高通量机器人辅助分离温度敏感致死突变体 莱茵衣藻

该实验的总体目标是利用机器人技术和标准化检测方法，简化对衣藻中温度敏感致死突变的分离过程，从而确定该生物体内的必需基因和通路。我们关注真核生物中必需细胞功能的保守性与差异性，而研究这一问题的方法就是通过影响这些过程中必需基因的突变。

为了实现这一目标，需要一个非常全面的突变体集合，而您将要听到的方法正是我们用于构建此类集合的技术。我们以绿色藻类莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作为植物界的一个代表性模式生物进行研究。该技术的主要优势在于，几乎可以在每一个必需的生物学通路中发现温度敏感致死突变。

该方法无需预先了解基因功能或进行靶向诱变。从致死表型可直接推断突变基因的分子功能，从而帮助我们筛选出影响多种唾液酸化通路（超出细胞周期调控范围）的有趣突变。

在25摄氏度光照条件下，于100毫升Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）培养基中培养衣藻细胞，使其OD750达到0.2至0.5。根据文本方案，分别在两种遗传背景下独立进行紫外线诱变。取每种培养物样品在显微镜下检查，以确认细胞具有活力且无污染。

接下来将培养物稀释至 OD 750 为 0.003，然后用铝箔包裹瓶体，以确保菌体密度均匀，因为该菌株具有趋光性，会朝特定方向游动。根据文本方案调整悬浮液密度后，安装一个适用于液体分配器的小型管盒，并按照制造商说明进行一系列清洗以实现灭菌，防止污染。使用八通道注射器液体分配器管盒，将培养物以每滴 2 µL、共 4 × 96 滴的形式点样于干燥的矩形平板上。

轻轻敲击培养皿边缘，使所有液滴融合成一层均匀的液膜，并立即盖上皿盖，避免光照。待液体干燥后，将培养皿置于杀菌紫外灯下照射，照射时间根据经验确定，以使存活菌中温度敏感型突变体（ts突变体）的产量达到最佳。随后，将培养皿转移至黑暗环境中，于室温孵育8至24小时。

然后将平板置于21摄氏度、有光照的培养箱中。约10天后，当菌落已生长但尚未融合时，将平板放入相应的堆栈中，作为机器人挑取菌落的源板。随后在矩形平板上挑取菌落制备384阵列，并在21摄氏度、有光照条件下培养约一周时间。

使用复制平板机器人，将384孔板阵列浓缩为1536孔板阵列，并将平板置于21摄氏度培养箱中培养约三天。将1536孔板阵列分别复制到两块平板上，一块置于21摄氏度培养箱中，另一块置于33摄氏度培养箱中。在33摄氏度下培养24小时后，将来自33摄氏度培养箱的平板复制到一组预热的新平板上，并将其放回33摄氏度培养箱中。

在33摄氏度下培养三天，随后在21摄氏度下培养五天后，使用数码相机拍摄带有九个对齐标记的网格平板。然后交替拍摄21摄氏度和对应的33摄氏度培养的平板，所有平板均置于固定框架中，以保持精确的方向一致。使用定制的Matte Lab图像分析软件对成对的21摄氏度和33摄氏度平板图像进行处理，以消除背景并将图像分割为1536阵列。

该程序将根据每个位置的总像素强度确定检测到的生物量。将软件生成的所选菌落列表作为指令文件载入单菌落挑取机器人系统。随后，根据机器人的操作说明准备源平板和目标平板，并让机器人将选定的菌落挑取至阵列中。

将目标平板置于21摄氏度培养箱中培养约五天，以制备库存平板。在按照文本方案完成第二次生物量积累测定并复制100块平板后，将该100块平板的新鲜副本再复制三份。在机器人中完成第三块平板的设置并点样菌落后，对筛选平板上每个点样区域在零时点拍摄显微照片，随后将平板置于33摄氏度培养箱中进行培养。

在将筛选平板从33摄氏度培养箱中取出后的不同时间点，迅速拍摄显微照片，确保平板固定装置和载物台控制器经过精确校准，以便在每个时间点获得相同细胞的图像。分析显微图像，并根据预定标准筛选突变体。将最终选定的突变体点种至96孔阵列琼脂平板上，确保每块平板中的突变体具有相同的交配型和药物抗性。

将大量阵列菌落转移至96孔微孔板中的无氮配子诱导培养基中。将微孔板置于光照条件下孵育约五小时，以诱导配子形成。将含有不同抗性筛选标记且交配型相反的菌株悬液分别加入含有无氮配子诱导培养基的离心管中，用于配子形成。

将目标板中的样品与20微升的交配混合液体积混合。在光照条件下约10分钟后，从每个孔中分别取5微升样品点样两次：一次点在TAP平板上用于连锁测试，另一次点在含有5微摩尔帕罗霉素和9微摩尔潮霉素的TAP平板上用于互补测试。

在培养互补测试平板后，将平板复制成两份以进行温度敏感（ts）表型鉴定。根据文字方案检测菌落的温度敏感（ts）表型。在对衣藻单细胞进行照射后，细胞在允许温度下生长十天，然后以阵列形式挑取，如此处所示。

将获得的384孔板合并为1536阵列。测试了三种紫外照射时间以产生衣藻（Chlamydomonas）温度敏感型（ts）突变体。根据经验，1.5分钟的照射时间获得的温度敏感型突变体最多。

然而，迄今为止，一分钟暴露时间获得了最多的细胞周期候选基因。在本实验中，进行了两次连续的温度敏感型（ts）表型检测，分离并表征了约3000个ts突变体，通过延时显微镜进行表型分析。如图所示，为从下游分析流程中剔除高频出现的基因，对新获得的候选基因进行了互补实验和连锁检测，检测对象为已表征且具有两个以上等位基因的基因。

这些菌落与查询菌株无互补现象，因此是被查询基因的新型温度敏感等位基因。这类菌落通常被排除在进一步表征之外。一旦掌握，该技术可实现高通量操作。

数千个温度敏感型突变体仅需两到三轮诱变即可分离获得。分离得到温度敏感型突变体后，关键的后续步骤是筛选其中一部分进行深入研究，观察其致死表型的多样性尤为引人兴趣。表型分析可为分子功能提供线索，同时也有助于我们优先选择值得进一步研究的突变体。

需要注意的是，突变体的基因组中可能含有数百甚至数千个突变。通常只有一个突变是致病原因，但有时需要两个突变共同作用才能产生温度敏感（ts）表型，这种情况可通过四分体分析来确定。通过本实验流程，可利用高通量测序技术对混合突变体进行测序分析，从而鉴定出致病突变。所鉴定出的基因有时会携带提示其功能的突变，也可能是功能未知的新序列，这将十分有趣且具有研究价值。

衣藻一直是研究植物界细胞生物学的极佳模式系统。你所听到的这些实验方法将有助于开展对该生物体的研究，以探索一些迄今相对未被深入研究的重要生命过程，我们希望这些研究成果也将适用于更广泛的植物界。