DNA 修饰的免疫: 共焦图像的计算分析

新发现的 5-嘧啶 (氧化-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) 和 5-carboxylcytosine (5caC) 的氧化形式, 可能代表独特的功能作用的 DNA 修饰。本文介绍了氧化-mCs 空间分布、信号强度剖面和定位的半定量可视化工作流。

该技术的总体目标是提供一种计算工具，用于评估 DNA 修饰的空间分布和信号强度，通过细胞核内的免疫染色进行可视化。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，允许检查不同模型系统中 DNA 修饰的核定位和相对水平。这种技术的主要优点是 DNA 修饰是通过机器人信号幅度然后分布来测量的。

这项技术的意义之一是它有助于我们了解各种生物系统中 DNA 修饰的潜在功能行。该技术还增加了免疫组织化学可检测的其他表位的计算分析应用。首先，打开共聚焦显微镜图像的 LSM 格式文件。

选择 Image processing（图像处理），然后选择所需的图像进行分析。请注意，在比较样品之间的强度分布时，激光功率和增益必须一致才能进行直接比较。接下来，单击 show all （全部显示），使所有图形控件可见，然后选择 graphics 选项卡并选择矩形工具以选择包含感兴趣核的区域。

然后使用 cut region 命令隔离感兴趣的区域。现在以新名称和 LSM 或 CZI 格式保存图像，然后在 Zen Blue 软件中重新打开该文件。以 Zen Blue 打开 ZEN 桌面，然后使用 Zen Black 中的 send to ZEN 命令以 Zen Blue 打开文件。

接下来，激活标记为 2.5d 的选项卡以启用 2.5d 图像的可视化。单击 show all （全部显示），使所有图形控件可见，并使用四个灰色条更改设置。这些条控制比例尺的缩放、旋转、轴倾斜以及扩展和收缩。

选择渲染模式以最好地显示各个峰值，然后通过更改百分比来改变较大的距离。百分比越低，每个单独的峰就越清晰。现在，在保存 2.5d 图像之前，通过单击 2.5d 图下方的灰色箭头来隐藏文件列表和图形工具。

然后使用键盘上的 print screen 键将绘图保存为屏幕截图。在软件中打开图像处理选项并打开感兴趣的文件。接下来，选择 profile 选项卡，然后选择 show all 选项卡以访问所有格式选项。

从 profile 选项卡中，选择 table 选项和箭头按钮。现在使用鼠标选择一个起点并在连续数量的单元格上画一条线，然后生成沿这条线的单元格的强度图以及强度测量表。请注意，该表还提供了红色、绿色和蓝色荧光的像素强度为红色的距离。

单位为微米。要导出此数据，请右键单击表，选择 保存表并将其另存为文本文件。要保存强度配置文件，请选择导出选项，在弹出窗口中，切换两个选项，标记图像文件、图像窗口的格式和内容、单个窗格、数据。

然后按照提示保存文件。现在对所需的每个强度曲线重复此过程。在软件中，选择 Image processing 并选择感兴趣的图像文件。

然后选择标记为 coloc for co-localization analysis 的选项卡，并选择 show all 以访问所有格式选项。从屏幕下半部分的四个选项卡中，选择 co-localisation （共本地化），然后选择表格和图像选项。然后选择选项卡顶部的第三个图标，由弹出文本 closed besier 标识。

使用此工具可环绕单个原子核。然后，值将出现在表中，并生成红色与绿色荧光的散点图。此图的轴是可移动的，这控制检测的门控。

细胞核内的所有像素强度都应被视为正信号。由于 DNA 修饰的水平在细胞核中不同，为了考虑到微弱的信号，我们不会对数据进行门控。我们应该在这里强调，如果应该将背景值包含在分析中，这是值得商榷的。

重要的是，重叠系数与两个通道之间的信号强度差异无关。而 person correlation coefficient 假设信号之间存在线性关系。现在重复这个环绕原子核的过程，以完成数据集。

然后，要导出数据，请右键单击表格并按照选项保存数据。要保存协同定位图像，请使用带有两个选项的导出命令：标记图像文件、格式和图像窗口内容、单窗格、数据，然后按照选项保存文件。使用所描述的方案在区分 haphadic 祖细胞时检查了 5 甲基胞嘧啶的两种氧化 deriritative 的空间分布。

红色和绿色信号代表两种不同的 DNA 修饰。信号定义明确，重叠有限。与预期一致，两个信号强度和相应单元的概况彼此之间没有很强的重合。

独特的模式表明，5 甲基胞嘧啶的 tap 依赖性氧化可以在特定染色质区域产生不同的氧化衍生物。在 Daoy 髓母细胞瘤细胞和 BXD 室管膜瘤细胞中对两种 DNA 修饰进行了类似的比较。两种细胞谱系都来自小儿脑肿瘤。

定量显示，与 Daoy 细胞相比，BXD 细胞的两种信号水平显着降低。接下来，在未分化的 hiPSC 中检查 5MC 氧化衍生物的共定位。在诱导肝内胚层分化和 hiPSC 后 24 小时内。

在该分析中，信号共定位随着分化的诱导而显着变化，这可能归因于未分化细胞中 5 个 CAC 的幅度降低。观看此视频后，您应该对如何生成 2.5d 强度图和轮廓以及如何生成共定位数据有很好的了解。此处描述的图像分析和可视化工具有助于表观遗传学研究，提供了一种相对快速的方法来比较不同实验组中不同 DNA 修饰的信号。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约一个小时内完成。在显微镜检查期间，避免过度曝光并为不同的实验组使用相同的设置非常重要。安装座中的气泡和浸没不充分会导致局部荧光损失，因此，对扫描区域进行目视检查至关重要。

通过使用 Zen Blue 分割细胞核并创建感兴趣的区域，可以进一步自动化该过程。这些区域可以导入到 Zen Black 中，以对多个细胞核进行共定位分析。