使用高灵敏度免疫组织化学法检测胞嘧啶的修饰形式

本免疫化学实验方案的总体目标是利用辣根过氧化物酶标记的二抗及酪胺信号放大技术，评估不同组织和细胞背景下胞嘧啶修饰形式的空间分布。该方法克服了其他技术无法提供理解胞嘧啶修饰形式生物学功能所必需的空间信息的局限性。此外，该方法可实现胞嘧啶修饰形式与蛋白质谱系标志物的共检测，并可用于研究其在细胞核内的定位。

开始此操作时，将野生型CD1小鼠胚胎和成年脑组织的复水组织切片置于冰上预冷的4% PFA或4% FA中，在室温下固定15分钟。随后，在室温下用PBS洗涤切片5分钟，以去除多余的固定液。接下来，将组织切片放入盛有PBX的考普林瓶中，在室温下透化30分钟。

随后，用 PBT 短暂清洗切片以去除多余的 PBX。现在，将已通透处理的切片置于 2 N HCl 中，在室温下孵育 60 分钟，以进行 DNA 去嘌呤化。然后，将切片转移至 10 毫摩尔 Tris-HCl 中，在室温下孵育 30 分钟，以中和 HCl。

或者，用 PBS 每次 5 分钟，清洗切片三次。将切片在 PBT 中室温孵育 5 分钟。随后，小心移除组织切片周围区域的液体。

在此期间，保持组织切片湿润。使用疏水屏障笔在不接触切片的情况下围绕切片画圈。随后，在湿盒中于室温下用 100 µL 封闭液孵育切片 1 小时。

然后，在室温下将组织切片与100微升阻断液中的小鼠单克隆抗5hmC一抗（1:5000稀释）和兔多克隆抗5caC一抗（1:1000稀释）共同孵育1小时。或者，可在4摄氏度下孵育过夜。接下来，在室温下用盛有PBT的玻片染色缸洗涤切片，每次5分钟，共洗涤3次，以去除未结合的抗体。

然后，去除多余的PBT，如有必要，由于PBT含有可削弱疏水屏障的去污剂，需再次用疏水屏障笔围绕组织切片画圈。接着，用封闭液将 goat anti-rabbit HRP标记的二抗稀释至1:400，同时将 donkey anti-mouse 555标记的二抗稀释至1:400。随后，在湿盒中，室温下将组织切片与100微升上述二抗混合液孵育一小时。

随后，在室温下用盛有PBT的考普林瓶清洗组织切片，每次五分钟，共清洗三次。然后将组织切片转移至100 µL酪酰胺信号放大缓冲液中，其中酪酰胺工作浓度为1:200，室温孵育两分钟。酪酰胺溶液的孵育时间应根据每批次酪酰胺信号放大试剂盒进行实验优化，以确保信号强度与酪酰胺信号放大反应时间之间呈现线性关系。

随后，用PBT缓冲液将载玻片洗涤三次，每次五分钟，以去除多余的酪胺溶液。小心吸去多余的PBT缓冲液，并立即在组织切片上滴加一滴封片剂。轻轻盖上盖玻片，并用指甲油密封盖玻片边缘。

然后将组织切片在 4°C 下保存数小时，再进行显微镜检查。为了确定 5hmC 在脑组织切片中的分布情况，对该表观遗传修饰与终末分化神经元标志物 NeuN 进行了共检测。免疫组织化学分析显示，明显的 5hmC 染色主要与 NeuN 阳性细胞共定位，而 NeuN 阴性的胶质细胞中基因组 5hmC 水平较低。

为了确定5caC在分化中的神经干细胞中的分布情况，我们在诱导胶质分化三天后，对固定的神经干细胞培养物进行了5caC标记与胶质细胞标志物GFAP的共染色。与神经干细胞或成熟星形胶质细胞不同，在大量表达GFAP的细胞中观察到强烈的5caC信号。一旦掌握该技术，若操作得当，约需八小时即可完成。

在进行该实验操作时，重要的是要确保所有试剂和材料均已与样品一同准备就绪。完成该步骤后，可进行共聚焦成像，以进一步探究胞嘧啶修饰形式在细胞核内的分布情况，这有助于揭示其潜在的生物学功能。

请注意，使用 2 N HCl 具有极高的危险性，进行此操作时必须采取安全柜和防护装备等预防措施。