DNA 修饰的免疫: 共焦图像的计算分析
2017年9月7日
新发现的 5-嘧啶 (氧化-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) 和 5-carboxylcytosine (5caC) 的氧化形式, 可能代表独特的功能作用的 DNA 修饰。本文介绍了氧化-mCs 空间分布、信号强度剖面和定位的半定量可视化工作流。
该技术的总体目标是提供一种计算工具，用于评估 DNA 修饰的空间分布和信号强度，通过细胞核内的免疫染色进行可视化。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，允许检查不同模型系统中 DNA 修饰的核定位和相对水平。这种技术的主要优点是 DNA 修饰是通过机器人信号幅度然后分布来测量的。
这项技术的意义之一是它有助于我们了解各种生物系统中 DNA 修饰的潜在功能行。该技术还增加了免疫组织化学可检测的其他表位的计算分析应用。首先，打开共聚焦显微镜图像的 LSM 格式文件。
选择 Image processing（图像处理），然后选择所需的图像进行分析。请注意，在比较样品之间的强度分布时，激光功率和增益必须一致才能进行直接比较。接下来，单击 show all （全部显示），使所有图形控件可见，然后选择 graphics 选项卡并选择矩形工具以选择包含感兴趣核的区域。
然后使用 cut region 命令隔离感兴趣的区域。现在以新名称和 LSM 或 CZI 格式保存图像，然后在 Zen Blue 软件中重新打开该文件。以 Zen Blue 打开 ZEN 桌面，然后使用 Zen Black 中的 send to ZEN 命令以 Zen Blue 打开文件。
接下来，激活标记为 2.5d 的选项卡以启用 2.5d 图像的可视化。单击 show all （全部显示），使所有图形控件可见，并使用四个灰色条更改设置。这些条控制比例尺的缩放、旋转、轴倾斜以及扩展和收缩。
选择渲染模式以最好地显示各个峰值，然后通过更改百分比来改变较大的距离。百分比越低，每个单独的峰就越清晰。现在，在保存 2.5d 图像之前，通过单击 2.5d 图下方的灰色箭头来隐藏文件列表和图形工具。
然后使用键盘上的 print screen 键将绘图保存为屏幕截图。在软件中打开图像处理选项并打开感兴趣的文件。接下来，选择 profile 选项卡，然后选择 show all 选项卡以访问所有格式选项。
从 profile 选项卡中，选择 table 选项和箭头按钮。现在使用鼠标选择一个起点并在连续数量的单元格上画一条线，然后生成沿这条线的单元格的强度图以及强度测量表。请注意，该表还提供了红色、绿色和蓝色荧光的像素强度为红色的距离。
单位为微米。要导出此数据，请右键单击表，选择 保存表并将其另存为文本文件。要保存强度配置文件，请选择导出选项，在弹出窗口中，切换两个选项，标记图像文件、图像窗口的格式和内容、单个窗格、数据。
然后按照提示保存文件。现在对所需的每个强度曲线重复此过程。在软件中，选择 Image processing 并选择感兴趣的图像文件。
然后选择标记为 coloc for co-localization analysis 的选项卡，并选择 show all 以访问所有格式选项。从屏幕下半部分的四个选项卡中，选择 co-localisation （共本地化），然后选择表格和图像选项。然后选择选项卡顶部的第三个图标，由弹出文本 closed besier 标识。
使用此工具可环绕单个原子核。然后，值将出现在表中，并生成红色与绿色荧光的散点图。此图的轴是可移动的，这控制检测的门控。
细胞核内的所有像素强度都应被视为正信号。由于 DNA 修饰的水平在细胞核中不同，为了考虑到微弱的信号，我们不会对数据进行门控。我们应该在这里强调，如果应该将背景值包含在分析中，这是值得商榷的。
重要的是，重叠系数与两个通道之间的信号强度差异无关。而 person correlation coefficient 假设信号之间存在线性关系。现在重复这个环绕原子核的过程，以完成数据集。
然后，要导出数据，请右键单击表格并按照选项保存数据。要保存协同定位图像，请使用带有两个选项的导出命令：标记图像文件、格式和图像窗口内容、单窗格、数据，然后按照选项保存文件。使用所描述的方案在区分 haphadic 祖细胞时检查了 5 甲基胞嘧啶的两种氧化 deriritative 的空间分布。
红色和绿色信号代表两种不同的 DNA 修饰。信号定义明确，重叠有限。与预期一致，两个信号强度和相应单元的概况彼此之间没有很强的重合。
独特的模式表明，5 甲基胞嘧啶的 tap 依赖性氧化可以在特定染色质区域产生不同的氧化衍生物。在 Daoy 髓母细胞瘤细胞和 BXD 室管膜瘤细胞中对两种 DNA 修饰进行了类似的比较。两种细胞谱系都来自小儿脑肿瘤。
定量显示，与 Daoy 细胞相比，BXD 细胞的两种信号水平显着降低。接下来，在未分化的 hiPSC 中检查 5MC 氧化衍生物的共定位。在诱导肝内胚层分化和 hiPSC 后 24 小时内。
在该分析中，信号共定位随着分化的诱导而显着变化，这可能归因于未分化细胞中 5 个 CAC 的幅度降低。观看此视频后，您应该对如何生成 2.5d 强度图和轮廓以及如何生成共定位数据有很好的了解。此处描述的图像分析和可视化工具有助于表观遗传学研究，提供了一种相对快速的方法来比较不同实验组中不同 DNA 修饰的信号。
一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约一个小时内完成。在显微镜检查期间，避免过度曝光并为不同的实验组使用相同的设置非常重要。安装座中的气泡和浸没不充分会导致局部荧光损失，因此，对扫描区域进行目视检查至关重要。
通过使用 Zen Blue 分割细胞核并创建感兴趣的区域，可以进一步自动化该过程。这些区域可以导入到 Zen Black 中，以对多个细胞核进行共定位分析。
概述
本文介绍了一种半定量工作流程，用于可视化新发现的5-甲基胞嘧啶（oxi-mCs）的氧化形式及其在细胞核内的空间分布。该方法允许评估DNA修饰的信号强度和共定位，有助于理解其在表观遗传学中的功能作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 表观遗传学
- DNA修饰
- 免疫染色技术
背景
- 5-甲基胞嘧啶及其氧化衍生物在基因调控中扮演着关键角色。
- 了解它们的空间分布可以提供关于其功能意义的洞见。
- 现有方法可能无法充分可视化这些修饰。
- 本研究引入了一个计算工具来增强可视化和分析。
研究目的
- 开发一种评估DNA修饰空间分布的方法。
- 分析不同氧化衍生物的信号强度和共定位。
- 促进对这些修饰在生物系统中的功能作用的理解。
使用的方法
- 细胞核中DNA修饰的免疫染色。
- 共聚焦显微镜用于图像获取。
- 使用Zen Blue软件进行图像处理以便可视化。
- 信号强度的共定位分析。
主要结果
- 在不同细胞类型中观察到了氧化衍生物的不同空间模式。
- 共定位分析揭示了分化过程中的显著变化。
- 定量分析显示细胞系之间信号水平的差异。
- 该方法展示了在表观遗传学研究中的更广泛应用的潜力。
结论
- 开发的工作流程增强了DNA修饰的可视化。
- 研究结果表明不同氧化衍生物具有不同的功能作用。
- 这种技术可以应用于各种生物学背景以获得更深入的洞见。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the spatial distribution and signal intensity of DNA modifications in nuclear contexts, supporting mechanistic de-risking in epigenetic target validation. By providing computational analysis of immunostained confocal images, it enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding the localization of novel epigenetic marks informs therapeutic hypothesis interrogation. The workflow supports cross-functional collaboration through standardized, reproducible quantitative outputs that can be applied across diverse model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing tissue- and developmental stage-specific occurrence of DNA modifications in vertebrates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of signal intensity and distribution patterns in nuclei.
- Predictive Value: Contributes to portfolio triage by providing data on the localization of oxidized derivatives of 5-methylcytosine that may play specific roles in cellular processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating 2.5D signal intensity plots and intensity profiles for multiple cells.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent laser power and gain settings during microscopy, enabling direct comparisons between samples.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by demonstrating applicability to other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through examination of signal colocalization changes during differentiation in hiPSCs and pediatric brain tumor cell lines.
- Risk-Adjusted Advancement: Describes how quantification of signal levels in Daoy medulloblastoma and BXD ependymoma cells supports decision-making in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by showing how distinct spatial patterns of oxidized derivatives may reflect tap-dependent oxidation in specific chromatin regions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing quantitative imaging data that supports hypothesis testing and pathway clarification in epigenetics research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing through spatial distribution analysis of DNA modifications visualized by immunostaining.
- Screening: Describes assay readiness via signal intensity profiles and table exports that enable quantitative comparison of staining intensity across cells.
- Analytics: Highlights colocalization coefficients and scatter plots that help teams compare conditions and assess relationships between different DNA modifications.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through analysis of signal changes during differentiation in stem cell and tumor models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability by noting its added application to computational analysis of other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through assessment of nuclear localization and relative levels of DNA modifications.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via consistent imaging settings and exportable data tables for cross-group comparison.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of DNA modification levels in different experimental groups, such as undifferentiated vs. differentiated hiPSCs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantification of signal differences between cell lines, such as lower signals in BXD vs. Daoy cells.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy and immunostaining for DNA modifications.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include Zen Blue software for 2.5D visualization, profile analysis, and colocalization tools.
- Cross-team standardization requirements involve maintaining consistent laser power and gain when comparing intensity profiles between samples.
- Adaptation considerations across model systems are supported by the method’s application in differentiating haphadic progenitors, Daoy medulloblastoma, BXD ependymoma, and hiPSCs.
- Practical limitations include the need to avoid overexposure and inspect scanning areas for air bubbles or insufficient immersion that can cause local fluorescence loss.
