Name: 单细胞基因表达利用多重RT-qPCR的表征罕见的淋巴人群的异质性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习使用多重单细胞RT-qPCR技术同时分析48种基因表达，揭示免疫细胞群体中的分子特征异质性。该方法可识别罕见细胞亚群，为免疫学研究提供高灵敏度工具。

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本工作由巴斯德研究所、法国国家健康与医学研究院（INSERM）、巴黎狄德罗大学以及法国研究部（资助 S.C.）；法国癌症研究协会（资助 S.C. 和 R.G.）；REVIVE 未来投资计划及法国国家科研署（ANR；项目“Twothyme”资助 A.C.）；法国国家科研署（ANR）“Myeloten”项目（资助 R.G.）；以及法国国家癌症研究院（“肝癌发生过程中免疫微环境的作用”项目，资助 R.G.）提供支持。我们感谢巴斯德研究所人类免疫学与细胞计量平台提供的支持。

所有动物实验均经法国巴斯德研究所安全委员会批准，符合法国农业部和欧盟的指导方针。
1. 准备96孔单细胞分选板
<ol>
	<li>在1.5 ml离心管中配制预扩增混合液，每孔加入5.0 µl特异性逆转录缓冲液、1.3 µl低乙二胺四乙酸（EDTA）TE缓冲液（10 mM TE溶液，pH 8，含0.1 mM EDTA溶液；0.2 µM滤膜过滤）以及0.2 µl Taq DNA聚合酶（图1a）。</li>
	<li>在96孔板中，每孔加入6.5 µl预扩增混合液（最多48孔）。该板即为96孔单细胞分选板。 
	注意：建议本方案使用电子移液器。它可实现精确且可重复的体积测量，并节省时间。</li>
</ol>
<img alt="96孔板中预扩增混合液、检测混合液和稀释分析的PCR设置示意图。" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：96孔板加样流程。 96孔板的加样操作必须格外小心，因其将影响后续整个实验结果。（a）在96孔单细胞分选板上，先加入预扩增混合液，随后加入0.2x检测混合液。（b）应使用电子表格记录每个单细胞的位置。未加入细胞的孔称为“无模板”孔，可作为对照。可预留两行用于通过cDNA稀释控制引物扩增效率（从相当于105个细胞到1个细胞的连续十倍稀释）。（c）在96孔检测板上，先加入检测加样试剂，再加入引物。务必记录每种引物所在位置的布局。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>在1.5 ml离心管中，加入每种引物（20x引物；最多48种不同探针；参见表1）各1.4 µl，配制0.2x的检测混合液。用低EDTA TE缓冲液将终体积调整至140 µl。</li>
	<li>将2.5 µl的0.2x检测混合液分配至含有预扩增混合液的96孔单细胞分选板的48个孔中。 
	注意：96孔样品板中每个孔的终体积应为9 µl。</li>
	<li>用封板膜密封板子，涡旋混匀后在280 × g下离心45秒。将96孔单细胞分选板储存于-20 °C，或立即使用。</li>
</ol>
2. 单细胞解离
<ol>
	<li>使用 CO2 递送系统，通过缺氧法对小鼠实施安乐死。将小鼠固定在解剖板上，用剪刀沿纵轴切开腹腔。</li>
	<li>从肝脏中回收固有淋巴细胞（ILC）。
	<ol>
		<li>在分离肝脏前，冲洗肝脏循环细胞。
		<ol>
			<li>为暴露门静脉，将小肠和大肠移至小鼠左侧；门静脉表现为腹腔中最大的静脉。</li>
			<li>使用 10 ml 注射器和 0.45 mm 针头，经门静脉用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗肝脏。为便于冲洗，可用剪刀剪断胃动脉。</li>
			<li>为切除胆囊，用镊子夹住胆囊基部，并用剪刀将其从肝脏分离。</li>
			<li>为分离肝脏，用镊子夹住肝脏基部，用剪刀将肝脏从腹腔其余部分分离。</li>
			<li>将肝脏转移至 Potter 研磨管中，加入 5 ml 含 2% 胎牛血清（FCS）的 Roswell Park Memorial Institute 培养基（RPMI）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用研杵通过机械法解离肝脏。将悬液转移至 15 ml 离心管中，用 RPMI 2% FCS 补充至总体积 14 ml。将细胞悬液置于冰上静置 15–20 分钟，使肝细胞沉淀。</li>
	<li>使用 1 ml 移液器将上清液（不含肝细胞）转移至新的 15 ml 离心管中（预期可获得约 12 ml 上清液）。在 10 °C 下以 120 × g 离心 7 分钟。离心后弃去上清液。</li>
	<li>将第 2.4 步获得的沉淀重悬于 14 ml 密度梯度介质（例如，40% Percoll）中。在 20 °C 下以 600 × g 离心 20 分钟。用吸管吸除上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 ml 醋酸钾（ACK）溶液中。室温孵育 1 分钟。1 分钟后，用含 2% FCS 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）补足至 14 ml。在 10 °C 下以 120 × g 离心 7 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>对细胞进行染色。
	<ol>
		<li>将沉淀重悬于 300 µl 生物素标记抗体混合液中（见材料表；加入所列全部生物素化抗体），并将细胞转移至 1.5 ml 离心管中。4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
		<li>用 HBSS 2% FCS 补足至 1 ml，120 × g 离心 7 分钟（10 °C）。将沉淀重悬于 300 µl 荧光染料偶联抗体混合液及荧光染料标记链霉亲和素中（见材料表；加入所列全部荧光染料偶联抗体）。4 °C 避光孵育 20 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 HBSS 2% FCS 补足至 1 ml，120 × g 离心 7 分钟（10 °C）。用 1 ml 移液器移除上清液。将沉淀重悬于 1 ml HBSS 和碘化丙啶（Pi；1:4,000）中。 
	注：使用广泛表达的 ILC 细胞表面标志物时，可定义三个细胞群：NKp46+ IL-7Rα-、NKp46+ IL-7Rα+ 和 NKp46- IL-7Rα+。所有细胞群均按谱系- CD3- CD4- CD45.2+ 进行分选。</li>
</ol>
3. 单细胞荧光激活细胞分选（FACS）
<ol>
	<li>使用流式细胞分选（FACS）进行单细胞分选13。 
	注意：不同类型的细胞可分选至同一张96孔单细胞分选板上（图2）。
	<ol>
		<li>使用FACS将单个细胞分选至含有0.2x检测混合液和预扩增混合液的96孔单细胞分选板的每个孔中。使用新配制的96孔单细胞分选板，或若储存于-20 °C则解冻后使用。
		<ol>
			<li>将密封的96孔板放置于FACS板架上。可先使用空的96孔板进行测试。将板子放置成A1孔位于左侧并朝向操作者。</li>
			<li>使用验证微珠调整板架位置，确保液滴落入A1孔的中心。</li>
			<li>对A行所有孔重复步骤3.1.1.2。</li>
			<li>移除96孔板的密封膜，每孔分选100个验证微珠，检查各孔中心是否形成液滴。</li>
			<li>调整完成后，将96孔单细胞分选板置于板架上。绘制板图并每孔分选一个细胞。 
			注意：确保每个细胞在96孔单细胞分选板上的位置准确至关重要。应使用电子表格软件记录板图。该板图将在后续多个步骤中使用（图1b）14。在96孔样本板中保留一个仅含0.2x检测混合液和预扩增混合液但无细胞的孔，作为无模板对照。预留两行共6个孔用于cDNA梯度稀释，这些孔将作为引物扩增效率的对照（图1b）。</li>
			<li>将96孔单细胞分选板储存于-20 °C或立即使用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 预扩增
<ol>
	<li>使用步骤 3.1.1.6 中获得的新鲜或已解冻的 96 孔单细胞分选板。振荡混匀后离心（280 × g，45 秒）。</li>
	<li>将 96 孔单细胞分选板置于热循环仪上。按照 图 3 和 表 2 中所述程序进行逆转录和预扩增。</li>
</ol>
<img alt="PCR热循环示意图，40-95°C，预扩增，显示温度步骤和循环持续时间。" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：预扩增程序。 为了获得足够的材料，需要对分选后的单细胞中特定目标基因进行预扩增。将96孔单细胞分选板放入热循环仪中，按照预扩增程序进行反应。预扩增产物随后用低EDTA TE缓冲液稀释，可立即使用或在-20 °C冷冻保存。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>向每个孔中加入 36 µl 低 EDTA TE 缓冲液，稀释预扩增样品。</li>
	<li>用封板膜密封板孔，涡旋混匀后离心（280 g，45 秒）。将预扩增后的 96 孔单细胞分选板储存于 -20 °C，或立即使用。</li>
</ol>
5. 准备96孔样品板
<ol>
	<li>通过加入 175 µl qPCR 预混液和 17.5 µl 样品加载试剂，配制 191 µl 的预混液。</li>
	<li>在新的 96 孔板中，每孔加入 3.6 µl 预混液（最多 48 孔）。此为 96 孔样品板。</li>
	<li>将 96 孔样品板中 2.9 µl 的预扩增 cDNA 转移至新的 96 孔板中。各样品在 96 单细胞分选板与 96 孔样品板之间的位置应保持一致。</li>
	<li>用封板膜密封新 96 孔板，涡旋混匀后离心（280 × g，45 秒）。将新 96 孔板置于冰上并避光保存。96 孔样品板可立即使用或于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
6. 准备96孔检测板
<ol>
	<li>在新的96孔板中，向每个孔加入3 µl检测上样试剂（最多48个孔）。该板称为96孔检测板。</li>
	<li>向每个孔中加入3 µl引物。请在电子表格软件中保留孔板布局记录（图1c和表1；使用表1中列出的所有引物）。每个引物在96孔检测板上的正确位置对后续多个步骤至关重要。
	<ol>
		<li>若样本数量少于48个，则在未使用的孔中加入水代替引物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用封板膜密封板孔，涡旋混匀后离心（280 × g，45秒）。将96孔检测板储存于-20 °C，或立即使用。 
	注意：为避免引物反复冻融，建议同时分配用于预扩增体系和96孔检测板的引物。</li>
</ol>
7. 单细胞基因表达芯片
<ol>
	<li>将集成微流控芯片（IFC）放置在实验台上，使用带帽的注射器检查阀门。打开注射器，将其垂直置于阀门上，并用力按压。O型圈应发生移动。用控制液（0.3 ml 结核菌素）填充芯片。</li>
	<li>对第二个阀门重复步骤 7.1。 
	注意：液体不得溢出芯片表面。</li>
	<li>移除芯片底部的蓝色薄膜。将芯片装入 IFC 控制器中。在 IFC 控制器屏幕上选择“PRIME”，然后选择“RUN”。微流控通道的控制持续 10 分钟。</li>
	<li>弹出芯片，并重新将蓝色薄膜密封在芯片底部。</li>
</ol>
<img alt="微流控电路图；检测板和样品板，集成芯片，流程可视化。" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：单细胞多重基因表达芯片上样。 这些步骤需要极高的精确度，尤其是在将96孔板转移至单细胞多重基因表达芯片的过程中。为避免上样错误和错位，强烈建议按顺序操作。每次转移的体积应在移液过程中严格控制。最后，应避免产生任何气泡，一旦形成须及时清除。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54858/54858figfourlarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>使用八通道移液器，从芯片 A1 侧（左侧）的 96 孔检测板中转移 5 µl 液体。按照 图 4 所示，填充芯片的左侧。注意每次吸入枪头的液体体积应保持一致。
	<ol>
		<li>避免产生气泡。若出现气泡，使用 10 µl 枪头将其移除。每次更换芯片的不同孔时，均需更换枪头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 96 孔样本板中的 5 µl 液体，对芯片右侧重复步骤 7.5。</li>
	<li>移除芯片底部的蓝色薄膜。将芯片装入 IFC 控制器中。在 IFC 控制器屏幕上选择“RUN SCRIPT”，然后选择“RUN”。微流控通道的加载过程持续 45 分钟。</li>
	<li>弹出芯片，并重新将蓝色薄膜密封于芯片底部。</li>
</ol>
8. 运行芯片
<ol>
	<li>在微流控qPCR计算机上，选择“数据采集”软件。启动后，选择“新建运行”。</li>
	<li>选择“弹出”，取下芯片底部的蓝色薄膜，然后装入芯片。放置芯片时，确保A1孔位于左侧并朝向操作者。</li>
	<li>在“项目设置”中选择“无”，然后选择“下一步”。</li>
	<li>选择“新建芯片运行”、“新建芯片目录”（为实验创建一个文件夹），然后选择“下一步”。</li>
	<li>在“基因表达”中选择“被动参比染料 = ROX”（羧基-X-罗丹明）和“单探针”；根据所用引物选择正确的滤光片。选择“下一步”。</li>
	<li>选择“浏览”，并根据所用引物选择正确的程序。 
	注意：“Default-10min-Hotstart.pcl”是单细胞多重RT-qPCR最常用的程序。</li>
	<li>选择“开始运行”。反应过程约需90分钟。</li>
	<li>运行完成后，选择“弹出-完成”。</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>打开“实时荧光定量PCR分析”软件，选择“文件”和“打开”，找到实验文件夹，然后选择“ChipRun.bml文件”。</li>
	<li>单击“分析视图”、“结果表格”和“热图视图”；标有“X”的方框低于阈值检测水平和/或扩增曲线异常。</li>
	<li>命名样本。进入“Sample Setup”并选择“New SBS 96”。点击“Mapping”并选择“…”。从电子表格软件中复制并粘贴样本布局设计。将粘贴的布局定义为“Sample Name”。</li>
	<li>命名检测方法。在“Detector Setup”中使用引物名称重复步骤9.3。将粘贴的布局定义为“Detector Name”。</li>
	<li>单击“分析视图”和“分析”；样本名称和引物名称将自动分配给相应的样本和引物图7).</li>
	<li>计算每个样本的 Ct 值、ΔCt 值和倍数变化。使用看家基因作为内参对照（此处为 Gapdh): 
	ΔCt = Ct样本 - Ct内参对照 
	倍数变化 = 2-(ΔCt样本 - ΔCt阴性对照)
	<ol>
		<li>单击“检测器设置”，选择无输入对照的孔（使用看家基因作为内参对照以标准化基因表达）。选择“编辑器”、“定义参考”和“更新”。</li>
		<li>选择将应用上述定义的内参的所有孔。点击“Editor”并选择“define as Test”。选择一个合适的参考基因，然后点击“Update”。</li>
		<li>选择“样品设置”以选定阴性对照孔。选择“编辑器”并定义“参考”。点击“更新”。</li>
		<li>选择“分析视图”和“分析”；Delta Ct 和倍数变化将自动计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导出数据。选择“文件”和“导出”，另存为“表格结果”，选择目标文件夹，然后点击“保存”和“退出”。</li>
	<li>重复步骤9.7，但将文件保存为“热图结果”，而非“表格结果”。</li>
</ol>

<ol><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了如何在克隆水平上获得全面的基因表达信息。在此，我们研究了肝脏固有淋巴细胞（ILC）区室的异质性。在基于广泛表达的ILC表面标志物对不同的ILC群体进行单细胞分选后，对样本中预先选定的特定基因进行预扩增。随后，将获得的cDNA和引物加载至多重RT-qPCR微流控芯片上。最终，我们从48个单细胞中获得了48个不同基因的表达数据。通过在线软件分析基因表达结果，以研究基因表达特征及细胞群体之间的关系。
该技术的主要优势在于能够同时评估多个基因的表达。它还支持在克隆水平以及极稀有细胞群体上开展研究。与传统的逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）方法不同，单细胞多重RT-qPCR不存在平均化效应，因为基因表达是在克隆水平上进行评估的。因此，可以检测并分析细胞群体内的异质性。单细胞RT-qPCR技术适用于极稀有细胞群体的研究，因为仅需极少量细胞即可获得全面的基因表达信息。此外，可在同一块反应板上对不同细胞群体进行检测，从而能够识别不同群体间的基因表达特征差异，并结合在线数据分析工具评估细胞群体之间的关系。该技术还具有其他优势。单细胞多重RT-qPCR得益于近年来微流控技术的进步，...

近年来，天然淋巴细胞（ILCs）受到越来越多的关注。尽管它们缺乏抗原特异性受体，但仍属于淋巴细胞谱系，是维持组织稳态和炎症反应的重要哨兵。目前，ILCs 根据其特定转录因子组合的表达及其产生细胞因子的能力，被分为三类6,7。
ILC 通过特异性细胞因子的产生，在多种器官的稳态维持及病理生理过程中发挥重要作用8,9。为了深入理解这些细胞的功能，明确各器官中不同的 ILC 亚群及其发育关系至关重要。此外，不同 ILC 亚群之间还存在可塑性现象。通过研究某一器官内细胞的异质性，可以界定其成熟阶段，并区分其特定功能。
为了展示单细胞多重RT-qPCR技术的应用，本研究选择了肝脏固有淋巴细胞（ILC），并特别关注同一ILC亚群（1型ILC）内部的异质性10。首先，通过流式细胞术对肝脏中的三种不同ILC群体进行了表征。其中，1型ILC约占固有免疫效应细胞的80%，而另外两个群体则为稀有的肝脏ILC群体（占固有免疫效应细胞的比例不足5%）。这些细胞群体利用ILC广泛表达的细胞表面标志物进行分选。因此，分选出的肝脏ILC群体在形态上彼此之间总体相似。
单细胞多重RT-qPCR已成为快速研究这些群体异质性的最佳技术之一11。利用单细胞多重RT-qPCR技术可确定两个主要特征：首先，在克隆水平上，可以获取细胞特异性的基因表达信息，用于比较那些表观上处于相似发育阶段的细胞之间的差异；其次，通过分析预先选定的基因表达组合，我们将基于同一时间点的同步基因表达模式，确定新的基因特征。这些优势使得即使在稀有细胞群体中，也能在克隆水平上对大量细胞进行多种基因表达数据的采集。因此，可充分评估肝脏中ILC的异质性。
接下来，通过分选所有具有全局ILC表型的细胞，可以获得肝脏ILC群体多基因表达的广泛概览，尽管这些群体极为稀少。基于微流控的芯片技术使得即使使用极少量的细胞材料也能开展实验。因此，能够获取稀有细胞群体的基因表达谱。利用在线基因特征分析软件，可对细胞群体聚类及潜在的细胞间关系进行探究。进而，可开展功能实验以验证聚类数据 体内 水平。
在同一张芯片上，可同时对数百个或更多的单细胞检测数十个基因的表达水平3,11,12。实验中最耗时且最关键的步骤是检测方案的设计。确定与待验证假设相关的基因是获得有意义结果的首要前提。其次，需要设置内参对照（例如用于分选的已知表面标志物）以及特异性对照，这对于验证引物扩增的特异性、扩增效率以及排除引物间竞争至关重要。因此，单细胞多重反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）是一种节省时间的技术，可同时检测单个细胞中多个基因的表达情况。
对所有细胞使用相同的芯片和试剂混合物，可限制操作过程中可能产生的误差，并确保样品间的可重复性。综上所述，单细胞多重反转录定量PCR的各个特点使其能够在克隆水平上获得高度可靠的结果，对多种样品和基因均具有很高的灵敏度。所得结果可为生物统计学分析提供强大而稳健的数据支持。
这得益于该方法的微流控特性，使其能够在极少量材料上进行操作，并获得详尽的结果。最后，通过使用在线软件，可以对目标群体进行比较。

<table><tbody><tr><td>Cells Direct One Step qRT-PCR 试剂盒</td><td>Applied Biosystems&amp;nbsp;</td><td>11753100</td><td>引物探针检测试剂盒。包含 2× 反应混合液、SSIII 铂金酶。</td></tr><tr><td>低 TE EDTA 缓冲液</td><td>Affymetrix</td><td>75793 100ML</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AB 1100</td><td>适用于细胞分选和热循环的 96 孔板</td></tr><tr><td>封口膜</td><td>Dominique Dutscher</td><td>106570</td><td>铝制封口膜；防止污染和蒸发</td></tr><tr><td>Actb</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00607939_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Aes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01148854_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Ahr</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00478932_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Bcl2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00477631_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>c-myc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00487804_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Cbfb</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01251026_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Cd27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01185212_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Cd49a</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01306375_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>CD49b</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00434371_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Cxcr5</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00432086_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Cxcr6</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm02620517_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Eomes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01351985_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Ets1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01175819_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Foxo1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00490672_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Gapdh</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm03302249_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Gata3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00484683_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Gm-csf</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01136644_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Hes1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01342805_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00446968_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Id2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01293217_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Il-12rb2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00711781_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Il-18r1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00515178_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Il-1rl1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00434237_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Il-22</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm001226722_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Il-23r</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00519943_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Il-2ra</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01340213_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Il-2rb</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01195267_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>IL-7r</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00434295_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Klr5</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm04207528_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Lef1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00550265_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Ncr1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01337324_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Nfil3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01339838_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Notch1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00435249_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Notch2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00803069_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Rora</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01173766_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Rorc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00490666_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Runx3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00490666_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Tbx21</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01299453_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Tcf3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01175588_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Tcf7</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00493445_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Tle1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00495643_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Tle3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00437097_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Tsc22d3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01306210_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Tnfrsf11a</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00437132_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Tox</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00455231_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Zbtb16</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01176868_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>Zbtb7b</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00784709_s1</td><td>20× 引物</td></tr><tr><td>qPCR 主混合液&amp;nbsp;</td><td>Applied BioSystems</td><td>P/N 4304437</td><td></td></tr><tr><td>2× 检测加载试剂</td><td>Fluidigm</td><td>P/N 85000736</td><td>用于在多重 RT-qPCR 微流控芯片中加载检测的特异性密度介质。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2× 样品加载试剂</td><td>Fluidigm</td><td>P/N 85000735</td><td>用于在多重 RT-qPCR 微流控芯片中加载样品的特异性密度介质。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>48.48 多重 RT qPCR 微流控芯片</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-48.48</td><td>48.48 动态阵列 IFC 基因表达芯片；用于单细胞多重 RT-qPCR 反应的芯片</td></tr><tr><td>48.48 多重 RT qPCR 微流控芯片控制器</td><td>Fluidigm</td><td>89000020</td><td>48.48 IFC 控制器；控制芯片内部流体系统，将样品和检测加载至反应室</td></tr><tr><td>多重 RT qPCR 微流控热循环仪</td><td>Fluidigm</td><td>GE48.48</td><td>48.48 动态阵列 IFC 热循环仪</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AB 1100</td><td>适用于细胞分选和热循环的 96 孔板</td></tr><tr><td>C57Bl/6 小鼠</td><td>Janvier</td><td>C57Bl/6 miceJ@RJ</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309639</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14040174</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>24020133</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>CVFSVF000U</td><td>Eurobio Abcys</td><td>标准胎牛血清</td></tr><tr><td>玻璃匀浆器</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 管</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>FACS 仪器</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75004538</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;l 吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>10313272</td><td></td></tr><tr><td>P1000&amp;nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD8 生物素小鼠抗体</td><td>Sony</td><td>1103520</td><td>谱系抗体</td></tr><tr><td>抗 CD19 生物素小鼠抗体</td><td>Sony</td><td>1177520</td><td>谱系抗体</td></tr><tr><td>抗 TCRab 生物素小鼠抗体</td><td>BioLegend</td><td>109204</td><td>谱系抗体</td></tr><tr><td>抗 TCRgd 生物素小鼠抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553176</td><td>谱系抗体</td></tr><tr><td>抗 Ter119 生物素小鼠抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>谱系抗体</td></tr><tr><td>抗 Gr1 生物素小鼠抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>谱系抗体</td></tr><tr><td>抗 CD45.2 PerCPCy5.5 小鼠抗体</td><td>BioLegend</td><td>109828</td><td></td></tr><tr><td>抗 IL7ra PeCy7 小鼠抗体</td><td>ebioSciences</td><td>25-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD3 BV510 小鼠抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>563024</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD4 BV786 小鼠抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>563727</td><td></td></tr><tr><td>抗 NKp46 PE 小鼠抗体</td><td>ebioSciences</td><td>12-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Sony</td><td>2626025</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td></td></tr><tr><td>电子移液器</td><td>Eppendorf</td><td>4986000017</td><td></td></tr><tr><td>Combitips 0.1 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS+</td><td></td></tr><tr><td>Accudrop</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td>FACS 验证微珠</td></tr></tbody></table>

利用多重rt-qpcr进行单细胞基因表达分析以表征稀有淋巴细胞群体的异质性

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

基因表达异质性是淋巴样细胞群中一个值得研究的有趣特征。这些细胞在细胞活化、应激或刺激过程中，其基因表达会发生变化。单细胞多重基因表达技术可同时检测数十个基因1,2,3。在单细胞水平上，多重基因表达能够确定细胞群体的异质性4,5。该技术可通过确定成熟细胞中不同前体阶段的可能混合情况，以及细胞对刺激反应的多样性，来区分群体异质性。
天然淋巴细胞（ILC）最近被描述为免疫反应中的一类先天性效应细胞群体6,7。本方案旨在稳态条件下研究肝脏ILC区室的细胞异质性。
目前，评估基因表达最常用的技术是逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）。该方法每次只能检测一个基因的表达水平。此外，由于一次检测需要多个细胞，该方法无法评估基因表达的异质性，导致结果反映的是细胞群体的平均基因表达水平。在检测大量基因时，RT-qPCR 会消耗大量时间、试剂和样本。因此，这些权衡限制了可检测的基因数量或细胞群体范围，增加了遗漏整体图景的风险。
本文描述了如何利用单细胞多重RT-qPCR技术克服这些局限性。该技术得益于近年来微流控技术的进步1,2。多重RT-qPCR芯片中的反应体积不超过纳升级别，因此可以在试剂、样本和成本均高效的前提下，实现单细胞基因表达分析以及多个基因的同步表达检测。该方法能够在克隆水平上检测同一细胞群体中不同细胞亚群在不同发育阶段或不同条件下基因表达谱的异质性4,5。在单细胞水平上对稀有细胞群体在大量不同条件下进行研究已不再受限。

淋巴样细胞群体在基因表达上表现出高度多样性。本方案中，采用单细胞多重RT-qPCR基因表达分析方法研究肝脏固有淋巴细胞（ILC）区室的异质性。与其他基因表达技术不同，单细胞多重RT-qPCR基因表达分析可同时对多个细胞群体（包括极为稀有的群体）进行研究。该方法具有克隆水平上的高灵敏度，结合其特异性，能够用于分析同一群体内部以及稀有群体之间的基因表达特征差异。例如，本研究评估了来自4周龄小鼠肝脏的3个ILC群体的基因表达特征。其中一个群体频率较高，易于识别，而另外两个群体在肝脏中较为稀有（占lineage阴性细胞的比例不足1%）。
在肝脏解剖和解离之前，预先准备一个96孔单细胞分选板和一个96孔检测板（图1）。所有混合液均在无菌操作台中配制，并使用电子移液器以确保体积的精确性和可重复性。所有试剂在移液前均需涡旋振荡，以保持均一性。配制完成后，96孔细胞分选板可冷冻保存直至进行细胞分选，96孔细胞检测板可冷冻保存直至上机至...

本方案描述了如何在克隆水平上评估大量基因的表达。单细胞逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）可对数百个样本和基因产生高度可靠且灵敏度强的结果。

利用多重RT-qPCR进行单细胞基因表达分析以表征稀有淋巴细胞群体的异质性

基因表达异质性是淋巴样细胞群中一个值得研究的有趣特征。这些细胞中的基因表达在细胞发育过程中会发生变化……

本实验的总体目标是观察单个细胞中多个基因的表达。该方法有助于解答免疫学领域中的关键问题，例如细胞群体内分子特征的异质性，或稀有分子特征的存在。该技术的主要优势在于，可同时在大量细胞中检测至少48个不同基因的特异性分子特征。首先，在一个1.5毫升离心管中配制适用于48个反应的预扩增混合液。向该管中加入240微升特异性逆转录缓冲液、62.4微升低EDTA TE缓冲液以及9.6微升Taq DNA聚合酶。使用电子移液器，将6.5微升预扩增混合液分别加入96孔单细胞板中的48个孔内。接下来，在一个1.5毫升离心管中配制0.2x的检测反应混合液。向管中加入每种引物各1.4微升，用低EDTA TE缓冲液定容至终体积140微升。使用电子移液器，将 2.5 µL 的 0.2× 检测混合液加入含有预扩增混合液的 96 孔单细胞分选板中的 48 个孔中。用封板膜密封反应板，涡旋混匀后，在 280 ×g 条件下离心 1 分钟。通过荧光激活细胞分选法对单个肝脏固有淋巴样细胞（ILC）进行分选。开始此操作前，先使用一个空的96孔板作为测试。将测试板放置在板架上，使A1孔位于左侧并朝向实验操作者。调整板架，使液滴位于含验证微珠的单孔中央。调整到位后，将含有检测混合液和预扩增产物的96孔单细胞分选板放置在板架上。绘制板布局图，并对门控细胞群进行分选，每孔分选一个细胞。每个细胞在96孔单细胞分选板上的精确定位至关重要，应使用电子表格软件记录板式布局。留出一个孔，其中含有0.2倍体积的检测混合液和预扩增混合液，但不加入细胞，作为空白对照。可选地，留出两行共六个孔用于cDNA梯度稀释，作为引物扩增效率的对照。单细胞分选后立即涡旋振荡，并离心96孔单细胞分选板。将该板放入热循环仪中。按指示进行逆转录和预扩增。为了获得足够的材料，需要对分选后的单个细胞中特定的目标基因进行预扩增。向每个孔中加入36微升低EDTA TE缓冲液，以稀释预扩增的样品。开始此操作前，用移液器将175微升qPCR预混液和17.5微升样品加载试剂加入一个1.5毫升离心管中，配制总量为191微升的主混合液。在新的96孔板中，向48个孔中每个孔加入3.6 µL的主混合液。此板即为96孔样本板。从96孔单细胞分选板中，将2.9 µL预扩增的cDNA转移至新的96孔样本板中，保持各样本在两块板中的位置相同。在新的96孔板上，向其中48个孔各加入3微升检测上样试剂，以制备96孔检测板。向每个孔中加入3微升引物。引物在96孔检测板中的正确位置至关重要。在电子表格软件中记录板布局。开始此操作时，将集成微流控芯片（IFC）放置在实验台上，并使用注射器检查阀门。取下注射器的帽，将其垂直置于一个阀门上，并用力按压。O型环应能移动。用对照液充满芯片。对第二个阀门重复上述步骤后，从芯片底部移除黑色薄膜。将芯片装入IFC控制器中。在IFC控制器屏幕上，选

single-cell-gene-expression-using-multiplex-rt-qpcr-to-characterize

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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利用多重RT-qPCR进行单细胞基因表达分析以表征稀有淋巴细胞群体的异质性

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