一种在生物环境中生成并观察化学发光的新技术

本方案的总体目标是提供一种新的临床前及术中化学发光成像技术，该技术在信噪比和检测限方面相较于现有的光学技术具有优势。该方法有助于回答传统光学成像技术在生物科学相关多个领域中无法触及的关键问题。该技术的主要优点在于具有高信噪比，且无需激发光源或辐射。

我们发现，由于该技术具有高信噪比，其应用意义实际上可延伸至包括癌症在内的多种疾病状态的术中成像。由于该技术无需入射光，因此不存在入射光吸收的问题。此外，存在大量可用的化学工具，可用于对化学发光核心分子进行功能化修饰。

开始实验时，用反渗透水配制100微升的三(联吡啶)氯化钌(II)标准溶液。然后，在显微镜载玻片上将每种标准溶液与100微升用反渗透水配制的25毫摩尔浓度的硝酸铈铵溶液混合。打开生物发光读取成像软件，点击初始化。

在成像模式下，确保选中生物发光和拍照选项，取消选中荧光选项。设置生物发光的曝光时间、binning、光圈值（f/stop）和发射滤光片参数。设置拍照的曝光时间、binning 和光圈值（f/stop）参数。

然后根据待成像样品调整样本高度。当相机与样品台之间距离为14厘米时，将视野设置为B。用黑色卡纸覆盖样品台上生物发光检测仪成像室的底部。

然后将载有标准混合液液滴的载玻片放置在样品台上，使液滴位于绿色光源十字线的中心。接着，用体积比为1:3的三乙胺水-乙醇混合溶液（水与乙醇体积比为50:50）填充自制雾化器的三盎司喷雾瓶。确保抽吸管中无气泡存在。

将雾化器组件放入成像室中，喷嘴朝向待成像的液滴，同时确保不遮挡相机对液滴的视野。确认雾化器电源开关和电源指示灯已开启，磁性拨动开关处于关闭状态，且雾化器电源线和遥控线无缠绕。使用小块黑色建筑纸覆盖载玻片上的热点区域，如划痕等标记处。

将雾化器远端导线至少40厘米长的部分放入成像室内。轻轻关闭室门，避免压折雾化器导线。在仪器软件中，点击“采集”，启用自动保存功能，并设置数据文件路径。

启动成像序列。当快门发出可听见的咔哒声打开时，将雾化器开关切换三次，向样品喷洒三次三乙胺溶液。对每张标准载玻片重复此操作，以确定钌成像试剂的最低可检测浓度。

开始活体成像实验时，配制100微升含8至33纳摩尔三(联吡啶)氯化钌(II)的磷酸盐缓冲液溶液。配制25毫摩尔的硝酸铈铵水溶液。随后，将100微升钌成像剂通过尾静脉注射至健康小鼠体内。

注射后10分钟，通过二氧化碳窒息法处死小鼠。在躯干上做Y形切口以去除皮肤，然后移除肋弓以暴露心脏和肺。在右心房剪开一个出口，通过24号针头向左心室注入20毫升PBS。

切开腹部皮肤以暴露肾脏和肝脏。如果目标器官是肝脏、肾脏或脾脏，则在器官上做一个可见的纵向切口。在生物发光成像仪软件中设置一个新的成像序列。

进行全腹部成像时，将小鼠放置于成像室中，使其敞开的腹部朝向相机，头部指向仪器后方。将感兴趣器官置于绿色光箱的十字准线上。彻底清洗雾化器组件的喷雾瓶及喷嘴，然后向瓶中加入硝酸铈铵溶液。

将雾化器放入成像室中，喷嘴朝向成像位置。确保相机无遮挡，导线无缠绕，且遥控线至少有40厘米位于室内。关闭成像室，启动成像程序。

当快门发出咔嗒声打开时，迅速拨动开关三次，向成像部位喷洒三次氧化剂。成像完成后，取下雾化器组件，并彻底冲洗喷嘴，以防止硝酸铈铵结晶。对于后续的单个器官成像与定量分析，将小鼠从仪器上取下，并从打开的体腔开始，切除内部器官。

切开后肢皮肤以切除肌肉组织样本。若目标器官为肝脏、肾脏或脾脏，则沿纵轴将器官切成两半，随后将器官置于培养皿或黑色卡纸上。

以与整体动物相同的方式对每个器官进行成像，每次扫描后冲洗喷雾喷嘴。在本实验中，小鼠被注射了一种基于钌的成像剂，并对目标组织喷洒氧化剂以诱导化学发光。在这些条件下，该成像剂的最低可检测浓度确定为每平方厘米6.9皮摩尔。

使用生物发光检测仪获得了目标器官的白光图像中的化学发光信号。静脉注射后，化学发光信号主要出现在肾脏，表明亲水性的三(联吡啶)合钌(II)阳离子通过肾脏排泄。成像剂与单独PBS相比，在肾脏中的信噪比为27:1，在肝脏中的信噪比为21:1。

通过皮下注射更高浓度的钌基成像剂，对小鼠腘窝淋巴结也进行了评估。含有成像剂的淋巴结表现出明显更强的辐射信号，相较于仅含PBS的淋巴结。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要避免环境光的干扰，并防止与三联吡啶钌发生污染。该技术开发完成后，将为生物分子成像领域的研究人员探索小鼠癌症等疾病状态提供新的途径。尽管该方法能够揭示传统光学成像技术无法触及的科学问题，但任何可通过传统技术研究的问题，原则上也均可通过化学发光技术加以解决。