LERLIC-MS / MS进行深入表征和谷氨酰胺的定量和天冬酰胺脱酰胺在鸟枪蛋白质组学
April 9th, 2017
这里，我们提出的长条静电排斥亲水相互作用色谱 - 串联质谱（LERLIC-MS / MS）的方法的一个步骤一步协议。这是一种新的方法，使通过鸟枪蛋白质组学的谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺亚型的第一次定量和定性。
该程序的总体目标是使用鸟枪法蛋白质组学来表征和定量复杂蛋白质组中的内源性谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺产物。该方法可以帮助回答生物化学中的关键问题，例如自发和反处理器对谷氨酰胺等长产物 gluteo 和天冬酰胺脱氨的影响。该技术的主要优点是谷氨酰胺脱氨异构体在较长的离子变化毛细管柱上分离，从而最大限度地提高了按等值点分离肽的能力。
开始构建色谱柱时，将 50 毫克弱阴离子交换填料悬浮在 3.5 mL 90% 异丙醇的水中。将内螺纹对内螺纹接头、微螺纹接头和内螺纹螺母固定在 50 厘米长、内径为 200 微米的峰值管的一端。在微孔内安装一个 1/16 英寸的屏幕，在管子的末端有一个千分尺孔。
使用设置为 4， 500 psi 的压力泵，将阴离子交换填充到毛细管中，直到在顶部看到材料。将另一个内螺纹接头、Microferal 和内螺纹螺母连接到填充毛细管的另一端顶部，以完成色谱柱的组装。用磷酸盐缓冲盐水洗涤 50 至 100 毫克组织 5 分钟。
重复洗涤两次，然后将洗涤后的纸巾放入带安全帽的试管中。向每个试管中加入 1 重量当量的不锈钢珠子，以及 2.5 当量体积的 100 毫摩尔乙酸铵和 1% 脱氧胆酸钠水溶液。在 4 摄氏度下以最大强度匀浆组织 5 分钟。
然后，将匀浆以 10， 000 x g 和 4 摄氏度离心 10 分钟。将上清液转移至 1.5 mL 试管中。继续匀浆和离心组织沉淀，每次混合上清液，直到没有观察到沉淀。
用二辛可宁酸测定法定量组合上清液中的蛋白质浓度。接下来，向匀浆中加入 100 毫摩尔乙酸铵中的二硫苏糖醇的 1 摩尔溶液，以在样品中获得 10 毫摩尔二硫苏糖醇浓度。将匀浆在 60 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟。
向匀浆中加入 100 毫摩尔乙酰胺的 100 毫摩尔乙酸铵溶液，使样品中达到 20 毫摩尔碘乙酰胺浓度。将匀浆在室温下无光孵育 45 分钟。然后用 100 毫摩尔乙酸铵中 10 毫摩尔二硫苏糖醇溶液的两倍体积当量稀释匀浆。
将匀浆在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。向匀浆中加入足够体积的测序级改良胰蛋白酶（溶于 100 毫摩尔乙酸铵中），以达到样品中蛋白质酶重量比为 1 比 50。将样品在 30 摄氏度下孵育过夜以消化匀浆。
用 0.5% 样品重量的甲酸淬灭消化，沉淀脱氧胆酸盐。轻轻涡旋含有 SDC 盐的样品，然后在 12， 000 x g 和 4 摄氏度下离心样品 10 分钟。将上清液倒入新试管中，注意不要干扰 SDC 盐沉淀。
将盐重溶于 0.5% 体积的氢氧化铵水溶液中，剧烈涡旋。用 5 毫升乙腈固定 1 克 C-18 吸附剂小柱，然后加入 5 毫升 0.1% 三氟乙酸的水溶液。然后，将消解的样品加载到柱上。
用 5 毫升 0.1% TFA 洗涤样品 3 到 5 次。然后用 5 毫升 75% 乙腈和 0.1% 甲酸的水溶液稀释肽。在真空浓缩器中干燥液体。
向残留物中加入 200 微升 75% 乙腈和 0.1% 甲酸。涡旋混合物至少 10 分钟，然后对混合物进行超声处理至少 30 分钟，以重新配制干燥肽。根据需要稀释样品，使注射的样品含有 1 至 3 μg 蛋白质。
将 LAX 毛细管柱连接到超高压液相色谱仪。在水和乙腈中制备 0.1% 甲酸溶液。将流速设置为 0.4 μL/min，并设置 1， 200 分钟的梯度运行。
将质谱仪扫描事件配置为在全傅里叶变换质谱和傅里叶变换串联质谱之间交替采集数据。执行 LERLIC MS/MS 以分离和表征肽。使用所得数据和蛋白质组学软件进行蛋白质数据库搜索。
将数据库搜索结果导出到电子表格软件。识别并提取脱酰胺肽和相应的非脱酰胺肽列表。提取这些肽的离子色谱图，质量容差为百万分之五。
检查提取的离子色谱图中异构体产物是否存在分离的双峰错觉。使用 LERLIC MS/MS，在两个不同的保留时间从蛋白质样品中分离和鉴定谷氨酰胺和天冬酰胺的脱酰胺亚型。鉴定出酶促修饰的转酰胺中间谷氨酰胺残基，显示倒置的 γ α 谷氨酰胺比率。
该方法还鉴定了天冬酰胺残基中的琥珀酰亚胺中间体。由于弱酸性样品的处理条件使琥珀酰亚胺中间体稳定。这表明 LERLIC MS/MS 技术可应用于琥珀酰亚胺中间体的蛋白质组范围研究。
开发后，这项技术为生物化学研究人员在从考古学到生物医学研究的背景下表征蛋白质脱酰胺铺平了道路。
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概述
本文介绍了一种名为长程静电排斥-亲水相互作用层析-串联质谱（LERLIC-MS/MS）的新方法。该方法允许使用shotgun蛋白质组学技术来定量和表征谷氨酰胺和天冬酰胺去氨基化异构体。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 蛋白质组学
- 质谱分析
背景
- 内源性谷氨酰胺和天冬酰胺去氨基化产物在各种生物化学过程中很重要。
- 表征这些产物可以提供关于它们在复杂蛋白质组中作用的见解。
- 传统方法可能无法有效地分离脱氨基异构体。
- Shotgun蛋白质组学是一种分析复杂混合物的强大技术。
研究目的
- 开发一种定量和表征去氨基化异构体的方法。
- 提高谷氨酰胺脱氨基异构体的分离。
- 解决生物化学中关于去氨基化过程的关键问题。
使用的方法
- 构建长程离子变化毛细管柱。
- 在异丙醇和水中悬浮弱阴离子交换填料。
- 使用shotgun蛋白质组学进行分析。
- 基于等电点分离肽段。
主要结果
- LERLIC-MS/MS方法成功地定量了去氨基化异构体。
- 实现了谷氨酰胺和天冬酰胺脱氨基产物的改进分离。
- 该方法为涉及这些氨基酸的生物化学过程提供了新的见解。
- 识别了在理解复杂蛋白质组中的潜在应用。
结论
- LERLIC-MS/MS是研究去氨基化异构体的有价值工具。
- 该方法增强了对谷氨酰胺和天冬酰胺在生物化学中作用的理解。
- 未来的研究可以在这一方法的基础上探索其他生物化学问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
Characterizing glutamine and asparagine deamidation is critical for understanding protein stability and function in disease contexts, yet current methods lack the resolution to separate and quantify these isoforms in complex proteomes. The LERLIC-MS/MS method addresses this gap by enabling isoform-specific detection, supporting mechanistic de-risking in target validation and improving predictive confidence in preclinical models. This capability enhances translational continuity by linking molecular PTM patterns to functional outcomes across discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glutamine and asparagine deamidation as potential regulators of protein function in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides isoform-resolved data that clarifies whether observed PTMs are enzymatically driven or spontaneous, reducing mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing functional deamidation events from background noise in complex biological samples.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, retention-time-resolved readouts for deamidated peptides, enabling reliable detection in screening campaigns.
- Operational Value: Delivers reproducible separation of isobaric isoforms, improving assay precision and reducing false positives in PTM-focused screens.
- Scalability: Compatible with shotgun proteomics workflows, allowing application to complex biological matrices without prior enrichment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Biomarker Alignment: Facilitates identification of deamidation patterns that correlate with disease states or therapeutic response in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Stabilizes and detects the succinimide intermediate, enabling direct observation of deamidation reaction pathways for kinetic and mechanistic studies.
- Preclinical Model Relevance: Supports disease-relevant systems by characterizing PTM landscapes in tissues or cells under pathophysiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The LERLIC-MS/MS method fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, particularly where PTM heterogeneity impacts target function or biomarker reliability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining whether specific glutamine or asparagine sites undergo deamidation in disease vs. control conditions.
- Screening: Enables assay-ready detection of deamidation isoforms with chromatographic separation, improving selectivity in complex lysates.
- Analytics: Provides extracted ion chromatograms and retention time shifts that allow quantitative comparison of deamidation levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects PTM detection to functional outcomes by linking deamidation events to changes in protein activity or stability in disease models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable proteomics platform applicable across multiple targets, disease areas, and sample types without reformulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in PTM analysis by resolving isobaric glutamine and asparagine deamidation products that conventional methods cannot distinguish.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized column chemistry and sample processing that stabilizes labile intermediates like succinimide.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic insight into PTM-driven target instability or loss of function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on deamidation susceptibility and functional consequence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics sample preparation, chromatographic method development, and mass spectrometry data interpretation.
- Dependent on ultra-high pressure liquid chromatography and high-resolution mass spectrometry instrumentation capable of long-gradient separations.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling to prevent artifactual deamidation during preparation.
- Adaptation to different model systems may require optimization of lysis and digestion conditions to preserve endogenous PTM states.
- Practical limitations include longer run times (up to 1,200 minutes) and the need for specialized column packing expertise, which may affect throughput in high-volume settings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Long-length Anion-exchange (LAX) Capillary Column Packing
1:43
Tissue Sample Preparation
5:33
One-dimension Long-length Electrostatic Repulsion-hydrophilic Interaction Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) Separation and Data Analysis
6:48
Results: Separation of Deamidation Isoforms of Glutamine and Asparagine by LERLIC-MS/MS
7:34
Conclusion
