温度敏感致死突变体的高通量机器人辅助隔离莱茵衣藻
2016年12月5日
温度敏感 （ts） 致死突变体是识别和分析基本功能的宝贵工具。在这里，我们描述了以高通量生成和分类 ts 致死突变体的方法。
该程序的总体目标是使用机器人技术和标准化检测来简化衣藻中温度敏感致死突变的分离，以确定该生物体中的基本基因和途径。我们对真核生物中基本细胞功能的守恒和发散都感兴趣。我们喜欢研究的方式是破坏这些过程中重要基因的突变。
为了使其正常工作，您需要一个真正全面的突变体集合，您将听到的方法就是我们生成此类集合的方法。我们正在研究绿藻 Chlamydomonas reinhardtii 作为植物界的代表。这种技术的主要优点是温度敏感的致死突变可能存在于每个基本途径中。
该方法不需要先验知识或靶向诱变。突变基因的分子功能立即从致死表型表明。这有助于我们选择有趣的突变，这些突变会破坏细胞周期控制之外的各种 siala 途径。
为了进行紫外线诱变培养，衣藻细胞在 25 摄氏度的光照下以 100 RPM 的转速摇动，在 100 毫升 Tris-乙酸-磷酸盐 （TAP） 中高达 OD 750 的 0.2 至 0.5。根据文本方案，在两个遗传背景中独立进行 UV 诱变。在显微镜下检查每种培养物的样品，以确保细胞是活的且没有污染。
接下来，将培养物稀释至 OD 750 为 0.003，然后用铝箔包裹瓶子以确保均匀密度，因为应变是模态的，并且响应光而定向游动。根据文本协议调整悬浮液的密度后，连接一个适合液体分配器的小管盒，并根据制造商的说明进行一系列消毒清洗，以防止污染。使用 8 针液体分配器盒，将 4 x 96 滴 2 微升的培养物分配到干燥的矩形板上。
轻轻敲击板的边缘，以确保所有液滴合并成薄薄的液体，并立即盖住板以防止暴露在光线下。干燥后，将板放在杀菌紫外线灯下一段时间，根据经验确定，以在幸存者中给出 ts 突变体的最佳产量。接下来，将板在室温下避光 8 至 24 小时。
然后将板放入 21 摄氏度的带照明培养箱中。在菌落生长但未合并大约 10 天后，将板加载到相关堆栈中作为机器人菌落挑选的来源。然后在矩形板上挑选 384 个阵列的菌落，并在 21 摄氏度下在照明下生长约一周。
使用复制电镀机器人，将 384 个阵列浓缩成 1536 阵列，并让板在 21 摄氏度培养箱中生长约三天。将 1536 阵列复制到两个板中，并将一个板放入 21 摄氏度的培养箱中，另一个放入 33 摄氏度的培养箱中。在 33 摄氏度下放置 24 小时后，将板从 33 摄氏度培养箱复制到一组新的预热板中，并将它们放入 33 摄氏度培养箱中。
在 33 摄氏度下生长 3 天，在 21 摄氏度下生长 5 天后，使用数码相机拍摄标有 9 个对齐指示器的网格板。然后拍摄印版，交替使用 21 摄氏度的印版，然后是相应的 33 摄氏度印版，所有印版都放置在固定框架中以保持准确的方向。使用定制的 Matte Lab 图像分析软件处理成对的 21、33 板图像，以消除背景并将图像分割成 1536 阵列。
该程序将确定检测到的生物量作为每个位置的总像素强度。将软件生成的选定菌落列表加载为单菌落挑选机器人的指令文件。然后根据机器人指令准备源板和目标板，并允许机器人将选定的菌落挑选到阵列中。
将目标板置于 21 摄氏度的培养箱中约 5 天，以培养储备板。在进行第二次生物量积累测定并根据文本方案复制 100 个块板后，将 100 个块板的新鲜副本复制到三个副本。在机器人中设置第三个板并点样菌落后，在零时拍摄筛选板每个点区域的显微照片，并将板置于 33 摄氏度进行孵育。
从 33 摄氏度培养箱中取出筛选板后，在不同时间点快速拍摄显微照片，确保板架和载物台控制器经过精确校准，以便在每个时间点获得相同细胞的图像。分析显微图像并根据所需标准选择突变体。在 96 个排列的琼脂板中发现最终选择的一组，确保每个板都包含相同交配类型和耐药性的突变体。
将大量排列的菌落转移到 96 孔微孔板上的无氮配子诱导培养基中。将板在光照下孵育约 5 小时，以允许配子发生。将含有替代抗性盒的相反交配类型的查询暂停到带有无氮配子诱导培养基的试管中以进行配子发生。
将来自目标板的样品混合在 20 μL 的配对混合物中。在光线下放置约 10 分钟后，从每个孔中点样 5 微升两次。一次在 TAP 板上进行连锁测试，一次在 TAP 加 5 微摩尔 paro 加 9 微摩尔 hygro 上进行互补测试。
孵育互补测试板后，将板复制成两个副本以进行 ts 表型鉴定。根据文本方案测试 ts 表型的菌落。在照射衣藻的单个细胞后，让细胞在允许的温度下生长 10 天，然后以阵列形式采摘，如图所示。
384 格式的结果板将合并为 1536 数组。测试了 3 次紫外线暴露时间以生成衣藻 ts 突变体。根据经验，1.5 分钟的曝光时间产生了最多的 ts 突变体。
然而，到目前为止，一分钟的曝光时间产生了大多数候选细胞周期。在本实验中，进行了两次连续的 ts 表型测定，分离了大约 3000 个 ts 突变体，并通过延时显微镜进行了表型表征。如图所示，为了从下游管道中去除高度复发的基因，对新收集的候选基因进行了具有两个以上等位基因的已表征基因的互补和连锁测试。
这些菌落与查询没有互补，因此是查询基因的新 ts 等位基因。这些通常被排除在进一步的表征之外。一旦掌握了这项技术，就可以在高吞吐量中完成。
数以千计的 ts 突变体只需两轮或三轮诱变即可分离。分离 ts 突变体后的一个关键步骤是选择一个子集进行进一步研究，查看致死表型的范围非常有趣。表型分析为分子功能提供了提示，也有助于我们优先考虑突变体以进行进一步研究。
请记住，突变体的基因组中可能有数百或数千个突变。通常只有一个是致病因素，但有时 ts 表型需要两个突变，这可以通过 tetra 分析来确定。按照这个程序，可以通过混合的下一代测序分析来识别致病突变 已识别的基因有时会具有表明功能的突变，或者它们可能是新的、未知的序列，这很有趣和令人兴奋。
衣藻一直是研究植物界细胞生物学的绝佳模型系统。您听说的程序应该为相对未被检查的基本过程打开对这种生物体的研究，我们希望结果也与更广泛的植物界相关。
概述
本研究提出了一种高通量方法，用于产生和分类在团藻中的温度敏感致死突变体。该方法旨在识别重要基因和通路，有助于我们理解真核生物的细胞功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 细胞生物学
背景
- 温度敏感致死突变体对于研究重要功能至关重要。
- 团藻作为植物生物学的模式生物。
- 该方法允许识别各种重要通路中的突变。
- 机器人技术提高了突变体分离的效率。
研究目的
- 简化温度敏感致死突变的分离。
- 确定团藻中的重要基因和通路。
- 探索真核生物细胞功能的保守性和差异性。
使用的方法
- 团藻培养物的紫外线诱变。
- 机器人菌落挑选用于高通量分析。
- 用于突变体菌落中生物质检测的图像分析。
- 用于评估基因功能的互补测试。
主要结果
- 生成了一个全面的温度敏感突变体集合。
- 识别了影响多样细胞通路的突变。
- 该方法在没有针对性诱变知识的情况下也被证明是有效的。
- 机器人技术促进了大型突变体阵列的高效处理。
结论
- 该方法为研究团藻中的重要基因提供了一个稳健的框架。
- 它增强了我们对真核生物细胞功能的理解。
- 该方法可以适用于其他生物体，以探索重要通路。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput robotic isolation of temperature-sensitive lethal mutants in Chlamydomonas reinhardtii enables systematic functional interrogation of essential genes and pathways. This approach addresses the challenge of studying essential gene function without permanent gene deletion, supporting predictive confidence in target validation and pathway mapping. Comprehensive mutant collections generated by this workflow underpin robust early discovery and portfolio triage in plant and eukaryotic model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables conditional inactivation of essential genes for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing pathway dependencies through lethal phenotypes.
- Facilitates broad pathway coverage, reducing the risk of missing critical biological components.
- Provides immediate phenotypic readouts to prioritize mutants for downstream study.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, arrayed mutant collections for reproducible screening workflows.
- Enables quantitative biomass and viability measurements via automated image analysis.
- Supports scalable, high-throughput screening with robotic colony picking and replication.
- Prepares validated biological systems for downstream genetic and bioinformatics analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant pathway interrogation in plant and eukaryotic models.
- Provides continuity from genetic perturbation to phenotypic characterization and molecular mapping.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate targets based on essentiality and pathway context.
Pipeline & Workflow Integration
This robotics-based mutant isolation pipeline integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and unbiased pathway exploration.
- Discovery Biology: Systematically tests gene essentiality and pathway function via conditional inactivation.
- Screening: Standardizes mutant selection and quantitative phenotype assessment for reliable comparison.
- Analytics: Provides digital biomass and viability metrics to inform selection and prioritization.
- Translational Research: Connects genetic perturbation to pathway mapping and functional annotation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for mutant generation across diverse model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and pathway mapping.
- Operational Value: Delivers high-throughput, standardized, and reproducible mutant isolation.
- Strategic Value: Enables comprehensive pathway coverage and informed go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial genetics, robotics, and quantitative image analysis.
- Demands access to automated colony pickers, replica plating robots, and digital imaging systems.
- Relies on standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other agar-growing microorganisms with appropriate protocol adjustments.
- Dependent on downstream genetic and bioinformatics infrastructure for causative mutation mapping.
