从健康志愿者和它们的迁徙可能通过血清中的影响心脏手术后的内皮祖细胞的分离

内皮祖细胞（EPCs）的关键参与缺血组织的新血管形成。这个方法描述了从外周血内皮祖细胞的分离，以及它们对心脏手术患者的血清样品洄游潜在的识别。

该细胞分离程序和迁移方案的总体目标是展示一种分离内皮祖细胞及其向心脏手术患者血清样本迁移潜力的可靠方法。这种方法可以帮助回答内皮衬里和血管再生中的关键问题，这是心脏手术后由于缺血和再灌注相关损伤而需要的。该技术的主要优点是分离祖细胞的方法相对简单，包括 CD-34 阳性细胞的预分离。

除了死亡之外，心脏手术的主要并发症仍然太常见了。强调在心脏手术期间确定 tie 风险和保护机制的必要性。内皮祖细胞在缺血组织的新生血管形成中起着关键作用，并且已知具有心脏保护特性。

开始实验时，将血液与无钙和无镁 PBS 一对一混合。向 50 mL 试管中加入 15 mL 密度梯度溶液。并将稀释的血液慢慢铺在密度梯度溶液的顶部。

接下来，离心样品。使用无菌塑料移液器，小心收集每支试管的血沉棕黄层，并将其放入另一支试管中，同时避免密度梯度溶液。用至少三种体积的 PBS 稀释外周血单核细胞或 PBMC 组分，并通过移液混合溶液。

在室温下以 200 倍 G 离心混合物 15 分钟，然后吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 毫升内皮细胞生长培养基 MV-2 中。重悬细胞后，每件用过的血沉棕黄层添加 100 微升人 CD-34 抗体并旋转细胞。每件用过的血沉棕黄层加入 50 μL 葡聚糖包被的磁珠，并旋转细胞。

孵育后，将悬浮液转移到传真管中，每管最大为 3 mL。接下来，将传真管插入磁铁并等待五分钟。丢弃超级清脱液，不要将传真管从磁铁中拉出。

然后，在磁铁之外，用 3 毫升 MV-2 培养基重悬每个传真管中的细胞。将细胞悬液转移到预包被的 T-75 培养瓶中。向每个培养瓶中加入 17 ml MV-2 培养基。

为了制备迁移测定，使用移液管从 T-75 培养瓶中的内皮祖细胞或 EPC 中去除培养基。用 5 毫升磷酸盐缓冲盐水或 PBS 洗涤细胞，然后小心摇动培养瓶。接下来，去除 PBS 并加入 5 毫升市售细胞分离溶液。

然后，等到细胞在光学显微镜下分离。通过小心敲击烧瓶底部来加速分离。当细胞分离后，快速加入 5 ml MV-2 完全培养基，并将细胞悬液转移到另一个试管中。

细胞以 2， 000 x G 离心 5 分钟。沉淀细胞后，将它们重悬于 5 至 10 毫升 PBS 中。并再次离心它们。

再次将细胞重悬于 5 至 10 mL PBS 中，然后离心。将细胞沉淀重悬于 MV-2 饥饿的培养基中。接下来，在 MV-2 饥饿培养基中将血清样品稀释 1 至 5 次。

通过将 235 μL 血清样品添加到下腔室中来制备迁移板。在添加细胞溶液之前不久添加插入片段。然后，将 75 微升细胞溶液加入上腔室。

允许 EPC 迁移。移除包含所有未迁移细胞的上腔室。加入 75 微升 3.6% 多聚甲醛溶液，包括稀释度为 1 至 1， 000 的 hoechst 染料。

将板快速离心，使所有细胞以 2， 000 x G 的离心速度进入同一焦平面，持续 1 至 2 分钟。为避免血清自发荧光伪影，通过在显微镜下以 100 倍放大倍率每孔拍摄 5 张照片来定量迁移的细胞。最后，使用半自动软件对迁移的细胞进行计数。

EPC 的传真分析验证了 acLDL 的摄取，以及分离细胞群表面 CD-31 的表达。分离 acLDL 和 CD-31 的分析揭示了每个标志物的均匀分布。Elyso 确定心肌再灌注损伤后心脏手术对 MIF、CXCL12、CXCL8 和 VEGF 循环血清水平浓度的影响。

前和术中抽取血清样本。与基线值相比，血清 MIF 、 CXCL12 和 CXCL8 水平显示术中显着升高。相比之下，VEGF 浓度没有显示出任何显着变化。

使用从健康志愿者中分离的 EPC 使用手术前和手术期间抽取的血清样本进行离体迁移测定，结果显示向术中采集样本的迁移率显着增加。遵循这种技术，可以很容易地分离出外周血单核细胞，以回答其他与炎症相关的问题。