LERLIC-MS / MS进行深入表征和谷氨酰胺的定量和天冬酰胺脱酰胺在鸟枪蛋白质组学

该程序的总体目标是使用鸟枪法蛋白质组学来表征和定量复杂蛋白质组中的内源性谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺产物。该方法可以帮助回答生物化学中的关键问题，例如自发和反处理器对谷氨酰胺等长产物 gluteo 和天冬酰胺脱氨的影响。该技术的主要优点是谷氨酰胺脱氨异构体在较长的离子变化毛细管柱上分离，从而最大限度地提高了按等值点分离肽的能力。

开始构建色谱柱时，将 50 毫克弱阴离子交换填料悬浮在 3.5 mL 90% 异丙醇的水中。将内螺纹对内螺纹接头、微螺纹接头和内螺纹螺母固定在 50 厘米长、内径为 200 微米的峰值管的一端。在微孔内安装一个 1/16 英寸的屏幕，在管子的末端有一个千分尺孔。

使用设置为 4， 500 psi 的压力泵，将阴离子交换填充到毛细管中，直到在顶部看到材料。将另一个内螺纹接头、Microferal 和内螺纹螺母连接到填充毛细管的另一端顶部，以完成色谱柱的组装。用磷酸盐缓冲盐水洗涤 50 至 100 毫克组织 5 分钟。

重复洗涤两次，然后将洗涤后的纸巾放入带安全帽的试管中。向每个试管中加入 1 重量当量的不锈钢珠子，以及 2.5 当量体积的 100 毫摩尔乙酸铵和 1% 脱氧胆酸钠水溶液。在 4 摄氏度下以最大强度匀浆组织 5 分钟。

然后，将匀浆以 10， 000 x g 和 4 摄氏度离心 10 分钟。将上清液转移至 1.5 mL 试管中。继续匀浆和离心组织沉淀，每次混合上清液，直到没有观察到沉淀。

用二辛可宁酸测定法定量组合上清液中的蛋白质浓度。接下来，向匀浆中加入 100 毫摩尔乙酸铵中的二硫苏糖醇的 1 摩尔溶液，以在样品中获得 10 毫摩尔二硫苏糖醇浓度。将匀浆在 60 摄氏度的水浴中孵育 30 分钟。

向匀浆中加入 100 毫摩尔乙酰胺的 100 毫摩尔乙酸铵溶液，使样品中达到 20 毫摩尔碘乙酰胺浓度。将匀浆在室温下无光孵育 45 分钟。然后用 100 毫摩尔乙酸铵中 10 毫摩尔二硫苏糖醇溶液的两倍体积当量稀释匀浆。

将匀浆在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。向匀浆中加入足够体积的测序级改良胰蛋白酶（溶于 100 毫摩尔乙酸铵中），以达到样品中蛋白质酶重量比为 1 比 50。将样品在 30 摄氏度下孵育过夜以消化匀浆。

用 0.5% 样品重量的甲酸淬灭消化，沉淀脱氧胆酸盐。轻轻涡旋含有 SDC 盐的样品，然后在 12， 000 x g 和 4 摄氏度下离心样品 10 分钟。将上清液倒入新试管中，注意不要干扰 SDC 盐沉淀。

盐重溶于 0.5% 体积的氢氧化铵水溶液中，剧烈涡旋。用 5 毫升乙腈固定 1 克 C-18 吸附剂小柱，然后加入 5 毫升 0.1% 三氟乙酸的水溶液。然后，将消解的样品加载到柱上。

用 5 毫升 0.1% TFA 洗涤样品 3 到 5 次。然后用 5 毫升 75% 乙腈和 0.1% 甲酸的水溶液稀释肽。在真空浓缩器中干燥液体。

向残留物中加入 200 微升 75% 乙腈和 0.1% 甲酸。涡旋混合物至少 10 分钟，然后对混合物进行超声处理至少 30 分钟，以重新配制干燥肽。根据需要稀释样品，使注射的样品含有 1 至 3 μg 蛋白质。

将 LAX 毛细管柱连接到超高压液相色谱仪。在水和乙腈中制备 0.1% 甲酸溶液。将流速设置为 0.4 μL/min，并设置 1， 200 分钟的梯度运行。

将质谱仪扫描事件配置为在全傅里叶变换质谱和傅里叶变换串联质谱之间交替采集数据。执行 LERLIC MS/MS 以分离和表征肽。使用所得数据和蛋白质组学软件进行蛋白质数据库搜索。

将数据库搜索结果导出到电子表格软件。识别并提取脱酰胺肽和相应的非脱酰胺肽列表。提取这些肽的离子色谱图，质量容差为百万分之五。

检查提取的离子色谱图中异构体产物是否存在分离的双峰错觉。使用 LERLIC MS/MS，在两个不同的保留时间从蛋白质样品中分离和鉴定谷氨酰胺和天冬酰胺的脱酰胺亚型。鉴定出酶促修饰的转酰胺中间谷氨酰胺残基，显示倒置的 γ α 谷氨酰胺比率。

该方法还鉴定了天冬酰胺残基中的琥珀酰亚胺中间体。由于弱酸性样品的处理条件使琥珀酰亚胺中间体稳定。这表明 LERLIC MS/MS 技术可应用于琥珀酰亚胺中间体的蛋白质组范围研究。

开发后，这项技术为生物化学研究人员在从考古学到生物医学研究的背景下表征蛋白质脱酰胺铺平了道路。