Name: 在生物环境的新技术的产生和观测化学发光 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 了解利用钌配合物化学发光进行术中成像的新技术，该技术具有高信噪比且无需入射光。此方法可应用于癌症等多种疾病状态的成像研究，为生物医学成像领域提供重要工具。

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作者感谢 Jan Grimm 教授和 Travis Shaffer 先生的有益讨论，以及 David Gregory 先生对手稿的编辑。特此致谢美国国立卫生研究院（NIH）癌症中心支持基金 P30CA008748-48 部分资助的纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSK）动物影像核心设施所提供的技术服务。作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）（基金项目：K25 EB016673 和 R21 CA191679，T.R.；4R00CA178205-02，B.M.Z.）、MSK 分子成像与纳米技术中心（T.R.）、Tow 基金会（B.C.）以及美国国家科学基金会研究生整合教育与研究培训项目（NSF IGERT 0965983，Hunter College，B.C. 和 T.M.S.）提供的慷慨支持。本研究工作得到了沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学科研经费的资助。

伦理声明：所有 体内 所描述的动物实验均依照纪念斯隆-凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSK）机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC）批准的方案及伦理准则进行。
1. 雾化装置的构建
<ol>
	<li>使用两个螺丝（4 x 25 mm2）将木制部件 A（12.5 x 2.5 x 1.8 cm3）垂直固定在部件 B（12.7 x 10.7 x 1.8 cm3）的中心位置。再使用一个螺丝将木制部件 C（11 × 2.5 × 1.8 cm3）固定在部件 A（12.5 x 2.5 x 1.8 cm3）的中部，使部件 C（11 x 2.5 x 1.8 cm3）仍可移动。参见图 1。</li>
	<li>在塑料 3 盎司小型喷雾瓶（D）的喷头扳机下端钻两个孔，将一根不锈钢杆（10 cm，1/16&#34; 钢）（E）穿过，形成两个环，分别位于扳机的两侧。</li>
	<li>用布基胶带（F）包裹喷雾瓶底部，防止扎带滑脱。使用两条塑料扎带（28 cm）（G）将喷雾瓶固定在木制部件 C（11 x 2.5 x 1.8 cm3）上。</li>
	<li>将 011 型舵机（I）的导线剪断，并将其与舵机控制器的松散导线（H）重新连接。然后，用布基胶带将舵机固定在木制部件 A（12.5 x 2.5 x 1.8 cm3）的顶部。</li>
	<li>使用回形针（K）将一支铅笔（J）固定在舵机摇臂上。用带塑料涂层的扭绞线（L）将铅笔的两端与不锈钢杆上的两个环紧密连接，并用布基胶带将线的末端固定在铅笔上。</li>
	<li>将舵机控制器的磁性电缆接头（M）剪下，并重新连接至扬声器电缆（N）。然后，用胶带将舵机控制器固定在木制部件 B（12.7 x 10.7 x 1.8 cm3）上。将一根带磁性接头的 w1 电缆从中间剪开，将其中一半连接至铜制扬声器电缆（1 m）的裸露端。将（磁性）i2 摇杆开关和 p1 电源连接至可用的 w1 电缆和 9V 电池。</li>
</ol>
2. 方法灵敏度的测定
<ol>
	<li>在1.5 mL 微型离心管中，配制[Ru(bpy)3]Cl2 以反渗透水（100 µL）溶解，浓度分别为 260 µg（347 nmol）、52 µg（69 nmol）、26 µg（34 nmol）、5 µg（6.9 nmol）、3 µg（3.5 nmol）、520 ng（694 pmol）、260 ng（347 pmol）、52 ng（69 pmol）、26 ng（34 pmol）、5 ng（6.9 pmol）和 3 ng（3.5 pmol）。</li>
	<li>混合各100 µL的[Ru(bpy)3]Cl2 溶液中加入100 µL硝酸铈铵（(NH₄)₂Ce(NO₃)₆）水溶液4)2Ce(NO3)6) 溶于水（25 mM）中，置于显微镜载玻片上。</li>
	<li>在生物发光检测仪中，通过初始化成像软件来设置采集程序。
	<ol>
		<li>登录用户个人资料，查找采集控制面板。点击 &#34;初始化&#34; 等待仪器准备就绪。</li>
		<li>寻找 &#34;成像模式&#34; 并确保 &#34;发光的&#34; 和 &#34;拍摄照片&#34; 已检查并确认 &#34;荧光&#34; 未受控制。</li>
		<li>改变 &#34;曝光时间&#34; 设置用于 &#34;发光的&#34; 至20秒。设置其余参数 &#34;发光的&#34; 如下所示： &#34;分箱&#34;培养基； &#34;光圈值&#34;：1；以及 &#34;发射滤光片&#34;开放。 
		注意：如果使用的仪器和实验条件与本文所述设置不同，曝光时间可能需要相应调整。</li>
		<li>对于 &#34;拍摄照片，&#34; 使用以下设置： &#34;曝光时间&#34;自动 &#34;分箱&#34;：培养基；以及 &#34;光圈值&#34;8. 调整 &#34;受试者身高&#34; 根据成像目标寻找 &#34;视野&#34; 下拉菜单。初始设置为 &#34;C.&#34; 更换为 &#34;B&#34; （相机与样品台之间的距离为14 cm）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在成像室底部放置一张黑色卡纸，并在其上放一片显微镜载玻片，以保护成像室免受氧化剂影响，从而搭建雾化器。取100 µL [Ru(bpy)3]Cl2-溶液中加入100 µL的(NH₄)₂SO₄水溶液4)2Ce(NO3)6. 观察绿色方框的十字线。
	<ol>
		<li>将成像样本放置在黑色卡纸上，使感兴趣区域位于样品台显示的绿色光源十字线中心。拆下固定在木制支架上的塑料喷雾瓶以准备雾化器，向塑料储液罐中加入三乙胺溶液（水/乙醇中1:3），然后将其重新安装到木制支架上。</li>
		<li>将雾化器放入生物发光检测仪内，并确保雾化器的电源线已与雾化器导线断开。确认电源开关处于开启状态，拨动开关处于关闭状态，且红色LED灯亮起。放置雾化器时，应使喷雾流向对准成像对象的目标区域，同时尽量减少喷嘴头部对相机观察成像对象时的视野遮挡。</li>
		<li>将小块黑色建筑纸覆盖在任何可能的热点上（例如， 用白色标记物标记显微载玻片或注射部位，以保护其免受喷雾影响。将雾化器遥控线至少40 cm长的部分放入成像室内，确保其不会干扰成像对象、雾化器或磁性门锁。关闭成像系统门。 
		注意：十字线的大小将根据 &#34;视野&#34; 设置中 &#34;活体成像&#34; 确保此设置为 &#34;B&#34;.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动成像序列以获取图像。点击 &#34;获取&#34; 在 &#34;采集控制面板&#34; 在第一个成像序列中，可根据需要启用自动保存功能（推荐），并选择一个数据文件夹。忽略以下内容 &#34;编辑成像标签&#34; 序列结束前的对话。 
	注意：控制软件会实时逐步显示仪器的操作过程。在完成测量准备并将样品台移动至正确位置后，软件会打开相机快门并开始计时。快门开启时，还可听到仪器发出的咔嗒声。</li>
	<li>快门打开时，通过三次拨动开关，喷洒三下三乙胺溶液（水/乙醇中1:3，每次喷洒量为0.24 ± 0.04 mL），以产生化学发光。 
	注意：测量过程中样品台会移动，请在仪器内部预留足够长度的电缆（至少40 cm）以满足移动需求。确保雾化器所要喷雾的溶液能够通过上升管道被顺利吸入，且管道内无气泡。准备多块雾化器备用电池，以备需要时更换。</li>
</ol>
3. 在体实验 静脉系统注射后的成像
<ol>
	<li>在1.5 mL 微量离心管中，制备100 µL含8至33 nmol [Ru(bpy)的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液3]Cl2. 配制 (NH4)2Ce(NO3)6 在水中（25 mM）同时进行。</li>
	<li>经静脉注射 100 µL 的 [Ru(bpy)3]Cl2 尾静脉注射至健康小鼠（n = 5）。</li>
	<li>注射后10分钟，通过CO处死小鼠2 窒息
	<ol>
		<li>从躯干处沿Y形切口去除皮肤，然后以U形切除肋弓以暴露心脏和肺。通过在右心房剪开一个出口，并用24号针头向左心室注入20 mL PBS，对小鼠进行灌注。18小心切开腹部皮肤，暴露肾脏和肝脏。沿器官纵向切割，形成可见的切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤 2.3-2.6 中所述设置采集，但需进行以下更改。
	<ol>
		<li>彻底清洗雾化器塑料储液罐后，将其填充入 (NH4)2Ce(NO3)6 在水中（25 mM）替代三乙胺。 
		注意：每次使用后必须彻底冲洗雾化器喷嘴，因为残留的 (NH4)2Ce(NO3)6 多次使用后可能会损坏喷嘴。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用完整的动物或器官样本进行成像。
	<ol>
		<li>对于全腹部成像，将小鼠尸体置于成像仪中，使打开的腹部朝向相机，头部朝向仪器后方。将待成像器官置于视野中央（例如， 肝脏或肾脏）置于绿光十字线框内。</li>
		<li>为进行单个器官的成像与定量，将小鼠从成像仪器中取出并固定。从已打开的体腔开始，分离并取出内脏器官（例如， 肾脏、肝脏、肺、肌肉、脾脏、脑和心脏）。切开后肢皮肤以取肌肉组织。用手术刀小心打开颅骨以取脑组织。
		<ol>
			<li>若感兴趣的器官为肝脏、肾脏或脾脏，将所有器官纵向切成两半，分别置于培养皿或黑色卡纸上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照步骤 2.3-2.6 中所述的程序，测定化学发光示踪剂在单个器官中的相对发射量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体内 淋巴结成像
<ol>
	<li>准备 10 µL 含有 80 nmol [Ru(bpy)3]Cl2 的 PBS 溶液。同时配制 25 mM 的 (NH4)2Ce(NO3)6 水溶液。</li>
	<li>将 10 µL 该溶液皮下注射至健康小鼠的后肢足垫（n = 5）。作为阴性对照，在对侧足垫注射 10 µL 纯 PBS。注射后 15 分钟，采用 CO2 窒息法处死小鼠。剥离双侧后肢皮肤，暴露至腘淋巴管直至腘淋巴结。</li>
	<li>按照步骤 3.4 所述设置采集参数。</li>
	<li>取出双侧后肢的腘淋巴结，将其切为两半，并按照前述方法（步骤 3.5.3）在培养皿中喷洒氧化剂，用于定量分析。</li>
</ol>

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<li>Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+its+applications+in+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Surgery%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and its applications in surgery.</a> Brit. J. Surgery. 97 (4), 463-465 (2010).</li>
<li>Barry, N. P. E., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+for+Metals+in+Medicine%3A+How+Nanotechnology+May+Help+To+Shape+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future.</a> ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).</li>
<li>Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+Emission+of+Cationic+Iridium+%28III%29+Complexes+Towards+the+Red+Through+Methoxy+Substitution+of+the+Cyclometalating+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand.</a> Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).</li>
<li>Truong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescence+detection+with+water-soluble+iridium%28III%29+complexes+containing+a+sulfonate-functionalised+ancillary+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand.</a> Analyst. 139 (22), 6028-6035 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种能够通过化学发光报告分子所发射的光子，在光学上清晰界定组织的技术。与其他更为成熟的技术4,5,6,7,8,9相比，该化学发光报告系统采用了一种非放射性的成像探针，可在极高灵敏度下实现检测。或许更为重要的是，化学发光成像无需激发光源（如光学荧光成像所需）20，这一特性可最大限度地减少自发荧光，并显著降低背景信号。
钌报告分子 [Ru(bpy)3]Cl2 具有一个 体内 用于成像目的的毒性在可耐受范围内（小鼠腹腔注射LD50：20...

近几十年来，成像技术彻底改变了医生诊断和监测疾病的方式。然而，这些成像技术主要局限于全身成像系统，例如正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）。癌症领域尤其受到关注，成像技术的突破显著改善了该疾病的诊断与治疗方式。尽管取得了这些进展，但仍有一个场所这些成像技术难以适用：手术室。虽然全身成像技术有助于术前手术规划，但其空间分辨率通常不足以帮助医生实时判断肿瘤组织是否已完全切除，或是否有残留肿瘤组织隐藏在手术切缘1。确保不遗留浸润性肿瘤切缘是外科手术最重要的目标之一，外科医生必须在彻底切除与谨慎保留组织之间谨慎权衡。若切除过多，患者将面临更严重的不良反应；若切除不足，则会增加肿瘤复发的风险2,3。因此，准确界定肿瘤切缘至关重要，我们认为化学发光术中成像技术可通过帮助外科医生可视化那些使用现有技术可能无法检测到的恶性组织，从而提高肿瘤切缘识别的准确性。
目前有许多成像技术正在被研究，以评估其作为术中成像系统的潜在应用价值。这些技术包括发射β射线和γ射线的探针4、光学荧光5、拉曼光谱6,7以及切伦科夫发光8,9。然而迄今为止，这些技术尚无一种被确立为临床常规工具。在这些方法中，光学荧光成像迄今已被证明最具前景，因此也是研究最为广泛的技术。尽管它已被证实是许多应用中的有效工具，但仍存在一定的局限性。事实上，其主要缺点在于生物组织本身固有的自发荧光所产生的背景信号。这种背景自体荧光信号是由于激发荧光团所需的外部光源同时激发了周围组织所致。从实际应用角度来看，这种自发荧光可能导致信噪比降低，从而限制该技术在手术室中的应用价值。
化学发光成像相较于荧光成像的主要优势在于无需激发光。因此，不存在背景自体荧光。在化学发光成像中，激发能量由化学反应产生。该过程不会产生非预期的背景信号，因而可实现更高的信噪比。这最终可能有助于更精确、更准确地检测手术切缘。令人略感意外的是，该方法作为术中成像技术的应用潜力至今尚未得到探索10。事实上，与此技术最接近的实例是小鼠中髓过氧化物酶介导的鲁米诺氧化反应11,12,13。因此，化学发光生物医学成像仍是一个研究较少的领域，但可能具备以下优势：（1）自体荧光极低，背景信号弱，信噪比高；（2）化学发光发射波长可调，覆盖可见光至近红外区域；（3）化学发光复合物可进行功能化修饰，结合现有连接技术及靶向生物分子，从而构建出大量可用于靶向分子成像的探针库14。
这项原理验证研究展示了基于钌的成像试剂在生物医学环境中应用化学发光成像的潜在价值。该化合物的化学发光特性已有深入研究，相关研究可追溯至20世纪60年代中期15。经化学激活后，该试剂可在约600 nm处发光16，这一波长非常适合医学成像应用。激活所需的能量由氧化还原反应提供，该反应产生一个激发态，其在水中的寿命为650 ns17，随后在激发态弛豫过程中释放出光子。通过使用专门设计的远程雾化器，我们能够在体外（ex vivo）和体内（in vivo）检测到该化合物。初步实验结果非常令人鼓舞，表明该技术值得进一步研究。

<table><tbody><tr><td>木制部件 A（12.5 &amp;times; 2.5 &amp;times; 1.8 cm）</td><td>&amp;nbsp;Woodcraft</td><td>131404</td><td>从一块 3/4&amp;rdquo; × 24&amp;rdquo; × 30&amp;rdquo; 的桦木胶合板上切割而成</td></tr><tr><td>木制部件 B（12.7 &amp;times; 10.7 &amp;times; 1.8 cm）</td><td>Woodcraft</td><td>131404</td><td>从一块 3/4&amp;rdquo; × 24&amp;rdquo; × 30&amp;rdquo; 的桦木胶合板上切割而成</td></tr><tr><td>木制部件 C（11 &amp;times; 2.5 &amp;times; 1.8 cm）</td><td>Woodcraft</td><td>131404</td><td>从一块 3/4&amp;rdquo; × 24&amp;rdquo; × 30&amp;rdquo; 的桦木胶合板上切割而成</td></tr><tr><td>螺丝（4 &amp;times; 25 mm）</td><td>Screwfix</td><td>79939</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Face Values 3 oz 迷你喷雾器</td><td>Bed, Bath and Beyond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢棒（10 cm，直径 1/16&amp;rdquo;）</td><td>Metals Depot Int. Inc.</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>Pencil Classic HB 铅笔</td><td>Papermate</td><td>58592</td><td></td></tr><tr><td>回形针</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>扬声器电缆</td><td>RCA Inc.</td><td>AH1650SN</td><td></td></tr><tr><td>Energizer 9V 碱性电池</td><td>Energizer Holdings Inc.</td><td>EN22</td><td></td></tr><tr><td>Hitech HS-82MG 微型伺服电机，6V 时输出扭矩为 3.4 kg/cm</td><td>Hitech RCD USA Inc.</td><td>32082S</td><td></td></tr><tr><td>名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>备注</td></tr><tr><td>28 cm 塑料扎带</td><td>General Electric Inc.</td><td>50725</td><td></td></tr><tr><td>管道胶带</td><td>3M Inc.</td><td>3939</td><td></td></tr><tr><td>littleBits w1 导线模块</td><td>littleBits Inc.</td><td>w1 wire</td><td></td></tr><tr><td>littleBits p1 电源模块</td><td>littleBits Inc.</td><td>p1 power</td><td></td></tr><tr><td>littleBits i2 拨动开关模块</td><td>littleBits Inc.</td><td>i2 toggle switch</td><td></td></tr><tr><td>littleBits 011 伺服电机模块</td><td>littleBits Inc.</td><td>011 servo</td><td></td></tr><tr><td>20 cm 带塑料涂层的绞合线扎带</td><td>Four Star Plastics</td><td>71TIE8000</td><td></td></tr><tr><td>三(2,2&amp;prime;-联吡啶)二氯合钌(II)六水合物</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>224758</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸铈铵</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter Healthcare</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PBS1</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td></td><td></td><td>使用 Millipore Milli-Q 系统（R &amp;ge; 18 M&amp;Omega;）纯化</td></tr><tr><td>雌性裸鼠（远交系）</td><td>Jackson Laboratories</td><td>1929</td><td>5–6 周龄</td></tr><tr><td>品系 C57BL/6J&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU/J 雄性小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2019</td><td>6 &amp;ndash; 8 周龄</td></tr><tr><td>IVIS 200 生物发光检测仪</td><td>Caliper Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Image 4.2 软件</td><td>Perkin-Elmer</td><td>128165</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>ThermoScientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

一种在生物环境中生成并观察化学发光的新技术

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

术中成像技术有望使外科手术更加安全和有效；正因如此，这些技术正迅速进入手术室。本文介绍一种新方法，该方法采用了一种尚未用于术中成像的化学发光成像技术。该方法利用基于钌的化学发光报告分子，并结合定制的喷雾系统，实现成像。 离体 或 体内 信噪比高的图像。基于钌的报告分子在接触水相氧化溶液后，于周围组织内发生再还原反应并发光。该方法使我们能够检测到低至 6.9 pmol/cm 的报告分子浓度。2在本研究中，我们提供了一份关于概念验证的可视化指南 体内 涉及小鼠皮下和静脉注射的研究。结果表明，该技术是进一步开展临床前研究的有力候选者，最终可能成为手术室中有用的工具。

方案第1节中描述的雾化系统可使用易得的材料以低成本构建。该系统旨在作为生物发光检测仪内还原/氧化剂远程触发喷雾的嵌入装置（图1）。我们的设计允许雾化器在距离镜头14 cm的位置安全地在生物发光检测仪内运行。运行过程中未观察到镜头起雾或模糊现象。我们选择市售的化学发光试剂[Ru(bpy)3]Cl2用于本方法的开发，因其价格低廉、在水溶液中稳定性高、氧化还原行为已被充分表征，并具有化学发光特性（图2）19。最低可检测信号可通过方案第2节所述方法确定：在载玻片上，将一滴[Ru(bpy)3]Cl2（100 µL，6.9 pmol–347 nmol，溶于H2O）与(NH4)2Ce(NO3)6（100 µL，25 mM）反应进行氧化。随后使用雾化器喷洒三乙胺溶液（水/乙醇中1...

本方案描述了一种新的术中成像技术，该技术利用钌配合物作为化学发光光源，从而在成像过程中产生高信噪比信号 体内 成像。术中成像是一个不断发展的领域，有望彻底改变外科手术的实施方式。

术中成像技术有望使外科手术更加安全和有效；正因如此，这些技术正在……

本方案的总体目标是提供一种新的临床前及术中化学发光成像技术，该技术在信噪比和检测限方面相较于现有的光学技术具有优势。该方法有助于回答传统光学成像技术在生物科学相关多个领域中无法触及的关键问题。该技术的主要优点在于具有高信噪比，且无需激发光源或辐射。我们发现，由于该技术具有高信噪比，其应用意义实际上可延伸至包括癌症在内的多种疾病状态的术中成像。由于该技术无需入射光，因此不存在入射光吸收的问题。此外，存在大量可用的化学工具，可用于对化学发光核心分子进行功能化修饰。开始实验时，用反渗透水配制100微升的三(联吡啶)氯化钌(II)标准溶液。然后，在显微镜载玻片上将每种标准溶液与100微升用反渗透水配制的25毫摩尔浓度的硝酸铈铵溶液混合。打开生物发光读取成像软件，点击初始化。在成像模式下，确保选中生物发光和拍照选项，取消选中荧光选项。设置生物发光的曝光时间、binning、光圈值（f/stop）和发射滤光片参数。设置拍照的曝光时间、binning 和光圈值（f/stop）参数。然后根据待成像样品调整样本高度。当相机与样品台之间距离为14厘米时，将视野设置为B。用黑色卡纸覆盖样品台上生物发光检测仪成像室的底部。然后将载有标准混合液液滴的载玻片放置在样品台上，使液滴位于绿色光源十字线的中心。接着，用体积比为1:3的三乙胺水-乙醇混合溶液（水与乙醇体积比为50:50）填充自制雾化器的三盎司喷雾瓶。确保抽吸管中无气泡存在。将雾化器组件放入成像室中，喷嘴朝向待成像的液滴，同时确保不遮挡相机对液滴的视野。确认雾化器电源开关和电源指示灯已开启，磁性拨动开关处于关闭状态，且雾化器电源线和遥控线无缠绕。使用小块黑色建筑纸覆盖载玻片上的热点区域，如划痕等标记处。将雾化器远端导线至少40厘米长的部分放入成像室内。轻轻关闭室门，避免压折雾化器导线。在仪器软件中，点击“采集”，启用自动保存功能，并设置数据文件路径。启动成像序列。当快门发出可听见的咔哒声打开时，将雾化器开关切换三次，向样品喷洒三次三乙胺溶液。对每张标准载玻片重复此操作，以确定钌成像试剂的最低可检测浓度。开始活体成像实验时，配制100微升含8至33纳摩尔三(联吡啶)氯化钌(II)的磷酸盐缓冲液溶液。配制25毫摩尔的硝酸铈铵水溶液。随后，将100微升钌成像剂通过尾静脉注射至健康小鼠体内。注射后10分钟，通过二氧化碳窒息法处死小鼠。在躯干上做Y形切口以去除皮肤，然后移除肋弓以暴露心脏和肺。在右心房剪开一个出口，通过24号针头向左心室注入20毫升PBS。切开腹部皮肤以暴露肾脏和肝脏。如果目标器官是肝脏、肾脏或脾脏，则在器官上做一个可见的纵向切口。在生物发光成像仪软件中设置一个新的成像序列。进行全腹部成像时，将小鼠放置于成像室中，使其敞开的腹部朝向相机，头部指向仪器后方。将感兴趣器官置于绿色光箱的十字准线上。彻底清洗雾化器组件的喷雾瓶及喷嘴，然后向瓶中加入硝酸铈铵溶液。将雾化器放入成像室中，喷嘴朝向成像位置。确保相机无遮挡，导线无缠绕，且遥控线至少有40厘米位于室内。关闭成像室，启动成像程序。当快门发出咔嗒声打开时，迅速拨动开关三次，向成像部位喷洒三次氧化剂。成像完成后，取下雾化器组件，并彻底冲洗喷嘴，以防止硝酸铈铵结晶。对于后续的单个器官成像与定量分析，将小鼠从仪器上取下，并从打开的体腔开始，切除内部器官。切开后肢皮肤以切除肌肉组织样本。若目标器官为肝脏、肾脏或脾脏，则沿纵轴将器官切成两半，随后将器官置于培养皿或黑色卡纸上。以与整体动物相同的方式对每个器官进行成像，每次扫描后冲洗喷雾喷嘴。在本实验中，小鼠被注射了一种基于钌的成像剂，并对目标组织喷洒氧化剂以诱导化学发光。在这些条件下，该成像剂的最低可检测浓度确定为每平方厘米6.9皮摩尔。使用生物发光检测仪获得了目标器官的白光图像中的化学发光信号。静脉注射后，化学发光信号主要出现在肾脏，表明亲水性的三(联吡啶)合钌(II)阳离子通过肾脏排泄。成像剂与单独PBS相比，在肾脏中的信噪比为27:1，在肝脏中的信噪比为21:1。通过皮下注射更高浓度的钌基成像剂，对小鼠腘窝淋巴结也进行了评估。含有成像剂的淋巴结表现出明显更强的辐射信号，相较于仅含PBS的淋巴结。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行该操作时，重要的是要避免环境光的干扰，并防止与三联吡啶钌发生污染。该技术开发完成后，将为生物分子成像领域的研究人员探索小鼠癌症等疾病状态提供新的途径。尽管该方法能够揭示传统光学成像技术无法触及的科学问题，但任何可通过传统技术研究的问题，原则上也均可通过化学发光技术加以解决。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

在生物环境的新技术的产生和观测化学发光

本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。...

利用荧光素酶对小鼠细菌感染进行成像

本文描述了在转移性乳腺癌细胞生长和转移过程中，对其表达的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的生物发光反应进行构建、可视化及定量的方法。 体内.

体内 双底物生物发光成像

昼夜节律钟在单个细胞内发挥作用，即具有细胞自主性。本文描述了利用非侵入性的、基于荧光素酶的实时生物发光技术构建细胞自主性节律钟模型的方法。报告基因细胞为研究昼夜节律生物学提供了易于操作且功能明确的模型系统。...

利用荧光素酶生物发光报告系统监测细胞自主性基因表达的昼夜节律

本文介绍了将携带lux标记的细菌给予小鼠，并随后使用IVIS生物发光成像进行活体分析的方法。...

活体生物发光细菌成像 In Vivo

在本视频中，我们介绍一种方法，强调利用生物发光检测技术对药物进行灵敏且快速的筛选。这些药物可单独测试，也可联合测试，以评估其作用机制中的协同效应。...

基于细胞生物发光的检测方法：一种用于组合药物筛选的高通量技术

表达细菌生物发光基因盒（lux）的哺乳动物细胞能够自主发光。化学物质处理后所产生的生物发光动态变化已被证明可反映处理对细胞生长和代谢的影响，因此这类细胞可作为一种低成本、连续、实时的毒性筛选工具，并可轻松适用于高通量自动化检测。...

自主生物发光的哺乳动物细胞用于细胞毒性的连续与实时监测

蛋白质之间的相互作用是所有细胞过程的基础。利用生物发光共振能量转移技术，可以在活细胞中实时监测一对蛋白质之间的相互作用。此外，还可以评估潜在致病性突变的影响。...

利用生物发光共振能量转移在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用

通过系统阐述荧光未结合发光激发（FUEL）的相关原理，并验证其与多种荧光染料及抗体靶向条件的兼容性，拓展FUEL技术的基础与应用范围。...

超越BRET：基于未结合发光激发的荧光（FUEL）

基因编码的荧光素酶是一种常用的非侵入性基因表达报告分子。利用自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪（ALLIGATOR），可在多种条件下对生物发光细胞进行长期连续记录。本文展示了ALLIGATOR在昼夜节律研究中的应用方法。...

使用自动化纵向荧光素酶成像气体与温度优化记录仪（ALLIGATOR）灵活检测生物发光报告基因

生物发光细菌通过多种机制调控发光，例如群体感应。该新方法能够 原位 生物发光现象的研究及光发射与细胞密度的相关性。一种人工生物发光 大肠杆菌 系统可实现对特征的表征 lux...

原位 测量与生物发光细菌细胞密度和光发射的相关性

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生物发光光遗传学2.0：利用生物发光激活光感受蛋白 体外 和 体内

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