片在 PBT 中孵育 5 分钟。之后，小心地从组织切片周围区域去除液体。
同时，保持组织切片湿润。使用疏水屏障笔圈住这些部分而不接触它们。随后，在潮湿室中将切片在 100 μL 封闭溶液中于室温下孵育 1 小时。
然后，将组织切片放入 100 微升 1：5000 稀释的小鼠单克隆抗 5hmC 一抗和 1：1000 稀释的兔多克隆抗 5caC 一抗在封闭溶液中在室温下孵育 1 小时。或者，在 4 摄氏度下孵育过夜。接下来，在装满 PBT 的 Coplin 染色缸中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，以去除多余的抗体。
然后，去除多余的 PBT，如有必要，用疏水屏障笔再次包围切片，因为 PBT 含有会削弱疏水屏障的清洁剂。然后，在封闭溶液中制备 1：400 稀释的山羊抗兔 HRP 偶联抗体和 1：400 稀释的驴抗小鼠 555 偶联抗体。然后将组织切片在 100 μL 二抗混合物中，在潮湿室中室温下孵育 1 小时。
然后，在装满 PBT 的 Coplin 染色缸中，在室温下洗涤组织切片 3 次，每次 5 分钟。然后将组织切片转移到 100 μL 酪胺中，在 1：200 稀释的酪胺信号放大缓冲液中，在室温下放置 2 分钟。孵育时间是酪胺溶液，应针对每批单独的酪胺信号放大试剂盒进行实验优化，其中观察到信号强度与基于酪胺的信号放大持续时间之间的线性关系。
然后，立即在 PBT 中洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟，去除多余的酪胺溶液。小心去除多余的 PBT，并立即用一滴封固剂覆盖切片。轻轻地将盖玻片放在组织切片上，并用指甲油密封盖玻片。
然后在显微镜检查前将组织切片保持在 4 摄氏度数小时。为了确定 5hmC 在脑组织切片中的分布，使用有丝分裂后神经元的标记物 NeuN 对这种表观遗传修饰进行共同检测。免疫组织化学分析显示，虽然突出的 5hmC 染色与 NeuN 阳性细胞共定位，但 NeuN 阴性神经胶质细胞具有较低水平的基因组 5hmC。
为了确定 5caC 在分化神经干细胞中的分布，在诱导神经胶质分化 3 天后，在神经干细胞的固定培养物上用神经胶质标志物 GFAP 对该标志物进行共染色。与神经干细胞或成熟星形胶质细胞不同，在大部分表达 GFAP 的细胞中观察到强烈的 5caC 信号。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约八个小时内完成。
在尝试此程序时，请务必记住准备好所有试剂和材料以及样品。在此程序之后，可以进行共聚焦成像，以回答有关修饰形式的胞嘧啶的核分布的其他问题。这有助于破译它们的潜在生物学功能。
不要忘记，使用 2 N Hcl 可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如安全柜和防护服。
概览
本文介绍了一种敏感的免疫化学方法，用于通过过氧化物酶结合的二抗和酪胺信号放大来绘制5mC氧化衍生物的空间分布。该方法允许评估各种组织和细胞背景中胞嘧啶的修饰形式。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- 了解修饰胞嘧啶的空间分布对于阐明其生物功能至关重要。
- 现有技术通常缺乏空间分辨率，限制了其有效性。
- 该方法能够与蛋白质谱系标记物共同检测。
- 它可以应用于研究胞嘧啶修饰的核定位。
研究目的
- 开发一种绘制5mC氧化衍生物分布的方法。
- 提供理解这些修饰的生物学作用所需的空间信息。
- 促进各种组织中修饰胞嘧啶的研究。
使用的方法
- 固定来自小鼠胚胎和成年脑的组织切片。
- 组织切片的渗透化和DNA脱嘌呤化。
- 与特异性修饰胞嘧啶的一抗孵育。
- 使用酪胺信号放大以增强检测。
主要结果
- 5hmC染色与NeuN阳性神经元共定位。
- 在NeuN阴性胶质细胞中发现较低水平的基因组5hmC。
- 在表达GFAP的分化神经干细胞中观察到强烈的5caC信号。
- 该方法可以在大约八小时内完成。
结论
- 该免疫化学方法为研究胞嘧啶修饰提供了一种稳健的方法。
- 它增强了对神经背景下这些修饰的生物功能的理解。
- 在处理2 N HCl等试剂时，安全预防措施至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding the spatial distribution of cytosine modifications is critical for deciphering epigenetic regulation in disease-relevant systems. This method enables co-detection with lineage markers, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and oncology research. It provides predictive confidence by linking DNA modifications to cellular phenotypes in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping 5hmC and 5caC localization in specific cell types.
- Operational Value: Enables functional target validation through co-detection with NeuN and GFAP markers.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating epigenetic marks with neuronal or glial differentiation states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Quantitative Outputs: Tyramide signal amplification provides sensitive, reproducible detection of low-abundance modifications.
- Platform Reuse: Standardized protocol allows scalability across tissue types and antibody panels.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Studied in embryonic and adult brain tissues, relevant to neurodevelopmental and neurodegenerative disorders.
- Translational Continuity: Nuclear localization data supports biomarker alignment from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Spatial resolution reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical biomarker assessment, enabling iterative refinement of epigenetic targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific distribution of 5mC oxidation derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized fixation, permeabilization, and amplification steps.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts enabling comparison of modification levels across conditions.
- Translational Research: Connects epigenetic marks to cell identity markers, supporting biomarker-driven preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to multiple tissue types and antibody combinations, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking cytosine modifications to specific cellular lineages.
- Operational Value: Tyramide signal amplification ensures standardization and reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatial context for epigenetic target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on epigenetic activity in disease-relevant cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and epitope retrieval techniques.
- Dependent on hydrolysis steps (2 N HCl) necessitating specialized safety equipment and training.
- Needs standardized blocking and washing protocols to minimize background signal.
- Adaptation across model systems requires validation of antibody specificity and permeabilization efficiency.
- Practical limitation: HCl treatment may affect epitope integrity for some protein targets, requiring optimization.
