在生物环境的新技术的产生和观测化学发光

该协议描述了一种新的术中成像技术，该技术使用钌配合物作为化学发光发射源，从而在体内成像过程中产生高信噪比。术中成像是一个不断扩大的领域，可能会彻底改变外科手术的执行方式。

该协议的总体目标是提供一种新的临床前、术中、化学发光成像技术，该技术可以在信噪比和检测限方面提供优于现有光学技术的优势。这种方法可以帮助回答与生物科学相关的许多领域中传统光学成像技术无法解决的关键问题。这种技术的主要优点是它具有很高的信噪比，并且它既不需要即时光也不需要辐射。

因此，我们发现，由于该技术必须提供高信噪比，这项技术的影响确实延伸到包括癌症在内的多种疾病状态的术中成像。由于这种技术不需要入射光，因此入射光吸收没有问题。此外，还有一个大型化学工具箱可用于功能化化学发光核心分子。

要开始该程序，请在反渗透水中制备 100 微升三（拜哌啶）钌 （II） 氯化物标准溶液。然后，将每个标准品与显微镜载玻片上的 100 微升 25 毫摩尔硝酸铈铵溶液在反渗透水中混合。打开生物发光阅读器成像软件，然后单击初始化。

在成像模式下，确保选中 Lumiminance 和 Photo，并取消选中 Florescent。设置发光曝光时间、像素合并、光圈和发射滤镜参数。设置照片曝光时间、像素合并和 f/stop 参数。

然后根据要成像的样品设置被摄体高度。将 view 设置为 B，相机和样品台之间的距离为 14 cm。用黑色建筑纸覆盖样品台中生物发光阅读器成像室的地板。

然后将带有标准混合物液滴的第一张载玻片放在样品台上，使液滴在绿色灯箱十字准线的中心。接下来，在定制雾化器的 3 盎司喷雾瓶中加入 1：3 的三乙胺溶液，溶于 50/50 的水和乙醇溶液中。确保吸液管中没有气泡。

将雾化器组件放入成像室中，喷嘴指向要成像的液滴，而不会阻碍液滴的相机视图。确保雾化器电源开关和电源指示灯亮起，磁性拨动开关关闭，并且电源雾化器和遥控线没有缠结。用小块黑色结构纸覆盖载玻片上的标记等热点。

将至少 40 厘米的雾化器遥控线放入成像室中。轻轻关闭腔室门，不要卷曲雾化器电线。在仪器软件中，单击 acquire（采集），启用自动保存并设置数据文件路径。

启动成像序列。当快门打开并发出咔嗒声时，将雾化器拨动开关切换 3 次，将三乙胺溶液喷洒到样品上。对每个标准玻片重复该过程，以确定钌显像剂的最低可检测浓度。

要开始体内成像程序，请准备 100 微升溶液，其中含有 8 至 33 纳摩尔的三（拜哌啶）钌 （II） 氯化物，溶于磷酸盐缓冲盐水中。制备 25 毫摩尔的硝酸铈铵水溶液。接下来，将 100 微升钌显像剂静脉注射到健康小鼠的尾静脉中。

注射后 10 分钟通过二氧化碳窒息处死小鼠。用 Y 形切口从躯干上去除皮肤，然后去除肋弓以露出心脏和肺。在右心房切开一个出口，通过 20 号针头将 24 毫升 PBS 注射到左心室。

切开腹部皮肤，露出肾脏和肝脏。如果感兴趣的器官是肝脏、肾脏或脾脏，请在器官上做一个可见的纵向切口。在生物发光阅读器软件中准备新的成像序列。

对于整个腹部成像，将鼠标放在成像室中，张开的腹部面向相机，头部指向仪器的后部。将感兴趣的器官置于绿色灯箱十字准线的中心。彻底洗掉雾化器组件上的喷雾瓶和喷嘴，然后用硝酸铈铵溶液填充瓶子。

将雾化器放入成像室中，喷嘴对准成像部位。确保摄像机畅通无阻，电线没有缠结，并且遥控线至少有 40 厘米的距离在暗室中。关闭腔室并开始成像序列。

当快门咔嗒一声打开时，切换开关 3 次，将氧化剂喷洒到成像部位 3 次。成像后，拆下雾化器组件并彻底冲洗喷嘴，以防止硝酸铈铵结晶。对于随后的单个器官成像和定量，从仪器中取出鼠标并从开放的体腔开始切除内部器官。

切开后腿皮肤以切除肌肉组织样本。如果感兴趣的器官是肝脏、肾脏或脾脏，请将器官纵向切成两半。然后将器官放在培养皿或一张黑色建筑纸上。

以与整个动物相同的方式对每个器官进行成像，在每个序列后冲洗喷嘴。在此过程中，给小鼠注射钌基显像剂，并用氧化剂喷洒感兴趣的组织以诱导化学发光。在这些条件下，显像剂的最低可检测浓度被确定为每平方厘米 6.9 皮摩尔。

使用生物发光读数仪获得感兴趣器官的白光图像中的化学发光。静脉注射后，化学发光信号主要在肾脏中观察到，表明肾脏消除了亲水性三 （bypiridine） 钌 （II） 阳离子。显像剂与单独使用 PBS 的信噪比在肾脏中为 27：1，在肝脏中为 21：1。

还通过皮下注射更浓的钌基显像剂溶液来评估小鼠腘窝淋巴结。含有显像剂的淋巴结比单独含有 PBS 的淋巴结显示出明显更大的光泽。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。

在尝试此过程时，请务必记住排除环境光并避免钌 tris bpy 污染。开发后，这项技术将为生物分子成像领域的研究人员探索小鼠癌症等疾病状态铺平道路。虽然这种方法可以深入了解传统光学成像技术无法解决的问题，但任何可以用传统技术研究的问题都可能通过化学发光来解决。