利用多重RT-qPCR进行单细胞基因表达分析以表征稀有淋巴细胞群体的异质性

本实验的总体目标是观察单个细胞中多个基因的表达。该方法有助于解答免疫学领域中的关键问题，例如细胞群体内分子特征的异质性，或稀有分子特征的存在。该技术的主要优势在于，可同时在大量细胞中检测至少48个不同基因的特异性分子特征。

首先，在一个1.5毫升离心管中配制适用于48个反应的预扩增混合液。向该管中加入240微升特异性逆转录缓冲液、62.4微升低EDTA TE缓冲液以及9.6微升Taq DNA聚合酶。使用电子移液器，将6.5微升预扩增混合液分别加入96孔单细胞板中的48个孔内。

接下来，在一个1.5毫升离心管中配制0.2x的检测反应混合液。向管中加入每种引物各1.4微升，用低EDTA TE缓冲液定容至终体积140微升。

使用电子移液器，将 2.5 µL 的 0.2× 检测混合液加入含有预扩增混合液的 96 孔单细胞分选板中的 48 个孔中。用封板膜密封反应板，涡旋混匀后，在 280 ×g 条件下离心 1 分钟。

通过荧光激活细胞分选法对单个肝脏固有淋巴样细胞（ILC）进行分选。开始此操作前，先使用一个空的96孔板作为测试。将测试板放置在板架上，使A1孔位于左侧并朝向实验操作者。

调整板架，使液滴位于含验证微珠的单孔中央。调整到位后，将含有检测混合液和预扩增产物的96孔单细胞分选板放置在板架上。绘制板布局图，并对门控细胞群进行分选，每孔分选一个细胞。

每个细胞在96孔单细胞分选板上的精确定位至关重要，应使用电子表格软件记录板式布局。留出一个孔，其中含有0.2倍体积的检测混合液和预扩增混合液，但不加入细胞，作为空白对照。可选地，留出两行共六个孔用于cDNA梯度稀释，作为引物扩增效率的对照。

单细胞分选后立即涡旋振荡，并离心96孔单细胞分选板。将该板放入热循环仪中。按指示进行逆转录和预扩增。

为了获得足够的材料，需要对分选后的单个细胞中特定的目标基因进行预扩增。向每个孔中加入36微升低EDTA TE缓冲液，以稀释预扩增的样品。开始此操作前，用移液器将175微升qPCR预混液和17.5微升样品加载试剂加入一个1.5毫升离心管中，配制总量为191微升的主混合液。

在新的96孔板中，向48个孔中每个孔加入3.6 µL的主混合液。此板即为96孔样本板。从96孔单细胞分选板中，将2.9 µL预扩增的cDNA转移至新的96孔样本板中，保持各样本在两块板中的位置相同。

在新的96孔板上，向其中48个孔各加入3微升检测上样试剂，以制备96孔检测板。向每个孔中加入3微升引物。引物在96孔检测板中的正确位置至关重要。

在电子表格软件中记录板布局。开始此操作时，将集成微流控芯片（IFC）放置在实验台上，并使用注射器检查阀门。取下注射器的帽，将其垂直置于一个阀门上，并用力按压。

O型环应能移动。用对照液充满芯片。对第二个阀门重复上述步骤后，从芯片底部移除黑色薄膜。

将芯片装入IFC控制器中。在IFC控制器屏幕上，选择“预启动”（prime），然后运行。接着弹出芯片，并重新密封芯片底部的黑色薄膜。

使用八通道移液器，将 96 孔检测板中的 5 µL 液体转移至芯片的一侧（即左侧）。每次更换芯片的每个孔时均需更换吸头。避免产生气泡，若出现气泡，可使用 10 µL 吸头将其移除。

按照指示填充芯片的左侧。同样，从96孔样品板中取5微升填充芯片的右侧。为了确保本实验成功，必须正确填充IFC芯片，以便顺利装入IFC控制器。

取下芯片底部的蓝色薄膜，将芯片装入IFC控制器中。在IFC控制器屏幕上，选择加载混合液，然后运行。完成后，弹出芯片，并将蓝色薄膜重新密封在芯片底部。

运行芯片时，首先在微流控qPCR计算机上选择数据采集软件。启动后，选择新建运行。选择弹出并加载芯片。

按照文本方案中所述设置软件后，选择“开始运行”。反应过程大约需要90分钟。要开始数据分析，请打开实时PCR分析软件，选择“文件”菜单中的“打开”，找到实验文件夹，然后选择扩展名为.bm1的芯片运行文件。

点击分析视图、结果表格和热图视图。用 x 标记的方框表示低于阈值检测水平和/或扩增曲线异常。为样本命名。

进入样本设置，选择新的 SBS 96。点击映射，根据 96 孔样本板的布局选择样本排列方式。从电子表格软件中复制样本布局设计并粘贴。

将粘贴的布局定义为样本名称。使用相同步骤命名检测。在检测器设置中输入引物名称，并将粘贴的布局定义为检测器名称。

点击分析视图并进行分析。选择文件，导出并另存为热图结果。通过流式细胞术，根据广泛表达的固有淋巴细胞（ILC）标记物对肝脏ILC群体进行分选，并定义了三个不同的群体。

正确加载的单细胞多重基因表达芯片应呈现整齐的直线和行列，每个反应室均被填充且尺寸一致。加载不当的芯片则会出现空的反应室行列以及弯曲的线条。这张显示正确加载芯片的荧光素酰胺图像表明，经过几个循环后，反应室的亮度出现差异。

具有扩增信号的反应室比无扩增或低扩增信号的反应室更亮。经过适当的细胞分选、预扩增和上样后，在成年野生型小鼠肝脏中，ILC群体在基因表达上呈现异质性。左侧为未经修饰的热图。

右侧是定义样本和检测名称后获得的修正热图。通过使用在线软件，鉴定了细胞特异性基因表达特征及细胞群体之间的关系。每行代表一个基因，每列代表相同的细胞，三个细胞群体分别以蓝色、红色和绿色表示。

一旦掌握，该技术可在九小时内完成，前提是操作得当。在进行该过程时，必须仔细记录培养板的方向，以确保细胞和引物的分布准确无误。该技术建立后，为研究人员探索细胞群体中稀有且特异的分子特征铺平了道路。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在完成适当的细胞分选、预扩增和上样后，同时对大量单个细胞中的多个基因表达进行评估。