Name: LERLIC-MS / MS进行深入表征和谷氨酰胺的定量和天冬酰胺脱酰胺在鸟枪蛋白质组学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习使用LERLIC-MS/MS技术对谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺异构体进行定量表征，该技术采用鸟枪蛋白质组学方法，通过长离子交换毛细管柱实现高效分离，为生物化学研究提供新工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分得到了新加坡教育部（第二层次：ARC9/15号基金）、新加坡国家医学研究委员会（NMRC-OF-IRG-0003-2016）、南洋理工大学-国家医疗集团老龄化研究基金（ARG/14017号基金）的资助。我们谨向Andrew Alpert博士及PolyLC团队致以诚挚的谢意，感谢他们慷慨提供本研究所用的填料材料。

1. 装填长柱长阴离子交换（LAX）毛细管柱
（注意：尽管LAX色谱柱可按照本方案所述在家中自行填装，但LAX色谱柱也可商业购买，详见材料与试剂表中的进一步说明）。
<ol>
	<li>取50 mg弱阴离子交换填料，加入3.5 mL 装柱缓冲液（表1）中，制备成浆液。</li>
	<li>使用雌-雌接头、卡套和雌螺母组装毛细管柱的一端（柱长50 cm，内径200 µm）。将一片孔径为1微米、外径1/16&#34;的筛板置于雌-雌接头内部。（注意：所用筛板的孔径必须小于填料粒径，以防止填料从柱中泄漏）。</li>
	<li>使用压力泵（压力为4,500 psi）将浆液装入毛细管柱中。（注意：持续装柱直至在柱入口处可见填料）。</li>
	<li>按照第1.2步所述方法组装毛细管柱的另一端。</li>
</ol>
2. 样品制备
本方案概述了应用 LERLIC-MS/MS 分析人脑组织作为模型蛋白质组的方法。（注意：若使用其他组织或蛋白质组样品，应相应调整样品制备步骤。）
<ol>
	<li>组织匀浆： 
	a. 用1×磷酸盐缓冲液洗涤脑组织（50至100 mg），每次5分钟，重复三次。 
	b. 在4 °C条件下，使用组织匀浆仪，在安全锁紧管中以最大强度将组织按1:1:2.5的组织/金属珠/SDC匀浆缓冲液（表2）比例（w/w/v）匀浆5分钟。（注意：SDC匀浆缓冲液可包含先前所述的蛋白酶抑制剂3） 
	c. 将上一步获得的组织匀浆液在10,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，收集上清液至新的1.5 mL离心管中。 
	d. 对剩余沉淀重复步骤b-c，并多次合并上清液，直至无可见沉淀为止。（注意：若需重复步骤b-c超过两次，应将样品和珠子转移至新的安全锁紧管中，以防止离心过程中样品损失） 
	e. 使用双辛可宁酸法（BCA）12测定所得匀浆液的蛋白浓度。</li>
	<li>十二烷基胆酸钠（SDC）辅助的溶液内胰蛋白酶消化13脑匀浆物。 
	a. 向所得匀浆液中加入终浓度为10 mM的二硫苏糖醇（DTT）（使用表3中溶液5所示的储存液），以启动蛋白质二硫键的还原。 
	b. 将匀浆液在预设为60 °C的水浴中孵育30分钟。 
	c. 使用表4中溶液7所示的储存液，向匀浆液中加入终浓度为20 mM的碘乙酰胺（IAA）。 
	d. 将含IAA的匀浆液在室温避光条件下孵育45分钟。 
	e. 使用稀释缓冲液（表3中溶液6）将脑匀浆液稀释两倍。 
	f. 将样品在37 °C条件下进行第二次还原步骤，孵育30分钟。 
	g. 按照蛋白质与酶质量比1:50（w/w）的比例，加入溶解于表2中溶液2的测序级修饰胰蛋白酶。 
	h. 在30 °C条件下过夜孵育，用胰蛋白酶消化匀浆液。 
	i. 次日加入终浓度为0.5%的甲酸（FA）终止酶解反应。（注意：FA的加入会在酸性条件下导致SDC盐沉淀） 
	j. 轻柔涡旋含有SDC沉淀的样品。 
	k. 在12,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，使SDC盐沉淀。 
	l. 收集上清液并转移至洁净的新离心管中。（注意：此步骤移液时需小心，避免重新悬浮和/或收集SDC沉淀中的盐） 
	m. 在剧烈涡旋条件下，使用SDC重溶缓冲液（表5）重新溶解SDC沉淀，持续1分钟。 
	n. 重复步骤j-l两次，以回收沉淀的肽段，并合并上清液。（注意：有关本实验所采用的SDC辅助溶液内胰蛋白酶消化方案的更多细节，请参见Serra et al. 201613）</li>
	<li>胰蛋白酶消化样品的脱盐处理。 
	a. 使用1 g C-18柱对消化后的样品进行脱盐。（注意：无论获得的蛋白量多少，使用大体积柱（5 mL）均可确保在LC-MS/MS进样前有效清除样品中残留的SDC盐） 
	b. 用5 mL乙腈（ACN）对1 g C-18柱进行预处理。 
	c. 用5 mL 清洗缓冲液（表6）通过已预处理的1 g C-18柱，以去除任何残留的有机溶剂。 
	d. 将样品加载至1 g C-18柱中。 
	e. 使用5 mL 清洗缓冲液对1 g C-18柱中的样品进行3–5次清洗步骤。 
	f. 使用5 mL 洗脱缓冲液（表7）从1 g C-18柱中洗脱脱盐后的肽段。 
	g. 在真空浓缩仪中干燥洗脱的肽段。 
	c. 将干燥的样品重新溶解于终体积为200 µL的洗脱缓冲液中。（注意：需进行剧烈且长时间（&#62; 10 min）的涡旋，随后在超声水浴中进行30分钟的超声处理，以确保干燥肽段在进样缓冲液中完全重悬） 
	d. 调整样品的进样体积，使LERLIC-MS/MS分析时蛋白上样量为1至3 µg。</li>
</ol>
3. 一维 LERLIC-MS/MS 分离
<ol>
	<li>液相色谱条件： 
	流动相： 
	A：含 0.1% 甲酸的水溶液（表 8）。 
	B：含 0.1% 甲酸的乙腈溶液（表 9） 
	流速：0.4 µL/min 
	色谱柱：LAX 毛细管柱（50 cm 长度 - 200 µm 内径） 
	a. 采用以下 1200 分钟梯度程序：95% B 保持 40 分钟，95–85% B 持续 434 分钟，85–70% B 持续 522 分钟，70–35% B 持续 124 分钟，35–3% B 持续 45 分钟，等度洗脱 3% B 5 分钟，3–95% B 梯度洗脱 7 分钟，随后在 95% B 条件下等度洗脱 23 分钟。 
	b. 采用超高压液相色谱法，按照 Serra &amp;#38; Gallart-Palau 等3 中所述方法，使用 LAX 毛细管柱进行肽段分离。</li>
	<li>质谱仪配置： 
	a. 设置扫描事件参数，以在全傅里叶变换质谱（FT-MS）与傅里叶变换串联质谱（FT-MS/MS）之间交替采集数据，具体参数如下： 
	a.1. 数据采集模式：正离子模式 
	a.2 FT-MS 参数： 
	质量范围：350 − 2,000 m/z 
	分辨率：60,000 
	微扫描次数：每谱图 1 次 
	自动增益控制：1 × 106 
	a.3 FT-MS/MS 参数： 
	碎裂模式：高能碰撞解离（HCD） 
	a.4 质量范围：150 − 2,000 m/z 
	a.5 分辨率：30,000 
	a.6 前 N 个离子：10 
	微扫描次数：每谱图 1 次 
	电荷态：&#62; 2+ 
	隔离宽度：2 Da 
	a.7 自动增益控制：1 × 106 
	b. 使用配备纳米电喷雾离子源（工作电压 1.5 kV）的轨道阱质谱仪，按照文献3 中所述方法进行肽段的质谱检测。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用特定的蛋白质组学软件，按照以下参数对 LERLIC-MS/MS 获得的数据进行蛋白质数据库搜索：（注：详见3） 
	a. 母离子容差：10 ppm 
	b. 碎片离子容差：0.05 Da 
	c. 错误发现率（FDR）：1% 
	d. 数据库：UniProt 人类数据库 
	e. 固定修饰：半胱氨酸（Cys）的羧甲基化 
	f. 可变修饰（若软件要求）：甲硫氨酸（Met）的氧化、天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）的脱酰胺。</li>
	<li>对 LERLIC-MS/MS 数据中异构脱酰胺产物的可信表征与定量： 
	a. 将 LERLIC-MS/MS 的数据库搜索结果导出至电子表格软件进行分析。 
	b. 查找并提取所有脱酰胺肽段及其未脱酰胺对应肽段的完整列表。 
	c. 以获得的肽段列表为参考，使用合适的软件在 5 ppm 质量容差下提取这些肽段的离子色谱图（XICs）。（注：有关用于提取 XICs 的软件的更多细节，详见3。） 
	d. 目视检查所获得的 XICs，识别异构产物的分离双峰洗脱信号，如文献所示3。（注：在 MS/MS 水平鉴定到的肽段的异构产物，可通过数据库搜索结果中两个不同保留时间的存在而轻松识别。） 
	e. 应根据所获得 XICs 中各鉴定出的异构体的峰面积，对每个脱酰胺位点/肽段的异构产物进行相对定量。</li>
</ol>

<ol><li>Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mass+spectrometric+analysis+of+protein+deamidation%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Geiger, T., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation%2C+isomerization%2C+and+racemization+at+asparaginyl+and+aspartyl+residues+in+peptides.+Succinimide-linked+reactions+that+contribute+to+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation.</a> J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).</li>
<li>Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Glutamine+Deamidation+by+Long-Length+Electrostatic+Repulsion-Hydrophilic+Interaction+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+%28LERLIC-MS%2FMS%29+in+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics.</a> Anal Chem. , (2016).</li>
<li>Reissner, K. J., Aswad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation+and+isoaspartate+formation+in+proteins%3A+unwanted+alterations+or+surreptitious+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals.</a> Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).</li>
<li>Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240939643_First_evidence_of_spontaneous_deamidation_of_glutamine_residue_via_cyclic_imide_to_-_and_-glutamic_residue_under_physiological_conditions">First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions.</a> JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+white+matter+pathology+and+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease+with+cerebrovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease.</a> Mol Brain. 9, 27(2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lobe+proteins+implicated+in+synaptic+failure+exhibit+differential+expression+and+deamidation+in+vascular+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia.</a> Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).</li>
<li>Robinson, N. E., Robinson, A. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11158575">Molecular clocks.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).</li>
<li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+and+characterization+of+deamidated+peptides+with+RP-ERLIC-based+multidimensional+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).</li>
<li>Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+deamidation%3A+differentiation+of+glutamic+acid+and+gamma-glutamic+acid+in+peptides+by+electron+capture+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation.</a> Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+proteome+coverage+is+increased+by+unique+peptide+recovery+from+sodium+deoxycholate+precipitate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate.</a> Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+Neurodegenerative+Protein+Modifications+via+Proteomic+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling.</a> Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).</li>
<li>Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+Fc+deamidation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Human antibody Fc deamidation in vivo.</a> Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial+processed+soy-based+food+product+contains+glycated+and+glycoxidated+lunasin+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms.</a> Sci Rep. 6, 26106(2016).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+peptidomic+strategy+to+decipher+the+molecular+diversity+of+cyclic+cysteine-rich+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides.</a> Sci Rep. 6, 23005(2016).</li>
<li>Leo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation+at+asparagine+and+glutamine+as+a+major+modification+upon+deterioration%2Faging+of+proteinaceous+binders+in+mural+paintings%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings.</a> Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).</li>
<li>Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+extent+of+bone+degradation+using+glutamine+deamidation+in+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen.</a> Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).</li>
<li>Buszewski, B., Noga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+%28HILIC%29--a+powerful+separation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique.</a> Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).</li>
<li>Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion-exchange+chromatography+of+phosphopeptides%3A+weak+anion+exchange+versus+strong+anion+exchange+and+anion-exchange+chromatography+versus+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography.</a> Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).</li>
<li>Adav, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dementia-linked+amyloidosis+is+associated+with+brain+protein+deamidation+as+revealed+by+proteomic+profiling+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues.</a> Mol Brain. 9 (1), 20(2016).</li>
<li>Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+laterally+about+neurodegenerative+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies.</a> J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+expressing+human+SOD1+successfully+recapitulates+mitochondrial+phenotypic+features+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).</li>
<li>Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+in+vitro+and+in+vivo+stability+of+a+succinimide+intermediate+observed+on+a+therapeutic+IgG1+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule.</a> mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+functional+implication+of+a+stable+succinimide+in+the+structural+stability+of+Methanocaldococcus+jannaschii+glutaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase.</a> Nat Commun. 7, 12798(2016).</li>
<li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+Repulsion+Hydrophilic+Interaction+Chromatography+for+Isocratic+Separation+of+Charged+Solutes+and+Selective+Isolation+of+Phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides.</a> Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).</li>
<li>Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+Evaluation+and+Minimization+of+Nonenzymatic+Deamidation+in+Proteomic+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111(2011).</li>
<li>Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+trypsin+digestion+buffers+on+artificial+deamidation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation.</a> J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).</li>
<li>Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mildly+acidic+conditions+eliminate+deamidation+artifact+during+proteolysis%3A+digestion+with+endoprotease+Glu-C+at+pH+4.5%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5.</a> Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本视频文章中，我们介绍了一种逐步操作的 LERLIC-MS/MS3 实验方案，该方法可用于深入表征蛋白质去酰胺化修饰的程度，并准确确定参与该蛋白质修饰的酶促过程。LERLIC-MS/MS 基于使用长柱长（50 cm）的 LAX 柱，其分离原理为静电排斥-亲水相互作用色谱法（ERLIC）27。如我们的研究所示3，采用长柱长色谱柱可最大限度地发挥 ERLIC 根据肽段等电点进行分离的潜力27。
LERLIC-MS/MS 代表了一种新型的 shotgun 一维分离策略，该工作流程在样品处理过程中可节省大量手动操作时间，尽管在高度复杂的蛋白质组上获得最佳结果需要 1,200 分钟的梯度洗脱，如文献3所述。在 LERLIC-MS/MS 中，仅需 60 分钟梯度即可首次在 shotgun 蛋白质组学中实现模型化合物上 Gln 脱酰胺异构体的最佳分离<sup...

脱酰胺是一种蛋白质翻译后修饰（PTM），通过修饰天冬酰胺（Asn）和/或谷氨酰胺（Gln）残基，在蛋白质主链上引入负电荷1。该修饰作用于Asn残基时，会以约3:1的常见比例生成异构产物异天冬氨酸（isoAsp）和n-天冬氨酸（Asp）2。然而，这一比例可因修复酶L-异天冬氨酸甲基转移酶（PIMT）的作用而发生改变3,4。类似地，Gln残基的脱酰胺反应以约1:7的比例生成异构的γ-谷氨酸（γ-Glu）和α-谷氨酸（α-Glu）3,5，但该比例可因普遍存在的转谷氨酰胺酶2及其他转谷氨酰胺酶（包括最近被发现与脑内细胞外囊泡相关的转谷氨酰胺酶1）的作用而发生偏移6。
脱酰胺的来源可以是自发的或酶促的，前者&#160;在谷氨酰胺残基上尤为常见，由转谷氨酰胺酶及其他酶介导&#160;通过转酰胺作用实现分子间/分子内交联（参见 3 有关谷氨酰胺转氨作用及其在多种慢性及致命性人类疾病中影响的更多细节）。因此，脱酰胺是一种对受影响分子的结构和功能具有重要影响的翻译后修饰4,7,8 并需要进行深入的化学表征3 鉴于其多样的生物化学效应，包括作为衰老的分子时钟9.
尽管天冬酰胺（Asn）残基的脱酰胺化已通过自下而上的鸟枪法蛋白质组学得到了相对充分的表征1,10，但谷氨酰胺（Gln）残基的脱酰胺化至今仍缺乏有效的表征方法，仅能通过基于电子诱导自由基裂解技术对模型化合物进行困难的分析来实现11。我们近期开发了一种新颖的一维鸟枪法蛋白质组学策略（LERLIC-MS/MS）3，可在单次分析中实现复杂生物样本及模型化合物中Gln与Asn脱酰胺化异构体的分离。LERLIC-MS/MS基于胰蛋白酶消化肽段在长柱长（50 cm）离子交换柱（LAX）上的分离，该柱采用静电排斥-亲水相互作用色谱（ERLIC）模式，并与串联质谱（LC-MS/MS）联用。该新型分析策略已用于表征并相对定量人脑组织中各脱酰胺化残基的程度3。然而，本文所述方案将通过视频影像展示LERLIC-MS/MS技术，旨在研究特定生化背景下蛋白质脱酰胺化的独特性质。
伦理声明
本方案的所有操作步骤均已获得新加坡南洋理工大学机构审查委员会的批准，并严格按照机构指南进行。

<table><tbody><tr><td>PolyCAT 3 &amp;micro;m 100-&amp;Aring;（散装材料）</td><td>PolyLC Inc.</td><td>特殊订购</td><td></td></tr><tr><td>长型离子交换毛细管柱，50 cm - 200 &amp;micro;m 内径</td><td>PolyLC Inc.</td><td>特殊订购</td><td></td></tr><tr><td>PEEKsil 管，1/16&quot; 外径 × 200 &amp;micro;m 内径 × 50 cm 长度</td><td>SGE Analytical Science（由澳大利亚Trajan Scientific提供）&amp;nbsp;</td><td>620050</td><td></td></tr><tr><td>用于1/16&quot; 外径管的雌-雌接头</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-125</td><td></td></tr><tr><td>微接头用雌螺母</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHP-416</td><td></td></tr><tr><td>微接头</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-132</td><td></td></tr><tr><td>压力炸弹 NanoBaume</td><td>Western Fluids Engineering</td><td>SP-400</td><td></td></tr><tr><td>岛津 Prominence UFLC 系统</td><td>Shimadzu</td><td>Prominence UFLC</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>安全锁扣管</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢珠，0.9 &amp;ndash; 2.0 mm，1磅，非无菌</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>Rotina 380 R</td><td></td></tr><tr><td>标准数字加热循环浴，120VAC</td><td>PolyScience 8006 6L</td><td>8006A11B</td><td></td></tr><tr><td>Sep-pack C18 脱盐柱，50 mg</td><td>Waters</td><td>WAT020805</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>Concentrator Plus System</td><td></td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 UHPLC&amp;nbsp;</td><td>Dionex</td><td>UltiMate 3000 UHPLC&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite 质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>ORBITRAP ELITE</td><td></td></tr><tr><td>Michrom Thermo CaptiveSpray&amp;nbsp;</td><td>Michrom-Bruker Inc.</td><td>TCSI-SS2</td><td></td></tr><tr><td>培养箱 INCUCELL&amp;nbsp;</td><td>MMM Group</td><td>INCUCELL111</td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>11836170001 (ROCHE)</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 10x（稀释至1x）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>i6125</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>色谱纯乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675415</td><td></td></tr><tr><td>色谱纯异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675431</td><td></td></tr><tr><td>色谱纯水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14263</td><td></td></tr></tbody></table>

基于lerlic-ms/ms的鸟枪法蛋白质组学中谷氨酰胺与天冬酰胺脱氨作用深度表征与定量分析

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

对蛋白质去酰胺化进行表征，对于揭示该蛋白质翻译后修饰（PTM）在人类病理学及其他生物化学背景中的作用和潜在功能至关重要。为了实现对蛋白质去酰胺化的表征，我们近期开发了一种新型的长程静电排斥-亲水相互作用色谱-串联质谱法（LERLIC-MS/MS），该方法能够从模型化合物到高度复杂的生物样本中分离谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）去酰胺化产生的异构体产物。因此，LERLIC-MS/MS是首个可用于分离和定量Gln去酰胺化异构体的 shotgun 蛋白质组学策略。我们还首次证明，本文所述的样品处理方案可稳定琥珀酰亚胺中间体，从而使其能够通过LERLIC-MS/MS进行表征。如本视频文章所示，LERLIC-MS/MS的应用有助于阐明当前尚未明确的蛋白质去酰胺化分子图谱。此外，LERLIC-MS/MS还进一步加深了对不同生物学背景下涉及去酰胺化的酶促反应的理解。

谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn）残基的脱氨作用被认为是一种与多种慢性及致命性疾病相关的变性蛋白质修饰（DPM）14。已有研究表明，这种翻译后修饰可用于预测抗体及其他分子在人体及类似生物环境中的半衰期和降解状态1,15。实际上，蛋白质脱氨的意义不仅限于生物医学领域，因此该修饰广泛存在于多种蛋白质组中16,17，一些研究还表明脱氨作用在对绘画作品和考古遗存进行精确定年方面具有潜在应用价值18,19。尽管长期以来蛋白质脱氨在不同背景下的重要性和功能已得到确认，但直到最近，针对该翻译后修饰进行深入表征的技术手段仍长期缺乏进展3。</...

本文介绍了一种长程静电排斥-亲水相互作用色谱-串联质谱法（LERLIC-MS/MS）的逐步实验方案。该方法是一种新颖的技术，首次实现了通过鸟枪法蛋白质组学对谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺异构体进行定量分析和表征。

基于LERLIC-MS/MS的鸟枪法蛋白质组学中谷氨酰胺与天冬酰胺脱氨作用深度表征与定量分析

表征蛋白质脱酰胺作用对于阐明这种蛋白质翻译后修饰（PTM）在……中的作用及潜在功能至关重要

本实验的总体目标是利用鸟枪法蛋白质组学技术，在复杂的蛋白质组中表征并定量内源性谷氨酰胺和天冬酰胺的脱酰胺产物。该方法有助于解答生物化学领域的一些关键问题，例如自发性非酶促脱酰胺过程对谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺异构体产物的影响。该技术的主要优势在于，谷氨酰胺脱酰胺异构体可在长尺寸离子交换毛细管柱上实现分离，从而最大程度地依据肽段的等电点差异进行分辨。开始柱构建时，将50毫克弱阴离子交换填料悬浮于3.5毫升含90%异丙醇的水溶液中。将一个雌对雌接头、一个微型接头（microferal）和一个雌螺母固定在一段长度为50厘米、内径为200微米的PEEK管的一端。在管末端的微型接头内部安装一个孔径为1微米的1/16英寸筛网。使用压力泵（设定为 4,500 psi）将阴离子交换材料压入毛细管中，直至材料在顶端可见。在已填充的毛细管另一端（顶端）连接另一个雌-雌接头、微螺纹接头和雌性螺母，完成色谱柱的组装。用磷酸盐缓冲盐水洗涤 50 至 100 毫克组织，持续五分钟。重复此洗涤步骤两次，然后将洗涤后的组织放入带有安全盖的离心管中。每管加入与组织重量相等的不锈钢珠，以及2.5倍体积的含1%脱氧胆酸钠的100毫摩尔/升乙酸铵水溶液。在4°C条件下，以最大强度均质化组织5分钟。然后，在 4°C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至 1.5 毫升离心管中。继续对组织沉淀进行匀浆和离心，每次合并上清液，直至观察不到沉淀为止。使用二辛可宁酸法测定合并上清液中的蛋白质浓度。接着，向匀浆液中加入1 M二硫苏糖醇的100 mM醋酸铵溶液，使样品中二硫苏糖醇的终浓度达到10 mM。将匀浆液置于60°C水浴中孵育30分钟。向匀浆中加入碘乙酰胺的1摩尔溶液（溶于100毫摩尔醋酸铵溶液），使样品中碘乙酰胺的终浓度为20毫摩尔。将匀浆在室温、避光条件下孵育45分钟。然后用两倍体积的二硫苏糖醇溶液（10毫摩尔，溶于100毫摩尔醋酸铵溶液）稀释匀浆。将匀浆在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。向匀浆中加入足量的测序级修饰胰蛋白酶（溶于 100 毫摩尔/升醋酸铵溶液），使样品中蛋白与酶的质量比达到 1:50。将样品在 30 摄氏度下孵育过夜，以消化匀浆。用相当于样品重量0.5%的甲酸终止消化反应，使脱氧胆酸钠盐沉淀。轻柔涡旋含有SDC盐的样品，随后在4°C、12,000 × g条件下离心10分钟。将上清液小心倾入新离心管中，注意不要扰动SDC盐沉淀形成的沉淀物。将盐重新溶解于体积分数为0.5%的氢氧化铵水溶液中，并剧烈涡旋振荡。用5毫升乙腈对1克C-18固相萃取柱进行活化，随后用5毫升含0.1%三氟乙酸的水溶液冲洗。然后，将消化后的样品加载至柱上。用 5 毫升 0.1% 三氟乙酸分 3 至 5 次洗涤样品。然后用 5 毫升含 75% 乙腈和 0.1% 甲酸的水溶液稀释肽段。在真空浓缩仪中将液体干燥。向残留物中加入 200 微升含 0.1% 甲酸的 75% 乙腈溶液。涡旋混合至少 10 分钟，然后超声处理至少 30 分钟，以重新溶解干燥的肽段。根据需要稀释样品，使进样样品中含有 1 至 3 微克的蛋白质。将LAX毛细管柱连接至超高压液相色谱仪。配制含0.1%甲酸的水溶液和乙腈溶液。设定流速为0.4微升/分钟，并设置1,200分钟梯度洗脱程序。设置质谱仪的扫描事件，以在完整的傅里叶变换质谱和傅里叶变换串联质谱之间交替进行数据采集。采用LERLIC MS/MS方法分离并表征肽段。利用所得数据及蛋白质组学软件进行蛋白质数据库搜索。将数据库搜索结果导出至电子表格软件。识别并提取脱氨肽及其对应的非脱氨肽列表。以五百万分之一的质量容差提取每种肽的离子色谱图。检查提取的离子色谱图中是否存在异构体产物的分离双峰假象。利用 LERLIC MS/MS，从蛋白质样品中在两个不同的保留时间分离并鉴定了谷氨酰胺和天冬酰胺的去酰胺化异构形式。鉴定出转酰胺反应中酶促修饰的中间体谷氨酰胺残基，其γ-α-谷氨酰基比例发生倒置。该方法还鉴定出了天冬酰胺残基中的琥珀酰亚胺中间体。由于温和的酸性样品处理条件能够稳定琥珀酰 亚胺中间体，这表明 LERLIC MS/MS 技术可应用于全蛋白质组范围的琥珀酰亚胺中间体研究。该技术问世后，为生物化学领域的研究人员表征蛋白质脱酰胺反应开辟了道路，其应用范围涵盖从考古学到生物医学研究等多个领域。

lerlic-msms-for-depth-characterization-quantification-glutamine

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

LERLIC-MS / MS进行深入表征和谷氨酰胺的定量和天冬酰胺脱酰胺在鸟枪蛋白质组学

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia...

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

来源：Wulf, M., 等. 基于激光显微切割的神经黑色素颗粒蛋白质组谱LC-MS/MS分析方案. J. Vis. Exp.

人脑组织中分离的神经黑色素颗粒蛋白质组学谱的LC-MS/MS分析

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi...

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

本方案介绍了如何在复杂的生物样品中使用选择反应监测技术对目标蛋白质进行绝对定量分析。该方法已用于准确量化小鼠巨噬细胞趋化信号通路中的蛋白质。文中详细描述了目标肽段的选择、检测方法的建立，以及定性和定量分析过程。...

选择性反应监测质谱法用于蛋白质绝对定量

开发了一种高通量方案，用于血浆中蛋白质组学与糖组学联合纯化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。N-连接糖基化基序的脱酰胺分析特异性针对去糖基化位点。通过将滤膜辅助的N-糖链分离与糖链肼基标签标记过程中的个体性归一化策略相结合，实现了对N-糖链的准确定量。...

一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

一种用于从人类中分离神经黑色素颗粒的可靠方案 死后黑质致密部 组织 通过...

基于激光显微切割的神经黑色素颗粒蛋白质组学谱LC-MS/MS分析方案

本文描述了一种神经元溶酶体邻近标记蛋白质组学方案，用于表征人诱导多能干细胞来源神经元中动态的溶酶体微环境。该方法可在活体人神经元中以优异的细胞内空间分辨率，准确量化溶酶体膜蛋白以及与溶酶体稳定或 transiently...

利用邻近标记蛋白质组学表征神经元溶酶体相互作用组

学习使用LERLIC-MS/MS技术对谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺异构体进行定量表征，该技术采用鸟枪蛋白质组学方法，通过长离子交换毛细管柱实现高效分离，为生物化学研究提供新工具。

基于LERLIC-MS/MS的鸟枪法蛋白质组学中谷氨酰胺与天冬酰胺脱氨作用深度表征与定量分析

探索更多视频