Name: 蒸发减少培养条件的提高多细胞球体形成的微孔板重现 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 了解使用低熔点琼脂糖液体覆盖技术在384孔板中培养多细胞肿瘤球体的方法。该技术通过减少培养基蒸发损失来提高球体形成的重现性，适用于细胞生物学和肿瘤学研究中的药物筛选实验。

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本工作得到了捷克教育、青年和体育部（LO1304）以及捷克技术局（TE01020028）资助项目的资助。作者谨此感谢Lakshman Varanasi博士拍摄环境盖板的静态图像。

1. 琼脂糖包被板的制备
<ol>
	<li>称取 0.75 g 低熔点琼脂糖，加入 100 mL 不含血清的 McCoy's 5A 培养基（含或不含酚红）中。将溶液放入微波炉加热，每隔 1–2 分钟摇匀一次，直至琼脂糖完全溶解。将溶液经高压灭菌以达到无菌状态。</li>
	<li>将灭菌后的琼脂糖溶液冷却至约 70 °C，并在超净工作台中通过真空过滤装置，使用 500 mL、0.22 µm 滤器进行过滤。若不一次性使用全部溶液，可将 0.75% 过滤琼脂糖溶液（FAS）分装为较小体积。将此即用型琼脂糖溶液无菌储存于冷室或 4 °C 冰箱中，最多可保存 4 周。</li>
	<li>将带有塑料或金属喷嘴的短管连接至 Combi 试剂分配器，并在超净台中先用 70% 乙醇（EtOH）润洗分配卡匣，随后再用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）进行预润洗。</li>
	<li>使用前，将储存的 FAS 分装液在微波炉中加热融化。用琼脂糖溶液润洗分配卡匣，并向 384 孔、经组织培养（TC）处理的“特殊”微孔板中每孔加入 15 µL FAS 进行包被。让微孔板中的琼脂糖冷却 15–20 分钟后再接种细胞。将包被琼脂糖的微孔板用聚乙烯袋包裹后，无菌保存于冷室或 4 °C 环境中，避免直接光照。 
	注意：避免反复加热 0.75% FAS，以防储备液中琼脂糖浓度发生变化。在上述条件下储存时，琼脂糖包被板最多可保存 2 周。包被微孔板时无需对 FAS 进行加热。</li>
	<li>通过向分配卡匣中注入 70–80 °C 的无菌水进行润洗，以清除卡匣喷嘴和管路中残留的琼脂糖。</li>
</ol>
2. 细胞培养与多细胞球体形成
<ol>
	<li>培养人结直肠癌 HCT116 细胞，方法如前所述8.</li>
	<li>从冷藏处取出所需数量的琼脂糖包被、384孔、TC处理的微孔板，于室温（RT）平衡15分钟。</li>
	<li>通过使用70%乙醇和无菌PBS对标准管式分配 cassette 进行预冲洗，为细胞接种准备Combi试剂分配器。将接种体积调整至所需值 µL 并使用分配器上的手动设置按钮将分配速度调至中等。 
	注意：整个细胞接种过程均在无菌条件下于层流柜中进行。</li>
	<li>使用重组细胞解离酶从组织培养瓶中解离贴壁细胞。在无菌烧杯中制备细胞悬液原液，接种细胞密度为 2.5 x 104 每孔细胞数/mL 50 µL 完全培养基。当接种多个384孔板时，使用磁力搅拌器搅拌细胞，以防止细胞沉降到烧杯底部。</li>
	<li>让培养板在室温下静置 30 分钟，然后在 4 x g 条件下离心 15 分钟。</li>
	<li>同时，取一个防蒸发环境盖，加入8 mL无菌H2O 或 5% 二甲基亚砜（DMSO）加入短边（左侧和右侧），使用 5 mL 移液管（图1A首先，通过缓慢上下移动移液枪头，向左侧槽中加入4 mL填充液。用同样方法向右侧槽中重复此步骤。 
	注意：加入侧槽的液体不应在盖子中央汇合，需留出气体交换的间隙。图1A）。加入过量的 H2O 结果导致 H 的渗漏2O 加入盖子外侧，随后加入 384 孔 TC 板的外周孔中。</li>
	<li>用无菌 H 填充 384 孔 TC 板的液体储液槽2O，并将常规培养皿盖替换为装有液体的环境盖（图 2A).</li>
	<li>将培养皿放入 37 °C 带有95%湿度、5% CO₂的旋转培养箱2，以及 20% O₂2，让细胞聚集形成多细胞球体（MCTSes）培养4天。在随后的几天中，避免长时间打开培养箱门，以防止湿度水平骤降。</li>
</ol>
3. 使用机器人系统进行培养基更换
<ol>
	<li>在MCTS形成后的第4天，使用自动微孔板洗涤器分配器向每孔加入30 µL预热的培养基。继续培养MCTS 3天。此后每3天定期更换培养基，直至MCTS达到实验所需的大小。</li>
	<li>为从每孔中吸取特定体积的培养基，需通过实验调整洗涤器多通管的z轴高度。每孔吸取30 µL培养基，并替换为30 µL新鲜的预热培养基。 
	注意：将分配速度以及洗涤器多通管进入孔板的速度设为最低，以尽量减少孔内液体的湍流。</li>
</ol>
4. MCTS 的高内涵成像与半自动化图像分析
<ol>
	<li>使用4倍空气物镜（数值孔径16）在高内涵自动成像系统中对多细胞球体（MCTS）进行成像。</li>
	<li>将曝光时间设置为 11 ms，像素合并设置为 4 × 4。调整数量和间距 z根据实验需求设置堆栈和像素合并，以捕获每个孔中的完整多细胞球体（MCTS）。</li>
	<li>按照“readme”中的说明，使用自行编写的编程语言程序逐步处理图像。 
	注意：.m 代码文件和 .txt 说明文件可作为补充代码文件获取（图1B）。常规测量方法从二维图像中获取多细胞球体（MCTS）的面积、长轴和短轴、周长及实心度。</li>
</ol>
<img alt="正确加液与过量液体的培养板示意图；图像分析的预处理与分割流程图。" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：防蒸发环境盖的制备及半自动分析流程图。（A）防蒸发环境盖中填充适量（左）与过量（右）填充液（此处为5% DMSO）的图像。箭头指示用于加液的短边凹槽。星号标示在加入适量DMSO后盖子中央出现的缝隙。（B）展示半自动图像分析流程中各步骤的工作流程图。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55403/55403fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

用过滤的琼脂糖包被384孔TC板
在LOT中的标准操作是使用1-1.5%的低熔点琼脂糖对培养板进行包被，这要求琼脂糖和/或分配装置保持加热状态，以防止琼脂糖凝固6。当使用内径在0.2至0.4 mm之间的细管路液体分配 cassette 制备多块培养板时，琼脂糖的凝固可能带来潜在问题。为克服分配 cassette 可能发生堵塞的问题，采用了0.75%的FAS，因其在分配过程中无需额外加热。偶然发现，0.75%的FAS比未过滤的1-1.5%甚至0.75%琼脂糖溶液凝固速度更慢。使用0.75%的FAS时，可在不到35秒内完成整块384孔TC培养板的包被，且不会堵塞分配 cassette。实验结束后，可通过用加热的水对 cassette 进行预冲洗来清洗，以去除残留的琼脂糖，防止 cassette 闲置时残留物堵塞管尖。
环境盖与旋转孵育器相较于常规板盖与孵育器
蒸发引起的培养基不均匀损失显著影响了均一MCTS形成的可重复性，从而损害了检测结果...

肿瘤中的癌细胞在生理上以复杂的三维（3D）结构排列，周围环绕着细胞外基质及相互作用的细胞。由于组织中几乎所有细胞都存在于3D环境中，因此迫切需要更符合生理相关性的 体外 模拟肿瘤特征的肿瘤模型推动了多种三维培养技术的发展1,2,3这些模型现已成为研究肿瘤微环境在三维条件下对转移及细胞治疗反应作用的基础研究工具。2此外，与二维（2D）细胞培养相比43D 模型有助于更好地理解影响细胞信号通路的肿瘤-间质相互作用。
癌细胞系的多细胞肿瘤球体（MCTSes）因其在三维细胞培养模型中相对接近 体内 肿瘤。在现有的多种技术中，基于琼脂糖包被板的液体覆盖技术（LOT）在多细胞肿瘤球体（MCTS）生成中备受关注，广泛应用于先导化合物优化和靶点验证。5,6,7,8,9,10,11这一点在最近的研究中显而易见，这些研究已成功利用LOT在MCTS培养物中开展了化合物文库的初步筛选。6,7然而，由于蒸发导致培养基不均匀流失，使用微孔板（MPs）进行液滴法（LOT）时常出现类球体（MCTS）形态和生长在孔间变异的问题。因此，形成的MCTS不均一，会影响药理学实验数据的显著性和相关性。8,12,13除了可重复性问题之外，基于液滴微阵列（LOT）的高通量检测面临的另一个实际问题是使用自动液体分配装置时磁珠（MPs）会被琼脂糖包被。尽管可通过加热液体分配装置以防止琼脂糖凝胶化，但分配卡匣和管路发生堵塞仍是机器人系统潜在的隐患。6.
为了克服其中一些挑战，我们近期对用于MCTS培养的LOT方法进行了一些改进8。这些改进主要基于利用高通量筛选实验室中常见的仪器，防止微孔板（MPs）中培养基不均匀流失的可行途径。本文详细介绍了改进后的LOT方法，用于在384孔板（WPs）中生成大小均一且可重复的MCTS。此外，本文还介绍了一种半自动化的MCTS尺寸评估流程，特别适用于部分解体、经药物处理且横截面积边界不清晰的MCTS的测量。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>低熔点</td></tr><tr><td>McCOY's 5A 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8403</td><td></td></tr><tr><td>&amp;ldquo;rapid&amp;rdquo; Filtermax 滤器</td><td>TPP</td><td>99505</td><td>0.22 &amp;mu;m，500 mL</td></tr><tr><td>Multidrop&amp;trade; Combi 试剂分配仪&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>小管路分配卡盒&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24073295</td><td>金属喷嘴&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>384 孔细胞培养板&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6057308</td><td>板型 - CellCarrier</td></tr><tr><td>标准管路分配卡盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>MicroClime 环境盖</td><td>Labcyte</td><td>LLS-0310</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>旋转培养箱（SteriStore）</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>23641</td><td>序列号：D00384</td></tr><tr><td>微孔板洗板与分配系统&amp;nbsp;</td><td>BioTek</td><td>未指定</td><td>型号：EL406&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高内涵成像系统（CellVoyager）</td><td>横河电机株式会社</td><td>未指定</td><td>型号：CV7000</td></tr><tr><td>橙黄G</td><td>New England Biolabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&amp;trade; Express 重组细胞解离试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>无酚红</td></tr></tbody></table>

蒸发减少型培养条件提高微孔板中多细胞球体形成的可重复性

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

高度模拟肿瘤的模型 在体 条件在抗癌药物筛选的药物发现与开发中正变得越来越流行。多细胞肿瘤球（MCTSes）能有效模拟实体瘤的生理条件，使其成为理想的模型 体外 用于先导化合物优化和靶点验证的模型。在多种可用于多细胞球体（MCTS）培养的技术中，琼脂糖上的液体覆盖法是生成MCTS最经济的方法之一。然而，采用液体覆盖法进行高通量筛选时，MCTS培养物的可靠转移可能受到若干因素限制，包括微孔板（MPs）需包被琼脂糖，以及不同孔间MCTS形成的一致性难以重复。微孔板易受边缘效应影响，这是由于板外缘培养基过度蒸发所致，从而限制了整块板在药物测试中的应用。本文提供了液体覆盖技术的详细技术改进方案，以提高MCTS均匀形成的可扩展性和可重复性。此外，还介绍了一种简单、半自动且具有普适性的软件工具，用于药物处理后MCTS特征的评估。

在培养体积较小的微孔板（MPs）中，培养基的不均匀流失（尤其是来自边缘孔的流失）是一个常见问题。通过显著改善培养条件，例如使用温湿度控制良好的培养箱以及减少蒸发的微孔板和板盖，可降低各孔中培养基的大量流失8。为测量相对蒸发量，在每个孔中加入等体积的橙黄G（Orange G, OG），并在标准培养箱和旋转培养箱中，分别使用普通板盖和环境控制板盖的微孔板上，记录3天内OG吸光度的变化。根据孔位距离板边缘的距离，将微孔板的孔分为6组（图2A）。在标准培养箱中使用普通板盖时，第1至第4组孔的OG吸光度随时间发生显著变化（图2B）。尽管在使用环境控制板盖与旋转培养箱组合的条件下，第1组孔的OG吸光度也存在一定波动（图2C），但其变异系数（CVs）明显低于标准培养箱中使用普通板盖的微孔板（图2D）。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

微孔板中培养基的不均匀损失会影响均一多细胞肿瘤球体形成的可重复性。优化培养条件以减少显著的培养基损失，将有助于提高采用液体覆盖技术进行类球体形成实验及其相关检测结果的可重复性。

紧密模拟体内条件的肿瘤模型在药物发现与开发中日益流行，用于潜在候选药物的筛选……

本实验的主要目标是利用384孔板中的液体覆盖技术，提高均一球形细胞聚集体形成的可扩展性和可重复性。该技术的主要优势在于减少了对多块培养板进行频繁培养基操作的需要，从而提高了球形细胞聚集体形成的可重复性。我们实验室已开发并验证了用于节肢动物筛选试验的三维球形细胞聚集体培养方法，本研究旨在评估多细胞培养体系中培养板的边缘效应。今天，我将与实验室的海报作者 Sona 一起演示该实验步骤。首先称取 0.75 克低熔点琼脂糖，加入 100 毫升含或不含酚红且不含血清的 McCoy's 5a 培养基中。将溶液放入微波炉中加热，每隔 1 至 2 分钟摇动一次，以彻底溶解琼脂糖。然后将溶液进行高压灭菌以实现灭菌。待灭菌后的琼脂糖冷却至约 70 摄氏度后，在超净工作台中使用 500 毫升 0.22 微米瓶顶滤器过滤。接着，如果不会一次性使用全部溶液，需将其分装。将此即用型琼脂糖溶液在无菌条件下储存于冷室或4°C冰箱中，最多可保存四周。在超净工作台内操作，将带有塑料或金属喷嘴的试剂分配盒安装至组合式试剂分配仪上。将管路配重放入盛有70%乙醇的容器中，随后对分配盒进行预冲洗。然后，将管路配重移入盛有 PBS 的容器中，并再次进行预冲洗。接着，将保存的过滤琼脂糖溶液 aliquot 在微波炉中加热熔化。用琼脂糖溶液对分配盒进行预冲洗，然后启动程序，向 384 孔组织培养处理的微孔板中每孔加入 15 µL 过滤琼脂糖溶液进行包被。将平板中的琼脂糖冷却 15 至 20 分钟，然后按照视频下一节所述接种细胞，或将平板置于 4 摄氏度避光保存。最后，为清洗分配盒，将管路配重放入 70 至 80 摄氏度的无菌水中，并按下分配器上的引液按钮。此举可清除盒尖和管路中残留的任何琼脂糖。以下细胞接种过程应在无菌条件下于层流罩内进行。首先，从冷藏环境中取出所需数量的经琼脂糖包被的384孔组织培养处理微孔板，并将其置于室温下平衡15分钟。在此期间，通过使用70%乙醇和无菌PBS预润湿标准管路分配盒，对组合式试剂分配器进行细胞接种前的预处理准备。接下来，使用分配器上的手动设置按钮，将分配体积调整至所需的微升数，分配速度调整至中等。使用重组细胞解离酶从组织培养瓶中消化贴壁的人源结直肠癌 HCT116 细胞。在无菌烧杯中，用完全培养基将细胞制成细胞悬液原液，每 50 µL 含有密度为 2.5 × 10⁴ 个细胞/毫升的细胞。若需接种多个384孔板，请使用磁力搅拌器防止细胞沉降至烧杯底部。使用分液器将2500个细胞加入384孔板的每孔中。将板在室温下静置30分钟。同时，取一个可减少蒸发的环境培养微孔板盖，使用5毫升移液器将4毫升5%二甲基亚砜缓慢地加入盖子左侧的槽中，上下缓慢移动排液。对右侧的槽重复此操作。确保加入侧槽的液体在盖子中央不相互汇合，留出气体交换的间隙。如果加入过多液体，液体将渗入盖子外部，并随后进入384孔细胞培养板的外侧孔中。30分钟后，应在显微镜下观察细胞。静置培养板30分钟可使细胞完全沉降至孔底并相互靠近，这对于每孔形成单个球状体至关重要。将接种后的培养板在4 × g条件下离心15分钟。离心后，向384孔组织培养板的液体储液槽中加入无菌水，并将常规板盖替换为装有液体的环境控制盖。将培养板置于37°C旋转培养箱中，设置湿度为95%、CO2浓度为5%、氧气浓度为20%，培养4天以使细胞聚集成多细胞肿瘤球（multicellular tumor spheroids，MCTS）。在后续培养期间，避免长时间打开培养箱门，以防湿度骤降。在NCTS形成后的第四天，使用自动酶标板洗板机分配器向每个孔中加入30微升预热的培养基。将MCTS放回培养箱中，继续培养至实验所需的大小。每三天更换一次培养基，需根据经验调整洗板机多通道头的Z轴高度，并将分配速度以及多通道头下降进入孔板的速度设为最低，以尽量减少孔内液体的湍流。每孔吸出 30 微升培养基，加入 30 微升新鲜的预温培养基，然后将细胞放回培养箱。使用数值孔径为 16 的 4 倍空气物镜，在高内涵自动成像系统中对多细胞球体（MCTSs）进行成像。使用成像软件，将曝光时间设置为 11 毫秒，像素合并（binning）设置为四乘四。根据实验需求调整 z 轴层厚（z-stacks）的数量和间距以及像素合并方式，以在每个孔中完整捕获整个多细胞肿瘤球体（MCTS）。逐步处理二维图像，以测量 MCTS 的面积、长轴与短轴、周长及实度（solidity）。有关具体操作说明，请参见随附的 m 代码文件和文本说明文件。为评估该程序的潜在适用性，使用不同浓度的抗癌药物紫杉醇（Paclitaxel, PTX）、长春新碱（Vincristine, VCR）、奥沙利铂（Oxalyplatin, OXA）、多柔比星（Doxyrubicin, DOX）以及 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）处理培养 7 天的多细胞肿瘤球体（MCTS），每种药物设三个浓度梯度，持续给药 4 天。此处展示了 MCTS 的图像。通过分析这些图像，确定了药物处理的多细胞肿瘤球体（MCTS）与对照组（CTLs）相比的面积、长轴和短轴、周长及实心度。利用长轴和短轴计算几何体积。药物处理后，MCTS 的面积和体积均呈现浓度依赖性下降。尽管每毫升0.01微克的长春新碱、每毫升0.4微克的多柔比星以及5-氟尿嘧啶可导致MCTS面积增加，但只有在每毫升0.001微克长春新碱处理后，体积才显著增加。MCTS周长仅在紫杉醇、多柔比星和5-氟尿嘧啶的最高浓度下表现出显著差异，这些浓度完全影响了MCTS的大小。使用每毫升0.25微克紫杉醇和每毫升0.06微克长春新碱，以及每毫升100微克多柔比星和5-氟尿嘧啶处理，导致实心度显著降低，表明MCTS发生了完全或部分解体。综上所述，这些数据表明该方法在研究潜在抗癌药物方面具有实用价值。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在进行此实验时，需注意并非所有细胞系均适用于特定的三维培养方法，不同细胞系形成的类球体在形态、大小、组织学特征及生长动力学方面可能存在差异。我们开发的刺激程序能够有效评估球状体的大小，尤其适用于部分解体的药物处理球状体，这类球状体通常缺乏明确边界，难以测量其横截面积。观看本视频后，您应充分理解：此处介绍的改进方法无需任何额外设备或耗材，可常规应用于您的节肢动物筛选实验室。

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