蒸发减少培养条件的提高多细胞球体形成的微孔板重现

该程序的总体目标是在 384 孔板中使用液体覆盖技术提高均匀球状体形成的可扩展性和可重复性。该技术的主要优点是它减少了来自多个板的过度培养基再作，从而提高了球状体形成的可重复性。我们在实验室开发并验证了用于节肢动物筛选测试的 3D 球体培养方法，我们的研究是评估多细胞培养板中的边缘效应。

今天我将与实验室的海报 Sona 一起演示该程序。通过称取零点 7 5 克低熔点琼脂糖开始此程序，并将其添加到 100 毫升含或不含酚红且不含血清的 McCoy's 5a 培养基中。在微波炉中加热溶液，每 1 到 2 分钟旋转一次，以完全溶解琼脂糖。

然后对溶液进行高压灭菌。让高压灭菌的琼脂糖冷却至约 70 摄氏度后，通过层流箱中的 500 毫升零点 2 2 微米瓶顶过滤器过滤。接下来，如果整个溶液不会一次使用，请将其分装。

将这种即用型琼脂糖溶液无菌储存在冷藏室或 4 摄氏度冰箱中长达 4 周。在流动箱中工作，将塑料或金属尖端分液盒安装在组合试剂分液器中。将管路重量放入含有 70% 乙醇的容器中，然后灌注包盒。

然后，将管重移至 PBS 容器中并再次灌注。接下来，在微波炉中加热储存的等分试样的过滤琼脂糖溶液以使其融化。用琼脂糖溶液灌注分配盒，然后开始方案，用 15 微升过滤的琼脂糖溶液包被 384 孔组织培养处理的微板。

让板中的琼脂糖冷却 15 到 20 分钟，然后按照视频下一部分的说明接种细胞，或将它们储存在 4 摄氏度下，避免阳光直射。最后，要清洁分液盒，请将管路重量放入 70 至 80 摄氏度的无菌水中，然后按下分液器上的灌注按钮。这将去除盒尖端和试管中残留的琼脂糖。

以下细胞接种过程应在无菌条件下和层流箱中进行。首先从冷藏中取出所需数量的琼脂糖包被的 384 孔组织培养处理微孔板，让它们平衡至室温 15 分钟。同时，通过用 70% 乙醇和无菌 PBS 灌注标准试管分配盒，准备用于细胞观察的复合试剂分配器。

接下来，使用分液器上的手动设置按钮，将分液量调整到所需的微升，并将分液速度调整为中等。使用重组细胞解离酶从组织培养瓶中去除贴壁的人结直肠癌 HCT116 细胞。在无菌烧杯中，在 50 μL 完全生长培养基中，以 2.5 倍/孔 10 至 4 个细胞的密度制备细胞悬浮液。

如果要接种多个 384 孔板，请使用磁力搅拌器防止它们沉降到烧杯底部。使用分液器，将 2500 个细胞添加到 384 孔板的每个孔中。让板在室温下静置 30 分钟。

同时，取减少蒸发的环境微孔板盖，使用 5 毫升移液管，将 4 毫升 5% 二甲基亚砜分配到左侧槽中，缓慢上下扫动。用右侧槽重复此过程。确保添加到侧槽中的液体不会在盖子中心合并，并留下气体交换间隙。

如果添加过多的液体，它会渗入盖子的外部，随后进入 384 组织培养板的外孔。30 分钟后，在显微镜下检查细胞。将板静置 30 分钟可使细胞完全沉降在孔底并彼此靠近，这对于每孔形成单个球体非常重要。

离心后，用无菌水填充 384 组织培养板的储液器，并用充满液体的环境盖替换常规板盖。将板放入 37 摄氏度的旋转培养箱中，湿度为 95%，二氧化碳为 5%，氧气为 20%，让细胞聚集成多细胞肿瘤球或 MCTS，为期四天。避免在随后的几天内打开培养箱门太久，以免湿度水平突然下降。

在 NCTS 形成后的第 4 天，使用自动洗板机向每个孔中加入 30 微升预热的培养基。将 MCTS 放回培养箱中，让 MCTS 生长，直到它们达到实验所需的大小。每三天更换一次介质，凭经验调整清洗歧管的 Z 高度，并设置分液速度和清洗歧管以最低速率向下进入孔的速度，以最大限度地减少孔中的湍流。

每孔吸出 30 μL 培养基，并用 30 μL 新鲜的预热培养基代替。然后将细胞放回培养箱中。使用数值孔径为 16 的 4 X 空气物体在高内涵自动成像系统中对 MCTS 进行成像。

使用成像软件，将曝光时间设置为 11 毫秒，将像素合并设置为 4 x 4。根据需要调整 z 堆栈的数量和间距以及像素合并，以便实验在每个孔中捕获整个 MCTS。逐步处理 2D 图像以测量 MCTS 面积、长轴和短轴、周长和固体度。

有关具体说明，请参阅随附的 m 代码和文本自述文件。为了确定该常规的潜在适用性，用不同浓度的抗癌药物、紫杉醇、PTX、长春新碱、VCR、奥沙利铂、OXA、多柔比星、DOX 和三种不同浓度的五氟拉西、5-FU 治疗 7 天大的 MCTS，持续 4 天。此处显示了 MCTS 的图像。

分析这些图像以确定与对照 CTL 相比，药物治疗的 MCTS 的面积、长轴和短轴、周长和固体度。长轴和短轴用于计算几何体积。药物治疗后 MCTS 面积和体积呈浓度依赖性降低。

尽管长春孕素的零点 1 微克和多柔比星零点每毫升 4 微克和氟尿嘧啶导致 MCTS 面积增加，但只有在长春霉素零零点 1 微克/毫升之后，体积才显著增加。仅在最高浓度的包克利他赛、多柔比星和五氟尿嘧啶下，MCTS 周长显著不同，这完全影响了 MCTS 的大小。用包克利紫杉醇和长春晶素处理零点 2 5 微克/毫升和零点 0 零 6 微克/毫升，多柔比星和五氟尿嘧啶 100 微克/毫升，导致固体度显着降低，表明 MCTS 完全或部分崩解。

综上所述，这些数据证明了该方法在研究潜在抗癌药物方面的实用性。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两个小时内完成。在尝试此程序时，需要注意的是，并非所有细胞系都适用于特定的 3D 培养方法，不同的细胞系形成的球状体在球状体形状、大小、组织学和生长动力学方面表现出差异。

我们开发的刺激程序可以有效评估球体大小，特别是在部分崩解的药物处理球体中，这些球体没有明确定义的横截面积测量边界。观看此视频后，您应该很好地了解了这样一个事实，即此处提供的修饰不需要任何额外的设备或耗材，并且可以在您的节肢动物筛查实验室中常规实施。