单细胞基因表达利用多重RT-qPCR的表征罕见的淋巴人群的异质性

这个协议描述如何评估在克隆水平大阵列的基因的表达。单细胞RT-qPCR的产生与数百个样品和基因的敏感性较强高度可靠的结果。

本实验的总体目标是观察单个细胞中的多个基因表达。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如细胞群内分子特征的异质性或罕见的分子特征。该技术的主要优点是可以同时在许多细胞中评估具有至少 48 个不同基因的特定分子特征。

通过在 1.5 mL 试管中制备用于 48 个反应的预扩增混合物来开始此程序。向试管中加入 240 微升特异性逆转录缓冲液、62.4 微升低 EDTA TE 缓冲液和 9.6 微升 Taq DNA 聚合酶。使用电动移液器，将 6.5 μL 预扩增混合物分配到 96 孔单细胞板中的 48 个孔中。

接下来，在 1.5 mL 试管中制备 0.2x 分析混合物。向试管中加入 1.4 微升每种引物。使用低 EDTA TE 缓冲液将最终体积调整至 140 微升。

使用电动移液器，将 2.5 微升 0.2x 检测混合物分配到 96 孔单细胞分选板的 48 个孔中，其中包含预扩增混合物。用盖膜密封板。涡旋板，以 280 倍 g 离心 1 分钟。

单个肝脏先天性淋巴细胞 （ILC） 将通过荧光激活细胞分选进行分选。使用空的 96 孔板作为测试开始此过程。将测试板放在板架上，a 单孔位于左侧并朝向实验者。

调整板架，在带有验证珠的单孔中心获得一滴。适当调整后，将包含检测混合物和预扩增的 96 孔单细胞分选板放在板架上。绘制板布局，并在门控群体的每个孔中对一个细胞进行排序。

96 孔单细胞分选板上，每个细胞的正确定位至关重要，并且板布局应保存在电子表格软件中。留下一个含有 0.2x 测定混合物和不含细胞的预扩增混合物的孔，作为无起始量对照。或者，留下两排 6 个孔用于 cDNA 稀释，作为引物效率的对照。

单细胞分选后，立即涡旋并向下旋转 96 孔单细胞分选板。将板放入热循环仪中。如图所示进行逆转录和预扩增。

为了获得足够的材料，需要在分选的单细胞上预扩增特异性靶基因。通过向每个孔中加入 36 μL 低 EDTA TE 缓冲液来稀释预扩增的样品。要开始此程序，将 175 μL qPCR Master Mix 和 17.5 μL 样品上样试剂移液到 1.5 mL 试管中，制备 191 μL 预混液。

在新的 96 孔板上，将 3.6 μL 预混液分配到 48 个孔中的每个孔中。这是 96 孔样品板。将 2.9 μL 预扩增的 cDNA 从 96 孔单细胞分选板转移到新的 96 孔样品板中，同时保持两个板之间每个样品的位置相同。

通过将 3 微升检测上样试剂分配到新的 96 孔板上的 48 个孔中，制备 96 孔检测板。向每个孔中加入 3 微升引物。每个引物在 96 孔检测板中的正确定位至关重要。

在电子表格软件上保留板布局。要开始此过程，请将集成微流体电路或 IFC 放在工作台上，并使用注射器检查阀门。取下注射器的盖子，将其垂直于一个阀门放置，然后用力按压。

O 形圈应该移动。用控制管路液体填充芯片。使用第二个阀门重复上述步骤后，去除芯片底部的黑色薄膜。

将芯片加载到 IFC 控制器中。在 IFC 控制器屏幕上，选择 prime，然后运行。接下来，弹出芯片，并重新密封芯片底部的黑色薄膜。

使用 8 通道移液器，将 5 μL 从 96 孔检测板转移到芯片的一侧或左侧。更换芯片每个孔的吸头。避免产生气泡，如果出现气泡，请使用 10 微升吸头将其去除。

如图所示填充芯片的左侧。以同样的方式，使用 96 孔样品板中的 5 微升填充芯片右侧。为了本实验的成功，必须正确填充 IFC 芯片，以便正确加载到 IFC 控制器中。

撕掉芯片底部的蓝色薄膜，然后将芯片装入 IFC 控制器。在 IFC controller 屏幕上，选择 load mix，然后选择 run。完成后，弹出芯片，然后重新密封芯片底部的蓝色薄膜。

要运行芯片，首先在微流体 qPCR 计算机上选择数据收集软件。启动后，选择 New run （新建运行）。选择 eject 并加载芯片。

按照文本协议中的说明设置软件后，选择 start run （开始运行）。反应大约需要 90 分钟。要开始数据分析，请打开实时 PCR 分析软件，选择文件，然后打开，找到实验文件夹，然后选择 chip run dot b m one 文件。

单击分析视图、结果表和热图视图。标有 x 的方框低于阈值检测水平，和/或扩增曲线不良。为样本命名。

转到样品设置并选择新的 SBS 96。单击映射，然后根据 96 孔样品板布局选择样品布局。从电子表格软件中复制并粘贴示例布局设计。

将粘贴的布局定义为样本名称。使用相同的程序命名分析。在检测器设置中输入引物名称，并将粘贴的布局定义为检测器名称。

单击 analysis view 并 analyze。选择 file （文件），然后导出 （export） 并另存为热图结果。使用流式细胞术，根据广泛表达的 ILC 标志物对肝脏 ILC 群体进行分类，并定义了三个不同的群体。

正确加载的单细胞多重基因表达芯片应以直线和行出现，每个反应室都充满并处于相同的维度。加载不当的芯片将有空线和反应室行，以及弯曲线。正确加载的芯片的荧光素酰胺图显示了几个循环后反应室亮度的差异。

具有放大信号的反应室比没有放大信号或放大信号低的反应室看起来更亮。经过适当的细胞分选、预扩增和加载后，ILC 群体在成年野生型小鼠肝脏中的基因表达似乎具有异质性。左侧是未修改的热图。

右侧是样品和检测名称定义后获得的修改后的热图。使用在线软件，确定了细胞特异性基因表达特征和细胞群关系。每行代表一个基因，每行代表同一个细胞，三个细胞群用蓝色、红色和绿色表示。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 9 小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要仔细跟踪板的细胞和引物分布方向。经过开发，这项技术为研究人员探索细胞群中罕见和特异性的分子特征铺平了道路。

观看本视频后，您应该对如何在适当的细胞分选、预扩增和上样后同时评估许多单细胞中的多个基因表达有一个很好的了解。