Name: DNA 修饰的免疫: 共焦图像的计算分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 了解DNA修饰免疫染色的共焦图像计算分析方法。该技术通过Zen Blue软件进行信号强度与共定位分析，帮助研究表观遗传学中5-甲基胞嘧啶氧化衍生物的空间分布特征及其功能意义。

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本工作由生物技术和生物科学研究理事会资助 [BB/N005759/1 至 A.R.]。NRFH 由 Rosetrees 信托基金和 Stoneygate 信托基金资助 [A1130 / M546]。&#160;蔡司 Elyra PS.1 显微镜、处理用计算机及软件由 BBSRC BB/L013827/1 资助（诺丁汉大学多学科超分辨率显微成像设施项目）

1. 共聚焦图像的生成
<ol>
	<li>在进行胞嘧啶修饰形式分析之前，按照 Abakir&#160;et al.34 所述方法进行免疫组织化学染色。</li>
	<li>使用显微镜对切片进行成像，并以 LSM 格式保存文件。 
	注意：在比较不同样本间的强度分布时，必须在整个图像采集过程中保持各通道的激光功率和增益值一致，以便在图像分析阶段进行直接比较。</li>
</ol>
2. 生成2.5D强度图
<ol>
	<li>打开软件（例如，Zen Black）并选择“图像处理”。</li>
	<li>转到“文件”菜单并选择“打开”。选择需要处理的图像。</li>
	<li>单击图像下方的“显示全部”以显示所有图形控件。屏幕下半部分有三个选项卡：“尺寸”、“显示”和“图形”，请选择“图形”选项卡。
	<ol>
		<li>选择“矩形”工具以选定细胞核/感兴趣区域。</li>
		<li>选择“剪切区域”以裁剪图像。这将在新标签页中生成裁剪区域的新图像。</li>
		<li>转到“文件”菜单并选择“另存为”。为文件命名，并将其保存为 LSM 或 CZI 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开放软件例如，Zen Blue）并选择“Zen Desk”。</li>
	<li>将裁剪后的图像从 Zen Black 发送到 Zen Blue：选择文件，点击“文件”菜单，选择“发送到 Zen 2012-blue 版”。裁剪后的图像将在相应程序中打开。 
	注意：由于 Zen Black 2012 中的 2.5D 强度图功能无法同时显示多通道图像，因此需传输图像文件。</li>
	<li>在图像左侧选择标有“2.5D”的选项卡，即可启用图像的2.5D可视化。点击“显示全部”以显示所有图形控件。</li>
	<li>使用位于图像左侧和下方的四个灰色条形调整可视化设置。 
	注意：屏幕左侧上方竖条 = 缩放。屏幕左侧下方竖条 = 绕轴翻转图像。屏幕底部左侧竖条 = 旋转图像。屏幕底部右侧竖条 = 展开和收缩比例尺。</li>
	<li>确保选择表面渲染模式，因为该模式能最清晰地显示各个峰的形态。</li>
	<li>通过更改百分比来调整网格间距，百分比越低，各个峰的定义越清晰。</li>
	<li>要保存2.5D图像，首先点击2.5D图下方（“显示全部”旁边）的灰色箭头，隐藏右侧的文件列表和图像下方的图形工具栏，从而隐藏图形选项卡，使图像扩展至全屏显示。要保存2.5D图，请按下键盘上的“PrtSc”键，以捕获屏幕截图。将截图粘贴至Microsoft Paint中，裁剪图像后保存。</li>
</ol>
3. 强度分析
<ol>
	<li>打开软件（例如，Zen Black）并选择图像处理。</li>
	<li>转到“文件”菜单并选择“打开”。选择需要处理的图像。</li>
	<li>当图像显示在屏幕上时，在图像左侧选择标有“Profile”的选项卡。</li>
	<li>在屏幕下半部分选择（勾选）“显示全部”选项卡。这将启用所有格式设置选项。</li>
	<li>屏幕下半部分有三个选项卡：“维度”、“显示”和“Profile”；选择“Profile”，并勾选“Table”复选框。然后点击“Arrow”按钮。</li>
	<li>在图像上使用鼠标选择一个起点，并拖动鼠标经过连续的多个细胞。松开鼠标后，将生成沿该直线各细胞的强度分布图；此外，表格中将填入沿该直线每个波长对应的像素强度测量数据。 
	注意：该表格将提供读取红色、绿色和蓝色荧光像素强度时对应的距离（µm）。</li>
	<li>要导出此数据，右键单击表格，选择“保存表格…”，然后将其保存为 .txt 文件至适当位置。</li>
	<li>为保存选定的强度轮廓图像，请选择“文件”菜单，然后点击“导出…”。在弹出窗口中，选择“标记图像文件格式 (TIFF)”和“图像窗口内容 - 单窗格 (数据)”，然后点击“选择文件名并保存…”，选择合适的保存位置后点击“保存”。</li>
	<li>根据视野范围和待分析轮廓的数量，对每个单独的强度轮廓重复该过程。</li>
	<li>导入保存的强度轮廓数据（参见3.7），在电子表格中进行分析，随后进行统计分析。</li>
</ol>
4. 共定位分析
<ol>
	<li>打开软件并选择“图像处理”。</li>
	<li>进入文件菜单并选择“打开”，选择需要处理的图像。</li>
	<li>图像显示在屏幕上后，在图像左侧选择标有“Coloc”的选项卡。</li>
	<li>在屏幕下半部分，选中（勾选）“Show All”选项卡，以启用所有格式化选项。</li>
	<li>在屏幕下半部分有四个选项卡：“Dimensions”、“Display”、“Graphics”和“Colocalization”；选择“Colocalization”，并勾选“Table”和“Image”复选框。
	<ol>
		<li>点击该选项卡顶部第三个图标（鼠标悬停时将显示“Close Bezier”文本），然后使用此工具围绕单个细胞核进行圈选，该细胞核的数值将显示在表格中。 
		注意：每圈选一个细胞核，系统将在屏幕左侧面板中生成一张红色与绿色荧光的散点图。随后可移动坐标轴，根据阈值对细胞进行设门。由于目标细胞核是在图像中手动选择的，因此无需将设门阈值调整至高于零。所有位于细胞核边界内的像素强度值均被视为阳性信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复此过程，通过选择该选项卡中的第三个图标并依次圈选后续细胞核，直至完成整个数据集。</li>
	<li>要导出这些数据，右键单击表格，选择“保存表格”，并将其保存到适当位置。</li>
	<li>要保存共定位图像，请选择“文件”菜单，点击“导出…”，然后选择“Tagged Image File (Format)”和“Contents of Image Window – single plane (Data)”，接着点击“选择文件名并保存…”，选择适当位置后点击“保存”。</li>
	<li>在电子表格中绘制共定位数据，并进行统计分析。</li>
</ol>

<ol><li>Bird, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+II.+The+symmetry+of+methylated+sites+supports+semi-conservative+copying+of+the+methylation+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: II. The symmetry of methylated sites supports semi-conservative copying of the methylation pattern.</a> J Mol Biol. 118 (1), 49-60 (1978).</li>
<li>Youssoufian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+haemophilia+A+give+evidence+for+CpG+mutation+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in haemophilia A give evidence for CpG mutation hotspots.</a> Nature. 324 (6095), 380-382 (1985).</li>
<li>Holliday, R., Pugh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+modification+mechanisms+and+gene+activity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Monograph+Series%22%5BJournal%5D)">DNA modification mechanisms and gene activity during development.</a> Cold Spring Harbor Monograph Series. 32, 639-645 (1996).</li>
<li>Christman, J. K., Price, P., Pedrinan, L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+hypomethylation+of+DNA+and+expression+of+globin+genes+in+Friend+erythroleukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation between hypomethylation of DNA and expression of globin genes in Friend erythroleukemia cells.</a> European J Biochem. 81 (1), 53-61 (1977).</li>
<li>Bird, A. P., Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+restriction+enzymes+to+study+eukaryotic+DNA+methylation%3A+I.+The+methylation+pattern+in+ribosomal+DNA+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis.</a> J Mol Biol. 118 (1), 27-47 (1978).</li>
<li>Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-operation+and+communication+between+the+human+maintenance+and+de+novo+DNA+%28cytosine-5%29+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases.</a> EMBO J. 21 (15), 4183-4195 (2002).</li>
<li>Reik, W., Kelsey, G., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+de+novo+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dissecting de novo methylation.</a> Nature genetics. 23 (4), 380-382 (1999).</li>
<li>Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Eckhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+of+human+chromosomes+6%2C+20+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22.</a> Nat Genet. 38 (12), 1378-1385 (2006).</li>
<li>Lees-Murdock, D. J., Lau, H. -T., Castrillon, D. H., De Felici, M., Walsh, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+loading%2C+but+not+de+novo+methylation%2C+is+an+oocyte-autonomous+process+stimulated+by+SCF+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase loading, but not de novo methylation, is an oocyte-autonomous process stimulated by SCF signalling.</a> Dev Biol. 321 (1), 238-250 (2008).</li>
<li>Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. -U., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeting+sequence+directs+DNA+methyltransferase+to+sites+of+DNA+replication+in+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei.</a> Cell. 71 (5), 865-873 (1992).</li>
<li>Jones, P. A., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+differentiation%2C+cytidine+analogs+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation.</a> Cell. 20 (1), 85-93 (1980).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNA+methylation%3A+DNA+Methylation+in+Early+mammalian+Development%22">DNA methylation: DNA Methylation in Early mammalian Development</a>. Jähner, D., Jaenisch, R. , Springer. 189-219 (1984).</li>
<li>Chalitchagorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+pattern+of+LINE-1+methylation+level+in+normal+tissues+and+the+association+with+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Distinctive pattern of LINE-1 methylation level in normal tissues and the association with carcinogenesis.</a> Oncogene. 23 (54), 8841-8846 (2004).</li>
<li>Fatemi, M., Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+and+Dnmt1+functionally+cooperate+during+de+novo+methylation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a and Dnmt1 functionally cooperate during de novo methylation of DNA.</a> Eur J Biochem. 269 (20), 4981-4984 (2002).</li>
<li>Gruenbaum, Y., Cedar, H., Razin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+and+sequence+specificity+of+a+eukaryotic+DNA+methylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substrate and sequence specificity of a eukaryotic DNA methylase.</a> Nature. 295 (5850), 620-622 (1982).</li>
<li>Dean, W., Santos, F., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+early+mammalian+development+and+following+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology+%28Elsevier%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in early mammalian development and following somatic nuclear transfer.</a> Seminars in cell & developmental biology (Elsevier). 14 (1), 93-100 (2003).</li>
<li>Wu, S. C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+DNA+demethylation%3A+many+roads+lead+to+Rome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Active DNA demethylation: many roads lead to Rome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (9), 607-620 (2010).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+can+be+a+stable+DNA+modification+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals.</a> Nat Chem Biol. 11 (8), 555-557 (2015).</li>
<li>Bachman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+is+a+predominantly+stable+DNA+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine is a predominantly stable DNA modification.</a> Nat Chem. 6 (12), 1049-1055 (2014).</li>
<li>Lurlaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+reveals+a+tissue-specific+role+for+5-formylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling reveals a tissue-specific role for 5-formylcytosine.</a> Genome Biol. 17 (1), 141(2016).</li>
<li>Tamanaha, E., Guan, S., Marks, K., Saleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributive+Processing+by+the+Iron+%28II%29%2F%CE%B1-Ketoglutarate-Dependent+Catalytic+Domains+of+the+TET+Enzymes+Is+Consistent+with+Epigenetic+Roles+for+Oxidized+5-Methylcytosine+Bases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Distributive Processing by the Iron (II)/α-Ketoglutarate-Dependent Catalytic Domains of the TET Enzymes Is Consistent with Epigenetic Roles for Oxidized 5-Methylcytosine Bases.</a> J Am Chem Soc. 138 (30), 9345-9348 (2016).</li>
<li>He, Y. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myöhänen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR%3A+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li>
<li>Nagae, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+demethylation+in+CpG-poor+promoters+during+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific demethylation in CpG-poor promoters during cellular differentiation.</a> Hum Mol Genet. 20 (14), 2710-2721 (2011).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+5-hydroxymethylcytosine+in+mouse+ES+cells+and+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of 5-hydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation.</a> Nature. 473 (7347), 398-402 (2011).</li>
<li>Jin, S. -G., Wu, X., Li, A. X., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic mapping of 5-hydroxymethylcytosine in the human brain.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 5015-5024 (2011).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+DNA+6mA+methylation+during+early+embryogenesis+of+zebrafish+and+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Abundant DNA 6mA methylation during early embryogenesis of zebrafish and pig.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Wu, T. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027282">DNA methylation on N6-adenine in embryonic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 329-333 (2016).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PloS one. 5 (12), e15367(2010).</li>
<li>Abakir, A., Wheldon, L. M., Ruzov, A. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-2754-8_8">Epigenetic Methods in Neuroscience Research: Immunohistochemical Detection of Oxidized Forms of 5-Methylcytosine in Embryonic and Adult Brain Tissue</a>. , Springer. 125-137 (2016).</li>
<li>Alioui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Carboxylcytosine+is+localized+to+euchromatic+regions+in+the+nuclei+of+follicular+cells+in+axolotl+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">5-Carboxylcytosine is localized to euchromatic regions in the nuclei of follicular cells in axolotl ovary.</a> Nucleus. 3 (6), 565-569 (2012).</li>
<li>Chen, Y., Damayanti, N., Irudayaraj, J., Dunn, K., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+two+forms+of+DNA+methylation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Diversity of two forms of DNA methylation in the brain.</a> Front Genet. 5, 46(2014).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).</li>
<li>Lachmanovich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localization+analysis+of+complex+formation+among+membrane+proteins+by+computerized+fluorescence+microscopy%3A+application+to+immunofluorescence+co-patching+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Co-localization analysis of complex formation among membrane proteins by computerized fluorescence microscopy: application to immunofluorescence co-patching studies.</a> J Microsc. 212 (Pt 2), 122-131 (2003).</li>
</ol>

未披露任何潜在的利益冲突。

本方案描述了在细胞核内生成DNA修饰可视化图谱的逐步操作流程。尽管这些技术具有较高的灵敏度和显著的效果，但也存在若干局限性。
必须强调的是，从2.5D图、信号强度分布曲线以及共定位分析中获得的数据本质上是半定量的。由于在激光扫描共聚焦显微镜成像过程中对样品进行逐点照明，因此会记录每个通道的绝对信号强度。然而，这些信号强度并不代表所检测到的5hmC和5caC的绝对量值，而仅能反映这些表观遗传修饰的存在、缺失或相对水平。
由于信号扩增具有重复性，用于增强信号的设备规模所带来的局限性不可避免地会干扰对这些标记真实物理基因组占据情况的估算34。这些体积较大的蛋白质可能在物理上占据某些区域，从而掩盖了这些标记的真实基因组定位，即便在共聚焦显微镜最佳分辨率（200–300 nm）下也无法分辨这些区域34。此外，由于抗体灵敏度和荧光染料偶联效率的差异，不同标记各自的通道信号强度之间无法相互比较34。然而，成像所获得的信息揭示了基因组标记在空间和时间上的组织特征。
为了准确定量 5hmC 和 5caC 信号，需在 DAPI 复染背景下对细胞核进行高亮并圈出，以明确界定待分析区域。该方法无需校准设门阈值，因为通过手动选择细胞核可忽略背景噪声1。最新软件可实现该过程的自动化，支持细胞核分割。尽管存在如 FIJI 等免费替代软件可用于共定位分析，但其使用受限于需将图像转换为8位二值格式、进行图像掩膜处理以及输入尺寸排除参数以选定感兴趣区域，从而降低了用户的操作便捷性。此外，考虑到基因组中 5hmC 和 5caC 总体水平较低，且主要分布于常染色质区域，同时基因组 CpG 序列普遍贫乏，手动圈选细胞核易引入操作者偏倚。因此，自动高亮细胞核可假定划定区域内所有信号事件均为阳性，并排除可能存在的背景像素干扰。因此，基于像素强度的图像分析可能更具意义。在选择共定位分析方法时，这些因素尤为重要：曼德共定位系数（Mander's colocalization coefficient）用于评估两种信号间空间重叠程度，而不受信号强度影响；而皮尔逊相关系数（Pearson's correlation coefficient）则假设信号之间存在线性关系。
总体而言，本文所述技术的核心在于以直观的形式对生物数据进行可视化呈现。尽管半定量图像分析在灵敏度或全基因组单碱基分辨率测序方面无法取代质谱等强大技术，但它能够提供互补性数据，使研究者能够通过对图像的精确分析提出推论和假设。

DNA甲基化是一种与转录调控密切相关的、已有充分文献记载的机制，其过程是在5'-胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤-3'（CpG）二核苷酸背景下，通过向胞嘧啶嘧啶环的5号碳原子添加一个甲基（-CH3）形成5-甲基胞嘧啶（5mC）1。在哺乳动物中，约70%的CpG位点被甲基化，但由于5mC具有自发脱氨突变为胸腺嘧啶的致突变倾向，导致基因组中该回文序列被耗竭，因此CpG仅占基因组的1%2。在脊椎动物中，基因启动子区域上的甲基基团的存在与转录抑制呈显著相关性3,4,5。这些甲基基团的添加由高度保守的DNA甲基转移酶（DNMT）催化完成，其中DNMT3a、3b和3L介导从头甲基化（de novo methylation），而DNMT1则负责维持性甲基化6。DNMT3A/B在胚胎干细胞和上胚层发育过程中表达水平升高；然而，在多能细胞谱系向体细胞命运分化的进程中，其表达显著下降8。尽管DNMT3a与DNMT3b具有功能上的冗余性，但二者表现出组织特异性的表达模式：在小鼠胚胎中，DNMT3a呈均匀分布，而DNMT3b则主要定位于神经外胚层和绒毛膜外胚层组织8。
甲基化特征可在有丝分裂和减数分裂过程中遗传10。维持性甲基化涉及DNMT1介导的修饰过程，该过程作用于双链DNA上半甲基化的回文序列中的CpG胞嘧啶残基11。DNMT1在复制叉处结合DNA11，因此基因组甲基化水平在细胞周期的S期达到峰值12。DNMT1甲基化未修饰的胞嘧啶，从而区分新合成的DNA链，促进X染色体失活并维持转录抑制谱型13。通过识别半甲基化的DNA CpG序列，DNMT1可维持由de novo甲基化建立的甲基化模式，例如，抑制长散布核元件1（LINE1）逆转座子启动子的活性，以防止其潜在的致癌性扩增14。尽管DNMT1对半甲基化DNA具有优先结合亲和力，但在DNMT3a/b -/-突变细胞中，DNMT1也能甲基化未甲基化的CpG岛（CGI）序列，从而发挥应急的de novo甲基化功能15。因此，由于DNA复制具有半保留特性16，维持性甲基化能够忠实地将甲基化特征从亲代细胞传递至子代细胞17。
然而，为了实现基因表达的动态调控，必须消除抑制性的甲基化修饰，这一过程可通过被动和主动去甲基化机制完成18。属于保守双加氧酶蛋白家族的Ten-Eleven Translocase（TET）蛋白能够对CpG位点上的甲基基团进行逐级氧化19。这些Tet蛋白与在Trypanosome bruceii中发现的J-碱基结合蛋白（JBP）同源，可识别并结合修饰后的DNA碱基，例如5mC，并将这些残基氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）20。Tet蛋白介导的5mC氧化导致其构象逐步从甲基转变为羟基、羰基和羧基形式，但5fC和5caC修饰也可直接通过5mC的氧化合成21,22,23,24。
研究氧化甲基胞嘧啶修饰的分布与丰度，是了解TET蛋白活性及其调控机制的重要指标。与未甲基化的富含CpG区域（后者为CpG岛的特征）相对，CpG贫乏的启动子区域中可检测到显著的5mC存在25。在不同组织中，脑、睾丸和血液组织表现出最高的组织特异性甲基化水平，而口腔黏膜则呈现最显著的低甲基化状态，表明在组织特异性启动子区域存在差异性的甲基化模式26。
通过在选择性甲基化/羟甲基化DNA免疫沉淀（meDIP/hmeDIP）中使用高灵敏度的抗5mC和抗5hmC抗体，并结合后续的高通量测序，Ficz et al. 发现，在小鼠胚胎干细胞中，启动子区、外显子区以及LINE-1逆转座子序列上存在高水平的5hmC占据，且这些区域的5mC水平相应降低27。相反，在重复性卫星序列上观察到最显著的5mC富集，而这些区域的5hmC含量则较为有限28。对人类额叶脑组织进行的研究显示，5hmC的富集程度极为显著，其水平是小鼠胚胎干细胞中的四倍28。与先前的研究结果一致，额叶组织的高通量测序结果显示，55–59%的5hmC信号主要定位于低密度CpG启动子区域，35–38%位于基因体内部，约6%分布于基因间区域。相比之下，5mC在基因间区域（25–26%）富集程度较高，在基因体内部（52–55%）也较多，但在启动子序列中的含量较低（22–24%）29。这些研究表明，5hmC在胚胎干细胞和体细胞组织（尤其是脑组织）中均大量存在，然而关于5fC和5caC分布的研究仍较为有限。
有趣的是，最近在真核生物中发现，腺嘌呤残基在第6位氮原子（N6）上的甲基化（6mA）其基因组丰度分布与5mC呈相反趋势30。液相色谱串联质谱分析结果显示，斑马鱼和猪早期胚胎中的6mA绝对水平显著高于精子；在受精后，6mA水平（占基因组腺嘌呤的0.003%）持续上升，在桑葚胚发育阶段达到峰值（比精子高33倍），并最终稳定在体细胞水平，即占基因组腺嘌呤的0.004%31。对富含6mA的DNA序列进行免疫沉淀分析表明，该修饰主要富集于重复元件区域和转录起始位点，富集程度约为80%32。这些发现为6mA去甲基化酶缺失的胚胎干细胞中观察到的现象提供了背景支持和验证：与野生型细胞中转录活跃的元件相比，这些突变细胞中积累的6mA介导了LINE-1逆转座子的沉默。这些数据提示6mA具有转录调控功能33。
尽管与后续DIP实验相结合的共轭生化标签能够指示氧化甲基胞嘧啶衍生物（oxi-mCs）的存在与否，但无法提供这些修饰在空间上的分布情况或可量化的信息34,35。最近开发出一种用于灵敏检测5hmC和5caC的免疫化学方法36。该方法基于荧光标记的二抗进行免疫染色，并结合共聚焦激光扫描显微镜，具有独特优势，可直观显示这些DNA修饰在细胞内的定位，从而突出显示因这些修饰呈异质性分布而导致的阳性或阴性染色的单个细胞。通过共轭抗体放大后的5hmC和5caC绝对信号强度，可对这些修饰在细胞核内的丰度和位置（例如异染色质和常染色质区域）进行半定量分析37,38。本文描述了一种对共聚焦显微镜图像进行计算分析的技术。展示了生成2.5D空间分布图的方法，以显示每个像素上5hmC和5caC信号的独立峰值及其在细胞核内的位置。5hmC和5caC信号强度分布的直方图可用于揭示这些修饰丰度的变化趋势，其中峰和谷以相互分离且不重叠的通道形式呈现。最后，通过应用共定位分析功能，可确定一种信号与另一种信号之间的接近程度，进而推断它们各自在基因组上的坐标位置。

<table><tbody><tr><td>蔡司 Elyra PS1。配备 LSM780 共聚焦显微镜模块的超分辨率显微镜</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 Zen Black 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue 2012</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

dna修饰的免疫染色：共聚焦图像的计算分析

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

几十年来，5-甲基胞嘧啶（5mC）一直被认为是后生动物中唯一具有功能意义的DNA修饰。5mC被酶促氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）的发现，以及在多细胞生物DNA中检测到N6-甲基腺嘌呤（6mA），为表观遗传学研究增添了新的复杂性。越来越多的实验证据表明，这些新型DNA修饰可能在不同的细胞和发育过程中发挥特定作用。重要的是，由于其中一些修饰标记（如5hmC、5fC和5caC）在脊椎动物中表现出组织和发育阶段特异性的分布，免疫化学技术成为评估不同生物学背景下DNA修饰空间分布的重要工具。本文描述了通过免疫染色结合共聚焦显微镜可视化DNA修饰后，进行计算分析的方法。具体包括生成2.5维（2.5D）信号强度图、信号强度轮廓图、多个细胞染色强度的定量分析，以及信号共定位系数的确定。总体而言，这些技术可用于评估这些DNA修饰在细胞核中的水平和定位，有助于阐明其在后生动物中的生物学功能。

为了确定5hmC和5caC在分化中的肝前体细胞内的空间分布，对经免疫染色的载玻片上这些DNA修饰进行了显微镜成像。
通过生成2.5D强度图，对这些氧化甲基胞嘧啶（oxi-mCs）的空间分布进行了初步分析（图1A、1B）。红色和绿色峰形清晰，橙色峰极少，表明5caC与5hmC信号的重叠程度较小。与上述结果一致，相应细胞中5hmC与5caC强度的分布曲线彼此之间并无明显重合（图1C）。这说明5caC和5hmC在肝前体细胞核内的分布具有不同的模式，提示Tet依赖性的5mC氧化过程可导致特定染色质区域产生不同类型的DNA修饰氧化衍生物。
为了比较Daoy髓母细胞瘤和BXD-1425EPN室管膜瘤细胞中5caC和5hmC的水平，在相同实验条件下对两种样本进行了针对这些氧化甲基胞嘧啶（oxi-mCs）的免疫染色。随后比较了每种细胞系3-5个细胞中生成的20个剖面的5caC和5hmC信号强度（图2A-2D）。结果定量分析显示，与Daoy细胞相比，BXD-1425EPN细胞中5hmC和5caC的免疫染色水平显著降低（图2D）。
考虑到红色（5hmC）和绿色（5caC）两个通道，分别记为 R 和 G，Pearson 相关系数（PCC）用于描述 R 与 G 在空间上的重叠程度和共分离程度，其前提是两种修饰之间存在线性关系，该系数以 R 统计量表示34。将 PCC 值平方后得到 R2，可用于衡量受红色信号强度影响的绿色信号强度变化程度34。然而，在我们进行的 5caC 与 5hmC 共定位分析中，这一指标是多余的。
为了研究未分化（Undiff）hiPSCs以及诱导后24小时（HE24）肝内胚层中5caC和5hmC的空间分布，对同一共聚焦图像进行了这些DNA修饰的共定位分析，并分析了每种细胞系20个细胞核的R值（图3A-3C）。
定量分析结果显示，HE24细胞中的共定位程度显著高于未分化（Undiff）细胞（P &lt; 0.05）（图3c）。这可能是由于未分化细胞中5caC的含量较低，导致其信号强度减弱所致。
<img alt="免疫荧光显微镜；5hmC、5caC、DAPI染色；荧光强度图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：诱导分化后72小时肝内胚层前体细胞的免疫组织化学染色。（A）5hmC（红色）、5caC（绿色）和DAPI细胞核复染（蓝色）的共染色。白色虚线箭头“B”表示穿过细胞核取样的轮廓方向，如图1C所示。比例尺为5 µm。红色通道：增益800，激光1%；绿色通道：增益750，激光2.4%；DAPI通道：增益750，激光2.6%。（B）5hmC、5caC和DAPI信号的2.5D强度图。各个峰代表每个像素的绝对信号强度。图中显示了合并视图及各单独通道。（C）诱导分化后72小时肝前体细胞中5hmC、5caC和DAPI信号的强度分布曲线。峰值强度沿白色虚线箭头“B”的方向记录，并由黑色虚线箭头在强度分布曲线的x轴上标示。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="5hmC 和 5caC 的免疫荧光显微镜图像；像素强度条形图分析结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：Daoy 髓母细胞瘤和 BXD-1425EPN 室管膜瘤细胞系中 5hmC 与 5caC 信号强度的分析。（A）Daoy 和 BXD-1425EPN 细胞中 5hmC（红色）与 5caC（绿色）的免疫荧光染色。图像使用63倍油镜在相同成像参数下采集，展示合并图像及各单独通道。比例尺为 10 µm。红色通道：增益 746，激光强度 1%；绿色通道：增益 750，激光强度 2.4%。单独展示（B）Daoy 和（C）BXD-1425EPN 细胞的放大图像。图（B）和（C）的比例尺为 5 µm。（D）Daoy 和 BXD-1425EPN 细胞中 5hmC 与 5caC 信号的平均荧光强度（n = 20，SD）。采用 F 检验和双样本 t 检验评估显著性。星号表示具有统计学显著性的 p 值：** 代表 p &lt;0.01，*** 代表 p &lt;0.001。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="hiPSCs 分化荧光显微镜图像；5hmC、5caC、DAPI 染色；柱状图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56318/56318fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：未分化 hiPSCs（Undiff）与分化后 24 小时的肝内胚层前体细胞（HE24）中 5hmC 和 5caC 绝对信号的共定位分析。 共聚焦显微镜图像显示了（A）未分化 hiPSCs 和（B）HE24 细胞的 5hmC（红色）、5caC（绿色）及 DAPI（蓝色）染色结果。所有图像均使用 63X 油浸物镜在相同成像参数下采集。20 个被圈出的细胞核代表用于共定位分析的取样细胞。比例尺为 20 µm。红色通道：增益 800，激光强度 1%；绿色通道：增益 750，激光强度 2.4%；DAPI 通道：增益 750，激光强度 2.6%。（C）未分化组（undiff）和 HE24 组中 5caC 信号在 5hmC 邻近范围内出现的共定位分析结果（n = 20，SD）。显著性通过 F 检验和双样本 t 检验进行评估。星号表示具有统计学显著性的 p 值：* p &lt;0.05。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56318/56318fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

新发现的5-甲基胞嘧啶（oxi-mCs）氧化形式，包括5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），可能代表具有独特功能作用的独立DNA修饰。本文描述了一种用于可视化oxi-mCs空间分布、信号强度分析及共定位的半定量工作流程。

DNA修饰的免疫染色：共聚焦图像的计算分析

几十年来，人们一直认为5-甲基胞嘧啶（5mC）是后生动物中唯一具有功能意义的DNA修饰。……的发现改变了这一观点。

该技术的总体目标是提供一种计算工具，用于评估通过免疫染色在细胞核内显示的DNA修饰的空间分布和信号强度。该方法有助于回答表观遗传学领域中的关键问题，使研究人员能够在不同模型系统中检测DNA修饰的细胞核定位及其相对水平。该技术的主要优势在于，能够同时通过信号强度和分布模式来测量DNA修饰。该技术的一个意义在于，它有助于我们理解各种生物系统中DNA修饰潜在的功能模式。该技术还可进一步应用于通过免疫组织化学检测到的其他表位的计算分析。首先，打开共聚焦显微镜图像的LSM格式文件。选择图像处理，然后选择用于分析的所需图像。请注意，在比较不同样本之间的强度分布时，必须保持激光功率和增益的一致性，才能进行直接比较。接下来，点击“显示全部”，以显示所有图形控件，然后选择图形选项卡，并选择矩形工具来选定包含目标细胞核的区域。然后使用“裁剪区域”命令来分离出目标区域。将图像另存为新名称，并选择 LSM 或 CZI 格式，随后在 Zen Blue 软件中重新打开该文件。在 Zen Blue 中打开 ZEN 工作台，然后在 Zen Black 中使用“发送到 ZEN”命令，将文件在 Zen Blue 中打开。接下来，激活标有 2.5d 的选项卡，以启用图像的 2.5d 可视化。点击“显示全部”，使所有图形控件可见，并使用四个灰色滑块调整设置。这些滑块分别控制缩放、旋转、坐标轴倾斜以及比例尺的扩展与收缩。选择渲染模式以最佳显示各个峰，然后通过更改百分比来调整高度距离。百分比越低，各个峰的轮廓越清晰。在保存2.5D图像之前，单击2.5D图下方的灰色箭头，隐藏文件列表和图形工具。然后使用键盘上的打印屏幕键将图表保存为屏幕截图。在软件中打开图像处理选项，并打开目标文件。接着，选择轮廓选项卡，再选择显示全部选项卡，以访问所有格式化选项。在配置文件选项卡中，选择表格选项和箭头按钮。然后使用鼠标选择一个起点，并沿连续的多个细胞绘制一条线，系统将生成沿此线各细胞的强度分布图以及相应的强度测量值表格。请注意，该表格还提供了像素强度在红、绿、蓝荧光下的距离信息。单位为微米。要导出此数据，请在表格上单击右键，选择“保存表格”并将其保存为文本文件。要保存强度分布图，请选择导出选项，在弹出窗口中切换两个选项：标记图像文件格式以及图像窗口内容、单窗格、数据。然后按照提示保存文件。对每个需要的强度轮廓重复此过程。在软件中选择图像处理，并选取感兴趣的图像文件。然后选择标有“coloc”的标签页以进行共定位分析，并选择“show all”以访问所有格式化选项。在屏幕下半部分的四个标签页中，选择“co-localisation”，并选择表格和图像选项。接着选择该标签页顶部的第三个图标，其弹出文本标识为“closed besier”。使用此工具圈选单个细胞核。随后，数值将显示在表格中，并生成红色与绿色荧光的散点图。该图的坐标轴可移动，从而控制检测的设门范围。细胞核内所有像素强度均应视为阳性信号。由于DNA修饰水平在细胞核内分布不均，为纳入弱信号，我们不对数据进行设门。需要强调的是，是否应在分析中包含背景值仍存在争议。重要的是，重叠系数与两个通道之间的信号强度差异无关。而皮尔逊相关系数则假设信号之间存在线性关系。现在重复此圈选细胞核的过程，以完成整个数据集的采集。然后，要导出数据，可右键单击表格并按照选项保存数据。要保存共定位图像，请使用导出命令，并选择两个选项：标记图像文件格式以及图像窗口单窗格内容的数据，然后按照提示保存文件。采用所述方案，检测了两种5-甲基胞嘧啶氧化衍生物在分化中的成血样祖细胞中的空间分布情况。红色和绿色信号代表两种不同的DNA修饰。信号界限清晰，重叠较少。与预期一致，两种信号强度的分布模式及其对应的细胞位置彼此之间没有明显的重合。这种独特的模式表明，TET依赖的氧化作用可使五种甲基胞嘧啶在特定染色质区域生成不同的氧化衍生物。在Daoy髓母细胞瘤细胞和BXD室管膜瘤细胞中也进行了这两种DNA修饰的类似比较。这两种细胞系均来源于儿童脑肿瘤。定量结果显示，与Daoy细胞相比，BXD细胞中两种信号水平均显著降低。接下来，在未分化的hiPSCs中检测了5MC氧化衍生物的共定位情况，以及在诱导肝内胚层分化24小时后的hiPSCs中的共定位情况。在此分析中，随着分化诱导，信号共定位发生了显著变化，这可能归因于未分化细胞中五种 CAC 信号强度的降低。观看本视频后，您应能够充分理解如何生成 2.5D 强度图和轮廓图，以及如何获得共定位数据。本文所述的图像分析与可视化工具为表观遗传学研究提供了支持，可相对快速地比较不同实验组中各类 DNA 修饰信号。一旦掌握，该技术若操作得当，约需一小时即可完成。进行显微镜观察时，应避免过度曝光，并对不同实验组采用相同的设置。封片中的气泡和浸没不足可能导致局部荧光信号丢失，因此，对扫描区域进行目视检查至关重要。该流程可通过 Zen Blue 对细胞核进行分割并创建感兴趣区域，从而实现进一步自动化。这些区域可导入 Zen Black，以对多个细胞核进行共定位分析。

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