Name: 温度敏感致死突变体的高通量机器人辅助隔离莱茵衣藻 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 了解莱茵衣藻温度敏感致死突变体的高通量机器人辅助分离方法。该技术利用紫外线诱变和自动化筛选系统，无需预先了解靶基因即可鉴定真核生物必需基因与关键通路。

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我们感谢Cross实验室成员提供的建议和有益的讨论。本工作由PHS 5RO1-GM078153和 西蒙斯基金会授予Michal Breker的初级研究员奖

1. 紫外线诱变
<ol>
	<li>制备 100 - 200 块含三羟甲基氨基甲烷-乙酸盐-磷酸盐（TAP）培养基的矩形琼脂平板9,10几天前准备好这些平板，置于实验台上干燥，以确保后续步骤中悬浮细胞能够迅速被吸收。</li>
	<li>培养衣藻细胞至0.2 - 0.5光密度（OD）750在25 °C、100 rpm振荡条件下，于100 ml液体TAP培养基中光照培养约2天。 
	注意：紫外线诱变在两种不同的遗传背景下独立进行：Mat- Hygror （赋予对潮霉素B的抗性）以及Mat+ Paror （赋予对巴龙霉素的抗性）。抗生素的选择是任意的，只要两种交配类型具有互补的药物抗性即可。</li>
	<li>在显微镜下检查每种培养物的样品，以确保细胞具有活性、状态良好（游动且完整），且无污染。 
	注意：培养物过度生长 &#34;碰撞&#34; 并失去活性，表现为 &#34;鬼影细胞&#34; 在相差显微镜下观察。摇瓶培养物一旦达到饱和，不应继续培养。 &#34;幽灵&#34; 该现象在步骤1.3中易于检测。</li>
	<li>将培养物稀释至 0.003 OD750用铝箔包裹瓶子，以确保菌体分布均匀，因为该菌株具有运动性，会根据光照方向进行定向游动。
	<ol>
		<li>根据计划的紫外剂量调整悬液密度，使考虑细胞杀伤后，平板上形成 200 - 600 个存活菌落（图1）。参见 表1 有关紫外线照射时间的信息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装一个适用于液体分配器的小管盒，并根据制造商的说明进行一系列清洗以实现灭菌，防止污染。</li>
	<li>使用 8 x 12 液体分配器，将 4 x 96 滴、每滴 2 µl 的液体分配到矩形培养板上（图1）。轻敲培养板边缘，确保所有液滴融合成一层薄液，并立即盖上盖子，避免光照。
	<ol>
		<li>为确保细胞充分且均匀地分散成单细胞，应使用干燥的培养皿（如上所述），并迅速盖上皿盖，以防止细胞因光照而游动。将盖好的培养皿保持水平并置于黑暗环境中，直至所有液体被完全吸收。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将平板置于杀菌紫外灯（30瓦杀菌紫外灯管）下，照射时间根据经验确定，以在存活菌中获得最适量的温度敏感型（ts-）突变体。此处采用40–50 cm距离下照射0.5–1.5分钟，使杀灭率达到90–99.9%。存活菌株含有100–1,000个由紫外线诱导的点突变，其中约10%影响编码序列。
	<ol>
		<li>为了确保紫外线照射达到最大效能，同时避免因光依赖性DNA修复而导致的回复突变11,12此步骤需在避光条件下操作，照射后立即用暗盒包装培养板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板置于室温下避光孵育 8 - 24 小时。</li>
	<li>将培养皿置于21 °C、有光照的培养箱中培养以形成菌落。菌落形成约需10天。务必用塑料袋包裹培养皿，并在袋内放入吸水纸以吸收冷凝液。否则，蒸发和冷凝循环可能为污染物进入培养皿提供液膜通道。</li>
	<li>将平板按相应堆叠顺序装载，作为机器人挑取菌落的源板（图2)。在矩形平板上挑选菌落制备384孔阵列，并在21 °C光照条件下培养（约1周）。</li>
	<li>使用复制接种机器人将384阵列压缩为1,536阵列（4:1）图3），并将培养板置于21 °C培养箱中培养约3天。</li>
	<li>将1,536阵列复制到两块平板上，分别放入21 °C培养箱（允许温度）和33 °C培养箱（限制温度）中。24小时后，将33 °C培养的平板转接至一组预热的新平板，并置于33 °C培养箱中继续培养。 
	注意：进行二次铺板的原因是，某些温度敏感型致死突变体即使在铺板后第一个细胞周期即发生生长阻滞，仍可能积累大量生物量。二次复制铺板可消除此类信号，显著提高检测灵敏度。</li>
	<li>在33 °C下培养3天以及在21 °C下培养5天后，使用数码相机对平板进行拍照。将平板固定在专用支架中。使用 &#34;网格板&#34; 用九个对齐标记标示，并与培养皿一同拍摄图4）。将培养皿拍摄为交替配对的21 °C和33 °C（21/33）图像。 
	注意：由于野生型在 33 °C 下的生长速度明显快于 21 °C，因此采用不同的孵育时间以使生长水平一致。</li>
</ol>
2. 温度敏感型突变体候选株的鉴定：初筛
<ol>
	<li>使用定制的 Matlab 图像分析软件处理配对的 21/33 孔板图像，以消除背景并将图像分割为 1,536 阵列。该程序将确定每个位置的检测生物量（总像素强度）（图 5）。 
	注意：该软件（随附于补充信息中，并包含使用说明）将利用网格孔板图像，根据所用的放大倍数和孔板对齐方式，确定 1,536 阵列中各细胞（单个条目）的位置，并计算每个细胞的总像素强度。随后将每个突变株的这些数值与可调参数进行比较，以确定相对于 ts+ 标准株在 21 °C 下所需的生长水平以及温度敏感程度，温度敏感程度定义为：S(Mut33)/S(WT33)/S(Mut21)/S(WT21)，其中 S 表示信号（背景扣除后的像素强度），Mut 代表单个突变株，而 &#34;WT&#34; 是随机选择的非温度敏感菌落（具有 ts+ 表型的诱变菌株）。在 21 °C 下的生长定义为 S(Mut21)/S(WT21)。在首轮筛选中，应采用宽松的筛选标准（允许在 21 °C 下相对较低的生长水平和相对较低的温度敏感程度），以降低假阴性率。</li>
	<li>将软件生成的选定菌落列表作为单菌落挑取机器人系统的指令文件加载（通常导入为 384 阵列）。根据机器人系统的指令准备源板和目标板，并挑取菌落进行阵列排布（图 6）。 
	注意：常规挑取设备需要某种格式的指令文件，例如 .csv、.txt 或 .xls。所有挑取设备均具备文件驱动功能；不同格式可能需要对 MATLAB 代码进行少量编辑（源代码已提供）。</li>
	<li>将目标板置于 21 °C 培养箱中培养约 5 天，以制备储备板。</li>
</ol>
3. 鉴定温度敏感型突变体：第二次筛选
<ol>
	<li>重复步骤 2.1 以重新检测挑选的菌落。通常有 30 - 50% 的菌落会再次检测为清晰的温度敏感致死型，相对于最初存活于紫外诱变的菌落，温度敏感致死型的得率为 2% - 5%。</li>
	<li>重复步骤 2.2 以挑选经过两次筛选的温度敏感致死型菌落，但使用经过修改的指令文件，将菌落以 384 密度排列到矩形平板上，每块平板分为 100 个菌落的区块。这是为了便于下一步的显微镜检查。指令文件的格式由 MATLAB 代码在运行时指定。</li>
	<li>务必包含多个野生型（WT）菌落作为对照，并将平板置于 21 °C 培养约 5 天。</li>
</ol>
4. 初始表型测定
<ol>
	<li>复制步骤 3.2 中排列的 100 块平板，并将其置于 21 °C 培养箱中培养约 2 天，以获得新鲜生长的菌落。</li>
	<li>将新鲜的 100 块平板（4.1）复制成三份。将其中一份置于 21 °C 培养箱中，另一份置于 33 °C 培养箱中作为对照。</li>
	<li>将第三份（&#34;筛选平板&#34;）放入机器人系统中，使用蘸过无菌水的长针将菌落点样。 
	注意：衣藻细胞通过机器人长针点样至琼脂表面时，通常最初会形成较密集的细胞团，可用于显微观察的单细胞较少。为了优化菌落以利于显微观察，可在最初转移的细胞上滴加一滴水（机器人长针转移的水量约为 100 nl）。这将使细胞在初始点样中心周围小范围内（约 1 mm 半径）分散开，产生大量孤立的单细胞。</li>
	<li>在时间 0 点（细胞仍为未分裂的单细胞状态）对筛选平板上每个点样区域拍摄显微照片（图 7），然后将平板置于 33 °C 下培养。通过改装的四分体解剖显微镜的手动载物台控制来确定成像位置，该显微镜已设置为在 384 密度阵列的 4.5 mm 中心间距处自动定位。</li>
	<li>从 33 °C 培养箱中取出筛选平板，并按照步骤 4.4 的方法在不同时间点（10 小时、20 小时、48 小时）拍摄显微照片。确保载物台、平板支架和载物台控制器经过精确校准，以便在每个时间点获取相同细胞的图像。快速完成显微照片采集（约 10 分钟）。</li>
	<li>利用置于 33 °C 培养箱中的第二份平板验证温度敏感（ts）表型，并确保图像采集过程中温度波动对 ts 表型无显著影响。
	<ol>
		<li>分析显微图像，并根据预期标准筛选突变体（图 8）。将最终选定的突变体点样至 96 孔阵列琼脂平板中。确保每块平板中的突变体具有相同的交配型和药物抗性。</li>
		<li>对于每块平板，在最后两列分别加入阳性对照（待测突变）和阴性对照（野生型，WT），用于互补实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 新突变体的互补与连锁检测 &#34;常飞旅客&#34;
<ol>
	<li>将大量阵列化的菌落转移至96孔微孔板中的无氮配子诱导培养基10（每个菌落的密度应约为0.2 O.D.）。在光照条件下（13–20 W 汞灯）孵育约5小时，以诱导配子形成。 
	注意：此步骤可使用机器人复制系统完成，也可通过简单的平板接种装置手动操作。</li>
	<li>将含有不同抗性筛选标记且交配型相反的待测菌株悬浮于装有无氮配子诱导培养基10的离心管中，以进行配子形成。</li>
	<li>在目标板中混合样品，交配反应体系总体积为20 µl（图9）。在光照下孵育约10分钟后，从每孔取5 µl样品点样两次：一次点于TAP平板用于连锁分析，另一次点于含5 µM Paro和9 µM Hygro的TAP平板（TAP + 5 µM Paro + 9 µM Hygro）用于互补实验分析。</li>
	<li>将连锁分析平板置于21 °C培养箱中过夜孵育，随后用铝箔包裹，于黑暗环境中继续培养5天，以促进接合孢子的形成。</li>
	<li>将用于互补实验分析的平板在21 °C光照条件下孵育约10天。 
	注意：所用药物浓度经过校准，可允许双杂合二倍体存活，但足以清除交配所用的单倍体亲本。该浓度是针对本项目中使用的标准抗性筛选标记整合方式而优化的；若采用新的整合方式，需重新校准药物剂量。大多数生物量通过流式细胞术验证为二倍体（图9），尽管通常也能观察到一定比例的单倍体（可能来源于减数分裂及双抗性分离子的生长）。</li>
	<li>将互补实验分析平板复制为两份，用于温度敏感型（ts-）表型鉴定。一份置于21 °C，另一份置于33 °C，培养约5天。</li>
	<li>按照第2.1节所述方法检测菌落的温度敏感型（ts-）表型（图5）。未能与待测菌株实现互补的菌落，可能代表与待测基因属于同一基因的等位基因（即在同一基因上携带不同突变的异等位基因二倍体）。</li>
	<li>对于连锁分析，在完成步骤5.4后，将平板重新置于光照条件下，以促进减数分裂及单倍体分离子的生长，持续约7天。</li>
	<li>将连锁分析平板复制至含有10 µM Paro和10 µM Hygro的TAP平板（TAP + 10 µM Paro和10 µM Hygro），以筛选双抗性后代（预期占单倍体后代的25%，因为两个抗性标记未连锁），并在21 °C培养一周。 
	注意：应提高对双抗性单倍体的药物浓度。</li>
	<li>按照步骤2.1的方法检测菌落的温度敏感型（ts-）表型。 
	注意：对于与待测菌株属于同一互补群的突变体，预期（且实际观察到）会出现温度敏感型（ts-）表型。此外，在连锁分析中，即使某突变体能够与待测菌株互补，若其仍表现出ts-表型，则可能提示该新突变与待测基因紧密连锁。能够与待测菌株实现互补的突变体可能代表新的基因，将进入后续生物信息学分析流程，用于鉴定致病突变位点，并进一步开展表型分析。</li>
</ol>

<ol><li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+avenue+to+cell+cycle+control+in+the+plant+superkingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom.</a> Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).</li>
<li>Cross, F. R., Umen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas cell cycle.</a> Plant J. 82, 370-392 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Indexed%2C+Mapped+Mutant+Library+Enables+Reverse+Genetics+Studies+of+Biological+Processes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 28, 367-387 (2016).</li>
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<li>Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+mechanisms+of+DNA+repair+by+photolyase%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).</li>
<li>Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+and+plant+development.+Annual+Plant+Reviews%2C+Volume+32%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32.</a> Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).</li>
<li>Zachariae, W., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+end+is+destruction%3A+cell+division+and+the+anaphase-promoting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex.</a> Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).</li>
<li>Merchant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+genome+reveals+the+evolution+of+key+animal+and+plant+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions.</a> Science. 318, 245-250 (2007).</li>
<li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).</li>
<li>Mnaimneh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在重大经济利益冲突。

此处描述的用于高效分离温度敏感型致死突变体的流程可确保衣藻基因组中几乎所有细胞必需通路均被涵盖。其中最关键的两个步骤是有效收集潜在细胞周期相关基因，以及消除重复序列 &#34;频繁飞行者&#34; 等位基因的特征包括：1）对不完整细胞周期的阻滞表型特征进行一致的定义；2）针对已鉴定的查询基因进行平行互补实验，以纳入新分离的基因，扩大基因集合。
在光暗周期同步条件下，衣藻（Chlamydomonas）在白天进行光合作用生长，并在无DNA复制或细胞分裂的情况下，细胞体积增加超过10倍&#62;13。大约在进入夜间时，细胞开始进行多轮交替的DNA复制、有丝分裂和细胞分裂（图8）。这种调控机制自然地区分了主要参与细胞生长与完整性的基因，以及专门参与细胞分裂周期的基因。我们发现，10小时和20小时的时间点对于初步的表型分类非常具有信息价值1。根据这些图像（参见Tulin和Cross，2014年的补充信息）1，目前我们所识别的温度敏感致死突变体（ts lethal mutants）主要表型类别包括：Notch（缺口型）、Popcorn（爆米花型）、Round（圆形）、Small（小型）、Medium（中型）、早期裂解（early lysis）和多周期型（multiple-cycle）（图8）。
我们关注的三个最重要类别是 Notch、Popcorn 和 Round。 &#34;Notch&#34; 和 &#34;爆米花&#34; 表型先前已被证明是大多数细胞周期特异性损伤的特征（例如， 有丝分裂周期蛋白依赖性激酶、DNA复制机器以及拓扑异构酶II1一个（缺口型，Notch）或多个（爆米花型，Popcorn）明显但未完成的细胞分裂平面的出现，是细胞周期启动的一个便捷形态学指标。这些突变体通常表现出轻微或无明显的生长缺陷，在10小时时间点的细胞体积增加与野生型（WT）相似。缺口型（Notch）和爆米花型（Popcorn）表型在10小时时即可观察到，并在20小时时完全显现（常伴随细胞裂解）。

关键词：缺口型，Notch，爆米花型，Popcorn，细胞周期启动，细胞分裂平面，细胞体积，野生型，WT，细胞裂解 &#34;圆形&#34; 细胞的生长与野生型相似，但明显分裂面的形成显著减少，从而产生体积较大、呈圆形的停滞细胞。此前该类别中的突变体均涉及后期促进复合物的组分14 或参与微管功能的基因（微管蛋白折叠辅助因子、γ-微管蛋白环复合物）1后期，这些细胞常表现出明显的细胞裂解。
&#34;小&#34;和&#34;中等&#34;细胞的生长程度极低（小）或明显低于野生型（中等）。迄今为止鉴定出的许多此类突变体，其基因注释提示其在基本细胞生长过程（如翻译或膜生物合成）中发挥作用。中等与圆形细胞在显微镜下的主要区别在于10小时时的生长量（圆形：与野生型相似；中等：减少）。由于“小”和“中等”类别数量较多，且可能反映了多种细胞通路中的缺陷，我们并未试图对这些类别进行饱和分析；然而，我们仍希望在分子水平上鉴定出各类别的代表性突变体，以理解不同通路功能缺失所导致的表型。另外两个尚未深入研究的类别为：1）早期裂解突变体，其在10小时时间点即失去完整性（绿色荧光消失、折光性丧失），且几乎无前期细胞生长迹象；2）多周期异常突变体。此类细胞在10小时和20小时的增殖情况与野生型相似，但完全无法进行长期持续的增殖。
我们主要对&#34;凹陷型（notch）&#34;、&#34;爆米花型（popcorn）&#34;和&#34;圆形（round）&#34;表型进行表征，同时排除小至中等大小的圆形细胞，以及仅能完成少数几次细胞分裂的渗漏突变体。这一策略主要是为了确保细胞的基本功能（如生长和膜完整性）正常，从而提高筛选到与细胞分裂相关基因的概率。经验表明，该方法效率较高；然而，某些细胞周期基因可能具有多效性，在真正进入分裂之前G1期的早期阶段已发挥其他功能。这类情况预计较为罕见，但在本策略中仍可能被遗漏。更普遍地，我们希望获得表型均一的细胞周期阻滞，这种阻滞极有可能由单一致病性突变引起，导致蛋白质完全丧失功能。但出于与上述类似的原因，细胞可能在多个节点发生阻滞，因此在候选基因的选择上保留一定的灵活性是可取的。
为了通过新鉴定的基因丰富文库，需对选定的候选基因进行互补性检测。阳性对照（待测突变与自身突变进行比对）必须表现为温度敏感型（ts-），而阴性对照（待测突变与野生型比对）必须表现为非温度敏感型（ts+）。与待测突变属于同一互补群的新突变体表现为ts-。属于同一互补群几乎总是意味着在同一基因中存在分子水平的缺陷（我们测试过的每一个此类基因均符合这一规律）。因此，对于&#34;高频突变基因&#34;，这一标准将其排除在进一步表征之外。那些与已测试查询突变不属于同一互补群的突变体被视为新基因的候选者，将通过生物信息学和实验工具进一步分析。不同互补群中ts-等位基因回收率的高度变异性是一个众所周知的现象——即其变异性显著高于泊松噪声，这是由于不同基因之间产生ts-突变的内在可变性极大所致。可能的原因包括：蛋白质固有的热不稳定性差异、蛋白质大小不同、蛋白质以单体形式存在还是作为大型稳定复合物存在，以及诱变热点的存在。这几乎完全是一种干扰因素。然而，由此带来的一项有利结果是，&#34;高频突变基因&#34;的列表并不长（仅有少数几个基因为主），因此在项目后期之前，耗时费力的互补性测试工作量并不大。
作为互补方法，我们进行了连锁分析。在该实验中，筛选出双重抗性子代，并检测其是否具有ts-表型。对于与查询突变属于同一互补群的突变或紧密连锁的突变，预期（并观察到）会出现ts-表型。对于每个被检测的基因，根据遗传距离的不同，预期会以一定概率出现野生型子代（ts+表型）。我们估计，每个交配位点大约产生100个接合孢子。假设减数分裂效率为100%，则来自非连锁药物抗性盒的双药抗性子代约为100个（占减数分裂子代的25%，每次减数分裂产生4个，遵循孟德尔遗传规律）。对于ts-突变也是如此，如果查询突变与测试突变不连锁，则25%的子代为双突变体，25%为野生型。因此，在双药抗性子代中，约有25%为野生型（约25个细胞）。这是完全不连锁突变的情况；然而，中等程度的连锁（约20 cM以内，约2 Mb，或基因组的2%115）将显著降低甚至消除ts+信号。当被检测突变与抗生素抗性盒连锁时，双药抗性的ts+单倍体仅以极低量存在。这表现为尽管能与所有被测突变互补，但却似乎无法与之发生重组，这是一种异常结果，易于察觉；在此类情况下，通过回交可解决该问题。
根据已有知识和序列分析，我们预计衣藻中的细胞周期基因数量约为500个2，其中大多数基因可能是必需的，但并非全部。随着收集到的突变体数量增加以及饱和度提高，我们将进一步评估是否需要进行额外的诱变轮次。
该实验方案专为研究必需的生物学过程及其执行这些过程的基因和蛋白质而设计。其他用于对必需基因产生扰动的方法也已存在（例如， 随机诱变等位基因的转化16，条件性转录等位基因17或功能减弱等位基因18）。然而，这些方法均依赖同源重组，而在营养期的衣藻中，同源重组受到强烈抑制。成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统已被确立为一种强大的基因编辑工具19；然而，该方法在衣藻中尚未实现高效应用20关键的是，所有这些方法都需要事先了解目标基因。如果希望有可能发现新的知识，这一限制将极为严重！我们的方法能够鉴定出必需基因的突变，且不依赖于任何先验知识。因此，在当前技术水平下，通过分离随机的温度敏感型突变体，再结合深度测序进行基因鉴定，可能是快速深入研究植物超界微生物细胞生物学的最有效方法。
在每个克隆中约有100个编码序列改变的突变，确定致病突变超出了本文的范围。对混合分离群体进行深度测序1是一种有效但劳动密集型的方法。在对少量样本池进行测序后，通过组合样本池策略可确定大量菌株中的所有突变，该方法在成本和人力方面均非常高效。目前正开发一种新的组合混合分离测序策略，该策略将能够在一次测序运行中同时鉴定数十个突变体中的致病突变（正在准备中）。这些效率的提升至关重要，可使关键基因的鉴定步骤能够跟上本文所述方法所带来的突变体快速积累的速度。

对模式生物的系统性突变体库进行表型表征，是解析细胞复杂性的有效方法。Chlamydomonas reinhardtii 是一种单倍体单细胞绿藻，具有类似植物的基因组，但在陆地植物谱系经历多次基因组复制之前便已与其分化2。理论上，由于缺乏基因复制且生命周期主要为单倍体，这极大地方便了功能缺失型遗传学研究。然而，由于基因组同源整合效率极低，难以实现对目标基因的定向破坏。目前正构建一种随机插入突变文库，并结合突变位点的鉴定，迄今已获得包含1,935个定位明确的突变株，覆盖1,562个基因的阵列化集合3。但该方法（通常预期产生无效突变）不适用于必需基因。温度敏感性（ts）突变可在必需基因中被筛选获得，且近年来发展的技术可高效鉴定突变基因及其致病变异位点。通过在高温条件下进行表型分析，可立即获得突变基因功能的相关信息。我们曾报道了在Chlamydomonas中分离和鉴定出约70个必需基因的温度敏感致死突变，尤其聚焦于参与细胞周期进程与调控的基因1,4。
温度敏感型致死筛选数十年来一直是微生物遗传学分析的主要手段5,6。原则上，理想的情况是接近&#34;饱和&#34;，即所有能够突变为温度敏感致死表型的基因均至少被一个突变体识别，从而实现完整的分析。然而在实际操作中，多个因素限制了达到饱和的可能性。首先，尽管几乎所有基因都可在高温下突变为失活状态，但此类突变体的回收效率差异至少可达一个数量级7,8。因此，在接近饱和之前，随机筛选便已开始频繁地重复获得所谓的&#34;高频突变基因&#34;。其次，尽管温度敏感突变通常导致功能降低，但在限制性温度下它们未必完全丧失功能（反之，在允许性温度下也常常不能完全恢复功能）。这一问题在一定程度上可通过比较多个等位基因来解决；如果多个等位基因均表现出相同的表型，则更可能反映了该基因的简单失活结果。多个等位基因对于致病变异位点的最终分子鉴定也非常有帮助1。然而，&#34;高频突变基因&#34;问题意味着，在突变频率较低的基因中获得多个等位基因可能十分困难。
基于这些原因，我们一直在开发一种改进的流程，用于分离和表型鉴定温度敏感型突变体。迄今为止，我们已收集了超过 3,000 株温度敏感型突变体，其中包括约 200 株新的细胞周期相关候选突变体。对该突变体库进行分子和表型分析，有望为植物细胞生物学提供新的见解和假说，因为该集合很可能已涵盖大多数甚至全部细胞必需通路中的突变。重要的是，该流程可应用于任何能在琼脂培养基上生长的微生物，以高效构建温度敏感型突变体库。
关于设备的一点说明：在此实验流程中，两台机器人对提高效率至关重要（菌落挑取仪和组合式复制平板/挑取仪）。挑取设备通常配备金属针。被挑取的菌落会暂时悬挂在这些金属针上（时间从数秒到数分钟不等，具体取决于设备型号）。衣藻在暴露于空气中的金属针上约20秒后即会死亡，这限制了适用于该生物体的设备型号选择。设备的准确性至关重要。我们的菌落挑取仪具有较为合理的准确性，但其操作动作较为剧烈，存在通过飞溅造成交叉污染的可能性。该设备不用于高于384孔密度（中心间距4.5 mm）的操作；在此密度下，其准确性完全可接受。复制平板/挑取机器人（针对不同应用使用不同附件）挑取速度较慢，但足以精确应对1,536孔密度（6,144孔密度即使对该高精度机器人而言也极具挑战性；我们曾评估过该密度，但因其存在多种操作困难而决定不予采用）。若平板装载不平整，机器人将无法正常工作。 等等需要进行抽样检查，以确保各项操作正确无误；当然，如果前几块板的结果正确，机器人便可无人值守运行，且总体上一切将顺利进行。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;设备：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hudson RapidPick 菌落挑选仪</td><td>Hudson Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiDrop Combi 试剂分配器</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>小管金属针头盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Singer RotoR 复制接种机器人</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>该设备对流程至关重要。对于小规模筛选，可使用实验室自制的手动工具</td></tr><tr><td>Singer 单菌落挑选附件（&amp;lsquo;Stinger&amp;rsquo;）</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>可手动操作，但在大规模应用时几乎不可行</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green 核酸染料</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量机器人辅助分离温度敏感致死突变体 莱茵衣藻

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

系统性地鉴定和表征基因扰动已被证明对解析基因功能和细胞通路具有重要意义。然而，传统的永久性基因敲除方法无法应用于必需基因的研究。我们率先建立了一套独特的约70个温度敏感（ts）致死突变体库，用于研究单细胞绿藻Chlamydomonas reinhardtii1中的细胞周期调控。这些突变可识别必需基因，而ts等位基因可通过温度变化实现条件性失活，为鉴定和分析必需基因功能提供了有力工具。如果突变体库接近全覆盖，则其研究价值将显著提升，因为零散的突变体集合可能遗漏关键组分。然而，这需要高效地获得大量突变体，尤其是在大范围靶标筛选中。本文介绍了一种基于机器人技术的流程，用于在衣藻中产生温度敏感致死突变体并分析其表型。该技术可应用于任何能在琼脂培养基上生长的微生物。我们已收集了超过3000个温度敏感突变体，其中很可能涵盖了大多数甚至全部细胞必需通路的突变，包括约200个新的细胞周期相关候选突变。对这些突变体进行后续的分子与细胞学表征，将为植物细胞生物学提供新的见解；而构建全面的突变体库是确保覆盖广泛生物学通路的必要前提。这些方法已与下游的遗传学和生物信息学流程相结合，以高效定位和鉴定致病突变，相关内容超出了本论文的范围。

我们展示了一种快速分离衣藻（Chlamydomonas）温度敏感型（ts）突变体的流程。将细胞分配至琼脂平板上，经显微镜快速验证为单细胞密度后，立即对平板进行紫外线（UV）照射（图 1）。在允许温度下培养10天后，识别并挑取典型的照射后菌落，以阵列形式排列（图 2）。将384格式的平板合并为1,536阵列格式（图 3）。从收集照射后菌落的初始步骤至今，我们已构建了约200,000个菌落的阵列。根据计划的UV剂量调整悬浮液的密度，以确保在考虑细胞死亡率后，每个平板上形成200–600个存活菌落。相应地测试了三种UV照射时间（1.5 min、1 min和0.5 min）及三种细胞密度（表 1）。经验表明，1.5 min的照射时间产生的ts突变体最多（约50%）；然而，1 min的照射时间获得的细胞周期相关候选突变体数量最多。因此，后续的UV诱变实验均仅采用1 min照射。一个重要的注意事项是初始挑取过程中可能发生的液体飞溅及交叉污染（尤其是在高密度阵列格式中），这可能导致同一突变体被重复挑取和后续表型分析。为尽量降低此类情况的发生概率，应注意在菌落处于最佳大小时进行收集，并确保在初始筛选中不挑取相邻的菌落。
接下来，进行了两个连续的温度敏感型表型检测（图5），分离并鉴定了约3,000个温度敏感型突变体，并通过延时显微镜对其进行了表型表征（图8）。由于本研究在细胞周期方面的生物学重点是关注符合特定标准的表型，因此我们不希望在每个靶基因中收集超过两个等位基因。为此，我们将已鉴定的、具有两个以上等位基因的基因（查询基因）与新获得的候选突变体进行互补和连锁检测，以从下游分析流程中剔除高频出现的基因（图9）。
<img alt="单细胞铺板验证的自动化移液系统设置；显微镜观察和紫外照射结果。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 未诱变细胞的均匀铺展及紫外诱变。（a） 使用试剂分配器将384个2 µl液滴点样至琼脂平板上。（b） 随机选取平板在显微镜下检测，以确认单细胞密度，并进行1分钟紫外照射。比例尺 = 50 µm。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微生物研究中的细胞培养实验及菌落分布示意图。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于 384 孔阵列的 UV 诱变菌落筛选。(a) 经 UV 照射的单细胞培养约 10 天后形成可见菌落。比例尺 = 2 cm。(b) 图像分析程序根据特定参数识别可分离的菌落，并通过机器人将其排列至 384 孔板中。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示基因表达研究中实验样本排列的植物微阵列分析示意图。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 合并至 1,536 微阵列。 将四个 384 格式板合并为一个 1,536 板；培养后再次复制，以检测 ts- 表型。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用相机捕获DNA点样的微阵列分析装置；用于检测的微孔板图像。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 用于定量的成像。 (a) 将微孔板固定在文件摄影架下的框架中，以确保同一系列的所有微孔板均以相同的放大倍数和位置进行拍摄。(b) 第一幅图像为一个1536孔微孔板，其角点和中点处标有红色圆点。此“网格板”图像用于定义阵列的位置。(c) 孵育后1,536阵列的示例图像。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比色微阵列检测示意图；蛋白质样品分析；点阵可视化。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 通过半自动图像分析鉴定 ts- 表型。平板图像由定制的 MATLAB 软件（见补充信息 S.I.）进行分析。软件自动将图像分割为细胞阵列（96、384 或 1,536 孔），并量化每个细胞中的信号。21 °C 下的生长情况以蓝色标记，33 °C 下的生长情况以黄色标记。与 33 °C 相比，在 21 °C 下表现出显著更高生长水平（以 ts+ 为标准化对照）的菌落被选中，并以带绿色圆点的黑色方框标出。这些选择可手动编辑。最终选定的菌落信息将导出至文件，供菌落挑取机器人使用。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微孔板上的自动化移液系统。用于生化检测的高通量筛选装置。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 第一轮温度敏感致死候选菌株的机器人挑取。 挑取机器人根据步骤2.1中所述方法生成的文件中的指令，从源平板中挑选候选菌株并点种至新阵列。上图显示了无菌接种针的装载过程。下图显示了从源平板中特定菌落进行精确挑取的过程。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于样品分析的显微镜装置，包括在显示器上进行数字图像采集和观察。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 温度敏感致死表型初筛的时间推移筛选。 通过图5所示两轮筛选方案的克隆被复制到培养板上，细胞密度控制在显微镜下可分辨单个细胞的水平。使用改良的四分体解剖显微镜确定在33 °C孵育0小时、10小时和20小时后拍摄显微照片的位置。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞周期各时相示意图；0、10、20小时时细胞分化的显微图像；实验结果。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8：通过延时显微镜鉴定的衣藻细胞周期突变体。（a） 衣藻独特细胞周期的示意图，描述了以细胞生长为特征的较长G1期，随后进行分裂性的S-M周期，最终孵出新生的子代细胞。（b） 显微图像展示了野生型细胞在细胞周期中的形态，以及未能完成有丝分裂的典型细胞周期突变体的鉴定结果。比例尺 = 50 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="酵母互补实验示意图；核酸染色结果；21°C-33°C 培养实验。" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图9"> 
图9：互补与连锁检测。 (a) 一种抗生素耐药性（例如， 将携带常见重复突变基因的菌株（Hygro抗性）与一组带有第二抗生素抗性盒（抗性标记）的相反交配型突变体在96孔板中进行杂交例如， Paro）。通过核酸染色及流式细胞术分析显示，互补平板产生了高比例的二倍体（a 图左下角面板）。 (b) 交配混合物需在二倍体中检测互补性，并在双抗性减数分裂后代中检测连锁性。阳性对照为具有相反交配型的查询菌株本身，且如预期所示，在 33 °C而阴性对照为野生型（WT），表现为ts+表型。被圈出的菌落与待测基因无互补，因此是该基因新的ts-等位基因。这些菌落通常被排除在进一步表征之外，因为互补测试集仅包含“频繁出现的菌落”（frequent flyers）。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间</td>
			<td>光密度（O.D.）</td>
			<td>挑取的菌落数量（#）</td>
			<td>温度敏感型表型</td>
			<td>细胞周期候选基因突变体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5’</td>
			<td>0.012</td>
			<td>6000 (平均≈200)</td>
			<td>200 (3.3%)</td>
			<td>7 (3.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1’</td>
			<td rowspan="2">0.003</td>
			<td>11,000</td>
			<td rowspan="2">131 (1.19%)</td>
			<td rowspan="2">15 (11.4%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(平均≈360)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.5’</td>
			<td rowspan="2">6E-04</td>
			<td>9000</td>
			<td rowspan="2">40 (0.45%)</td>
			<td rowspan="2">1 (2.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(平均≈300)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：校准辐照时间以最大化细胞周期突变体候选菌株的产量。 测试了三种辐照时间（每组30个平板），并测定相应的光密度（OD），以确保存活菌落数量在200至600之间。

温度敏感型（ts）致死突变体是鉴定和分析必需功能的有力工具。本文介绍了高通量生成和分类温度敏感型致死突变体的方法。

系统性地识别和表征基因扰动已被证明有助于解析基因功能和细胞通路。然而，……

该实验的总体目标是利用机器人技术和标准化检测方法，简化对衣藻中温度敏感致死突变的分离过程，从而确定该生物体内的必需基因和通路。我们关注真核生物中必需细胞功能的保守性与差异性，而研究这一问题的方法就是通过影响这些过程中必需基因的突变。为了实现这一目标，需要一个非常全面的突变体集合，而您将要听到的方法正是我们用于构建此类集合的技术。我们以绿色藻类莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作为植物界的一个代表性模式生物进行研究。该技术的主要优势在于，几乎可以在每一个必需的生物学通路中发现温度敏感致死突变。该方法无需预先了解基因功能或进行靶向诱变。从致死表型可直接推断突变基因的分子功能，从而帮助我们筛选出影响多种唾液酸化通路（超出细胞周期调控范围）的有趣突变。在25摄氏度光照条件下，于100毫升Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）培养基中培养衣藻细胞，使其OD750达到0.2至0.5。根据文本方案，分别在两种遗传背景下独立进行紫外线诱变。取每种培养物样品在显微镜下检查，以确认细胞具有活力且无污染。接下来将培养物稀释至 OD 750 为 0.003，然后用铝箔包裹瓶体，以确保菌体密度均匀，因为该菌株具有趋光性，会朝特定方向游动。根据文本方案调整悬浮液密度后，安装一个适用于液体分配器的小型管盒，并按照制造商说明进行一系列清洗以实现灭菌，防止污染。使用八通道注射器液体分配器管盒，将培养物以每滴 2 µL、共 4 × 96 滴的形式点样于干燥的矩形平板上。轻轻敲击培养皿边缘，使所有液滴融合成一层均匀的液膜，并立即盖上皿盖，避免光照。待液体干燥后，将培养皿置于杀菌紫外灯下照射，照射时间根据经验确定，以使存活菌中温度敏感型突变体（ts突变体）的产量达到最佳。随后，将培养皿转移至黑暗环境中，于室温孵育8至24小时。然后将平板置于21摄氏度、有光照的培养箱中。约10天后，当菌落已生长但尚未融合时，将平板放入相应的堆栈中，作为机器人挑取菌落的源板。随后在矩形平板上挑取菌落制备384阵列，并在21摄氏度、有光照条件下培养约一周时间。使用复制平板机器人，将384孔板阵列浓缩为1536孔板阵列，并将平板置于21摄氏度培养箱中培养约三天。将1536孔板阵列分别复制到两块平板上，一块置于21摄氏度培养箱中，另一块置于33摄氏度培养箱中。在33摄氏度下培养24小时后，将来自33摄氏度培养箱的平板复制到一组预热的新平板上，并将其放回33摄氏度培养箱中。在33摄氏度下培养三天，随后在21摄氏度下培养五天后，使用数码相机拍摄带有九个对齐标记的网格平板。然后交替拍摄21摄氏度和对应的33摄氏度培养的平板，所有平板均置于固定框架中，以保持精确的方向一致。使用定制的Matte Lab图像分析软件对成对的21摄氏度和33摄氏度平板图像进行处理，以消除背景并将图像分割为1536阵列。该程序将根据每个位置的总像素强度确定检测到的生物量。将软件生成的所选菌落列表作为指令文件载入单菌落挑取机器人系统。随后，根据机器人的操作说明准备源平板和目标平板，并让机器人将选定的菌落挑取至阵列中。将目标平板置于21摄氏度培养箱中培养约五天，以制备库存平板。在按照文本方案完成第二次生物量积累测定并复制100块平板后，将该100块平板的新鲜副本再复制三份。在机器人中完成第三块平板的设置并点样菌落后，对筛选平板上每个点样区域在零时点拍摄显微照片，随后将平板置于33摄氏度培养箱中进行培养。在将筛选平板从33摄氏度培养箱中取出后的不同时间点，迅速拍摄显微照片，确保平板固定装置和载物台控制器经过精确校准，以便在每个时间点获得相同细胞的图像。分析显微图像，并根据预定标准筛选突变体。将最终选定的突变体点种至96孔阵列琼脂平板上，确保每块平板中的突变体具有相同的交配型和药物抗性。将大量阵列菌落转移至96孔微孔板中的无氮配子诱导培养基中。将微孔板置于光照条件下孵育约五小时，以诱导配子形成。将含有不同抗性筛选标记且交配型相反的菌株悬液分别加入含有无氮配子诱导培养基的离心管中，用于配子形成。将目标板中的样品与20微升的交配混合液体积混合。在光照条件下约10分钟后，从每个孔中分别取5微升样品点样两次：一次点在TAP平板上用于连锁测试，另一次点在含有5微摩尔帕罗霉素和9微摩尔潮霉素的TAP平板上用于互补测试。在培养互补测试平板后，将平板复制成两份以进行温度敏感（ts）表型鉴定。根据文字方案检测菌落的温度敏感（ts）表型。在对衣藻单细胞进行照射后，细胞在允许温度下生长十天，然后以阵列形式挑取，如此处所示。将获得的384孔板合并为1536阵列。测试了三种紫外照射时间以产生衣藻（Chlamydomonas）温度敏感型（ts）突变体。根据经验，1.5分钟的照射时间获得的温度敏感型突变体最多。然而，迄今为止，一分钟暴露时间获得了最多的细胞周期候选基因。在本实验中，进行了两次连续的温度敏感型（ts）表型检测，分离并表征了约3000个ts突变体，通过延时显微镜进行表型分析。如图所示，为从下游分析流程中剔除高频出现的基因，对新获得的候选基因进行了互补实验和连锁检测，检测对象为已表征且具有两个以上等位基因的基因。这些菌落与查询菌株无互补现象，因此是被查询基因的新型温度敏感等位基因。这类菌落通常被排除在进一步表征之外。一旦掌握，该技术可实现高通量操作。数千个温度敏感型突变体仅需两到三轮诱变即可分离获得。分离得到温度敏感型突变体后，关键的后续步骤是筛选其中一部分进行深入研究，观察其致死表型的多样性尤为引人兴趣。表型分析可为分子功能提供线索，同时也有助于我们优先选择值得进一步研究的突变体。需要注意的是，突变体的基因组中可能含有数百甚至数千个突变。通常只有一个突变是致病原因，但有时需要两个突变共同作用才能产生温度敏感（ts）表型，这种情况可通过四分体分析来确定。通过本实验流程，可利用高通量测序技术对混合突变体进行测序分析，从而鉴定出致病突变。所鉴定出的基因有时会携带提示其功能的突变，也可能是功能未知的新序列，这将十分有趣且具有研究价值。衣藻一直是研究植物界细胞生物学的极佳模式系统。你所听到的这些实验方法将有助于开展对该生物体的研究，以探索一些迄今相对未被深入研究的重要生命过程，我们希望这些研究成果也将适用于更广泛的植物界。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

温度敏感致死突变体的高通量机器人辅助隔离<em&gt;莱茵衣藻</em

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无标记基因缺失通过Chlamydia trachomatis中带loxP盒的等位交换诱变实现

本方案采用荧光启动子报告系统、活细胞显微镜观察以及单个包涵体提取技术，通过定向正向遗传学方法，鉴定并分离沙眼衣原体（Chlamydia...

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的 体外 运动细胞的重新激活是理解细胞运动机制的关键实验。该方案描述了去膜细胞模型的重新激活方法。...

Chlamydomonas reinhardtii 去膜细胞模型的再激活

大多数能游动的光合自养生物都会表现出光诱导的行为变化（光行为）。本实验方案旨在观察模式生物Chlamydomonas...

Chlamydomonas reinhardtii中光行为的观察

本文介绍了一种利用低成本、节能型台式恒温混匀仪作为培养设备，针对嗜热微生物进行实验进化的适应性演化实验方案。该技术通过表征一种最适生长温度为75 °C的古菌——Sulfolobus...

生命极端环境下的适应：利用嗜极古菌Sulfolobus acidocaldarius进行的实验进化

本方案展示了热休克蛋白70（Hsp70）的分子伴侣活性。E. coli dnaK756...

基于Escherichia coli的互补实验用于研究热休克蛋白70的分子伴侣功能

了解莱茵衣藻温度敏感致死突变体的高通量机器人辅助分离方法。该技术利用紫外线诱变和自动化筛选系统，无需预先了解靶基因即可鉴定真核生物必需基因与关键通路。

高通量机器人辅助分离温度敏感致死突变体莱茵衣藻

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高通量机器人辅助分离温度敏感致死突变体 莱茵衣藻

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