蒸发减少型培养条件提高微孔板中多细胞球体形成的可重复性

本实验的主要目标是利用384孔板中的液体覆盖技术，提高均一球形细胞聚集体形成的可扩展性和可重复性。该技术的主要优势在于减少了对多块培养板进行频繁培养基操作的需要，从而提高了球形细胞聚集体形成的可重复性。我们实验室已建立并验证了用于节肢动物筛选实验的三维球形细胞聚集体培养方法，本研究旨在评估多细胞培养体系中培养板的边缘效应。

今天，我将与实验室的Sona一起演示该实验步骤。首先称取0.75克低熔点琼脂糖，加入100毫升McCoy's 5a培养基中（可含或不含酚红，且不含血清）。将溶液放入微波炉中加热，每隔1至2分钟摇动一次，以彻底溶解琼脂糖。

然后将溶液进行高压灭菌以达到灭菌效果。在高压灭菌后的琼脂糖冷却至约 70 摄氏度后，在超净工作台中使用 500 毫升 0.22 微米的瓶顶滤器过滤溶液。接下来，如果不会一次性使用全部溶液，需将其分装成若干 aliquot。

将此即用型琼脂糖溶液在无菌条件下储存于冷室或4°C冰箱中，最多可保存四周。在超净工作台内操作，将带有塑料或金属喷嘴的试剂分配盒安装至组合式试剂分配器上。将管路配重放入盛有70%乙醇的容器中，随后对分配盒进行预冲洗。

然后，将管路配重移入盛有 PBS 的容器中，并再次进行预冲洗。接着，将保存的过滤琼脂糖溶液 aliquot 在微波炉中加热熔化。用琼脂糖溶液对分配盒进行预冲洗，然后启动程序，向 384 孔组织培养处理的微孔板中每孔加入 15 µL 过滤琼脂糖溶液进行包被。

将平板中的琼脂糖冷却15至20分钟，然后按照视频下一节所述接种细胞，或将平板置于4摄氏度、避光处保存。最后，为了清洗分配盒，将管路重物放入70至80摄氏度的无菌水中，并按下分配器上的引液按钮。这将清除分配盒尖端和管路中残留的任何琼脂糖。

以下细胞接种过程应在无菌条件下于超净工作台中进行。首先，从冷藏环境中取出所需数量的经琼脂糖包被的384孔组织培养处理微孔板，并在室温下平衡15分钟。在此期间，通过使用70%乙醇和无菌PBS预润洗标准管式分配盒，为细胞接种准备复合试剂分配仪。

接下来，使用分配器上的手动设置按钮，将分配体积调整至所需的微升数，分配速度调整为中等。使用重组细胞解离酶从组织培养瓶中消化贴壁的人结直肠癌 HCT116 细胞。在无菌烧杯中，用 50 微升完全培养基将细胞制成细胞悬液原液，细胞密度为每毫升每孔 2.5 × 10⁴ 个细胞。

若需接种多个384孔板，请使用磁力搅拌器防止细胞沉降至烧杯底部。使用分液器将2500个细胞加入384孔板的每孔中。将板在室温下静置30分钟。

同时，取一个可减少蒸发的环境微孔板盖，使用5毫升移液器将4毫升5%二甲基亚砜缓慢地加入盖子左侧的槽中，上下缓慢扫动以分配液体。对右侧的槽重复此操作。确保加入侧槽的液体在盖子中央不相互汇合，留出气体交换的间隙。

如果加入过多液体，液体将渗入盖子外部，随后进入384孔组织培养板的外侧孔中。30分钟后，在显微镜下观察细胞。将培养板静置30分钟，可使细胞完全沉降至孔底并相互靠近，这对于每个孔中形成单一球状体至关重要。

将接种好的培养板在4 × g条件下离心15分钟。离心后，向384孔组织培养板的液体储液槽中加入无菌水，并将常规板盖更换为含液体的环境控制盖。将培养板置于37°C旋转培养箱中，培养箱条件为95%湿度、5% CO2和20%氧气，培养4天使细胞聚集形成多细胞肿瘤球（MCTS）。在随后的几天中，避免长时间打开培养箱门，以防湿度水平骤降。

在NCTS形成后的第四天，使用自动酶标板洗板机分配器向每个孔中加入30微升预热的培养基。将MCTS放回培养箱中，继续培养至达到实验所需的大小。每三天更换一次培养基，需根据经验调整洗板机多通道头的Z轴高度，并将分配速度以及多通道头下降进入孔板的速度设为最低，以尽量减少孔内液体的湍流。

每孔吸出30微升培养基，加入30微升新鲜的预温培养基，然后将细胞放回培养箱。使用数值孔径为0.16的4倍空气物镜，在高内涵自动成像系统中对多细胞球体（MCTSs）进行成像。

使用成像软件，将曝光时间设置为 11 毫秒，像素合并（binning）设置为 4×4。根据实验需求调整 z 轴层厚（z-stacks）的数量和间距以及像素合并方式，以确保每个孔中的整个多细胞肿瘤球体（MCTS）均被完整捕获。逐步处理 2D 图像，以测量 MCTS 的面积、长轴与短轴、周长及实心度（solidity）。

请参阅随附的 m 代码和文本说明文件以获取具体操作说明。为评估该程序的潜在适用性，使用不同浓度的抗癌药物紫杉醇（Paclitaxel, PTX）、长春新碱（Vincristine, VCR）、奥沙利铂（Oxalyplatin, OXA）、多柔比星（Doxyrubicin, DOX）以及 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）处理培养 7 天的多细胞肿瘤球体（MCTS），每种药物设三个不同浓度，处理时间为 4 天。此处展示了 MCTS 的图像。

通过分析这些图像，确定了药物处理的多细胞肿瘤球体（MCTS）与对照组（CTLs）相比的面积、长轴和短轴、周长以及实心度。利用长轴和短轴计算几何体积。药物处理后，MCTS 的面积和体积均呈现浓度依赖性下降。

尽管每毫升0.01微克的长春新碱、每毫升0.4微克的多柔比星和5-氟尿嘧啶可导致多细胞肿瘤球（MCTS）面积增加，但仅在每毫升0.001微克长春新碱处理后，其体积显著增加。MCTS周长仅在紫杉醇、多柔比星和5-氟尿嘧啶的最高浓度下表现出显著差异，这些浓度完全影响了MCTS的大小。使用每毫升0.25微克紫杉醇和每毫升0.06微克长春新碱，以及每毫升100微克多柔比星和5-氟尿嘧啶处理后，MCTS的实心度显著降低，表明MCTS发生了完全或部分解体。

综上所述，这些数据表明该方法在研究潜在抗癌药物方面具有实用价值。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行此实验时，需要注意并非所有细胞系都适用于特定的三维培养方法，不同细胞系形成的球状体在形态、大小、组织学特征及生长动力学方面均可能存在差异。

我们开发的刺激程序能够有效评估类球体的大小，尤其适用于部分解体的药物处理类球体，这类类球体通常没有明确的边界，难以测量其横截面积。观看本视频后，您应充分理解，此处介绍的改进方法无需任何额外设备或耗材，可常规应用于您的节肢动物筛选实验室中。