胞嘧啶修饰形式使用敏感免疫组化检测

该免疫化学方案的总体目标是基于使用过氧化物酶偶联的二抗和酪胺信号放大，评估修饰形式的胞嘧啶在各种组织和细胞环境中的空间分布。这种方法克服了其他技术的局限性，这些技术不提供理解修饰形式的胞嘧啶的生物学功能所需的空间信息。此外，该方法允许将修饰形式的胞嘧啶与蛋白质谱系标记物共检测，并可用于研究它们的核定位。

要开始此程序，将野生型 CD1 小鼠胚胎和成年脑组织的再水化组织切片在室温下置于冰冷的 4% PFA 或 4% FA 中 15 分钟，以固定它们。然后，在室温下用 PBS 洗涤切片 5 分钟，去除多余的固定剂。接下来，将组织切片放入装满 PBX 的 Coplin 染色缸中，在室温下透化组织切片 30 分钟。

随后，通过在 PBT 中短暂洗涤切片来去除多余的 PBX。现在，将透化切片置于 2 N HCl 中，在室温下放置 60 分钟以进行 DNA 脱嘌呤。然后，在室温下将切片转移到 10 毫摩尔 Tris-Hcl 中 30 分钟以中和 HCl。

或者，在 PBS 中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。在室温下将切片在 PBT 中孵育 5 分钟。之后，小心地从组织切片周围区域去除液体。

同时，保持组织切片湿润。使用疏水屏障笔圈住这些部分而不接触它们。随后，在潮湿室中将切片在 100 μL 封闭溶液中于室温下孵育 1 小时。

然后，将组织切片放入 100 微升 1：5000 稀释的小鼠单克隆抗 5hmC 一抗和 1：1000 稀释的兔多克隆抗 5caC 一抗在封闭溶液中在室温下孵育 1 小时。或者，在 4 摄氏度下孵育过夜。接下来，在装满 PBT 的 Coplin 染色缸中洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，以去除多余的抗体。

然后，去除多余的 PBT，如有必要，用疏水屏障笔再次包围切片，因为 PBT 含有会削弱疏水屏障的清洁剂。然后，在封闭溶液中制备 1：400 稀释的山羊抗兔 HRP 偶联抗体和 1：400 稀释的驴抗小鼠 555 偶联抗体。然后将组织切片在 100 μL 二抗混合物中，在潮湿室中室温下孵育 1 小时。

然后，在装满 PBT 的 Coplin 染色缸中，在室温下洗涤组织切片 3 次，每次 5 分钟。然后将组织切片转移到 100 μL 酪胺中，在 1：200 稀释的酪胺信号放大缓冲液中，在室温下放置 2 分钟。孵育时间是酪胺溶液，应针对每批单独的酪胺信号放大试剂盒进行实验优化，其中观察到信号强度与基于酪胺的信号放大持续时间之间的线性关系。

然后，立即在 PBT 中洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟，去除多余的酪胺溶液。小心去除多余的 PBT，并立即用一滴封固剂覆盖切片。轻轻地将盖玻片放在组织切片上，并用指甲油密封盖玻片。

然后在显微镜检查前将组织切片保持在 4 摄氏度数小时。为了确定 5hmC 在脑组织切片中的分布，使用有丝分裂后神经元的标记物 NeuN 对这种表观遗传修饰进行共同检测。免疫组织化学分析显示，虽然突出的 5hmC 染色与 NeuN 阳性细胞共定位，但 NeuN 阴性神经胶质细胞具有较低水平的基因组 5hmC。

为了确定 5caC 在分化神经干细胞中的分布，在诱导神经胶质分化 3 天后，在神经干细胞的固定培养物上用神经胶质标志物 GFAP 对该标志物进行共染色。与神经干细胞或成熟星形胶质细胞不同，在大部分表达 GFAP 的细胞中观察到强烈的 5caC 信号。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约八个小时内完成。

在尝试此程序时，请务必记住准备好所有试剂和材料以及样品。在此程序之后，可以进行共聚焦成像，以回答有关修饰形式的胞嘧啶的核分布的其他问题。这有助于破译它们的潜在生物学功能。

不要忘记，使用 2 N Hcl 可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如安全柜和防护服。