基于LERLIC-MS/MS的鸟枪法蛋白质组学中谷氨酰胺与天冬酰胺脱氨作用深度表征与定量分析

本实验的总体目标是利用鸟枪法蛋白质组学技术，在复杂的蛋白质组中对内源性谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺产物进行表征和定量。该方法有助于回答生物化学领域的一些关键问题，例如自发性及非酶促过程对谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺所生成的异构产物的影响。该技术的主要优势在于，谷氨酰胺脱酰胺异构体可在长尺寸离子交换毛细管柱上实现分离，从而最大程度地依据肽段的等电点差异进行分辨。

开始柱子构建时，将50毫克弱阴离子交换填料悬浮于3.5毫升含90%异丙醇的水溶液中。将一个雌-雌接头、一个MicroFerral接头和一个雌螺母固定在一段长度为50厘米、内径为200微米的PEEK管的一端。在MicroFerral接头内的管端安装一个孔径为1微米的1/16英寸筛板。

使用压力泵（设定为 4,500 psi）将阴离子交换材料压入毛细管中，直至在毛细管顶端可见填充材料。在已填充的毛细管另一端顶端连接另一个雌-雌接头、微转接头和雌性螺母，以完成色谱柱的组装。用磷酸盐缓冲液洗涤 50 至 100 毫克组织，持续 5 分钟。

重复此洗涤步骤两次，然后将洗涤后的组织放入带有安全盖的离心管中。每管加入与组织重量相等的不锈钢珠，以及2.5倍体积的含1%脱氧胆酸钠的100毫摩尔/升乙酸铵水溶液。在4°C条件下，以最大强度均质化组织5分钟。

然后，在 4°C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至 1.5 毫升离心管中。继续对组织沉淀进行匀浆和离心，每次合并上清液，直至观察不到沉淀为止。

使用二辛可宁酸法测定合并上清液中的蛋白质浓度。接着，向匀浆液中加入1 M二硫苏糖醇的100 mM醋酸铵溶液，使样品中二硫苏糖醇的终浓度达到10 mM。将匀浆液置于60°C水浴中孵育30分钟。

向匀浆中加入碘乙酰胺的1摩尔溶液（溶于100毫摩尔醋酸铵溶液），使样品中碘乙酰胺终浓度达到20毫摩尔。将匀浆于室温避光孵育45分钟。然后用两倍体积的二硫苏糖醇（10毫摩尔）溶液（溶于100毫摩尔醋酸铵溶液）稀释匀浆。

将匀浆在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。向匀浆中加入足量测序级修饰胰蛋白酶，溶于 100 毫摩尔每升醋酸铵溶液中，使样品中蛋白与酶的质量比达到 1:50。将样品在 30 摄氏度下孵育过夜，以消化匀浆。

加入相当于样品重量0.5%的甲酸终止消化反应，使脱氧胆酸钠盐沉淀。轻轻涡旋含有SDC盐的样品，然后在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟。将上清液倾入新离心管中，注意不要扰动SDC盐沉淀。

将盐重新溶解于体积分数为0.5%的氢氧化铵水溶液中，并剧烈涡旋。用5毫升乙腈对1克C-18固相萃取柱进行预处理，随后用5毫升含0.1%三氟乙酸的水溶液冲洗。然后，将消化后的样品加载到萃取柱上。

用 5 毫升 0.1% 三氟乙酸（TFA）溶液将样品洗涤三至五次。然后用 5 毫升含 75% 乙腈和 0.1% 甲酸的水溶液稀释肽段。在真空浓缩仪中将液体干燥。

向残留物中加入200微升含0.1%甲酸的75%乙腈溶液。涡旋混合至少10分钟，然后超声处理至少30分钟，以重新溶解干燥的肽段。根据需要稀释样品，使上样样品中含有1至3微克蛋白质。

将LAX毛细管柱连接至超高压液相色谱仪。配制含有0.1%甲酸的水溶液和乙腈溶液。设置流速为0.4微升/分钟，并建立1,200分钟的梯度洗脱程序。

设置质谱仪的扫描事件，以在完整的傅里叶变换质谱和傅里叶变换串联质谱之间交替进行数据采集。采用LERLIC MS/MS方法分离并表征肽段。利用所得数据及蛋白质组学软件进行蛋白质数据库搜索。

将数据库搜索结果导出至电子表格软件。识别并提取脱酰胺肽及其对应的非脱酰胺肽列表。以五百万分之一的质量容差提取每种肽的离子色谱图。

检查提取的离子色谱图，以识别异构体产物的分离双峰假象。利用LERLIC串联质谱技术，从蛋白质样品中在两个不同的保留时间分离并鉴定了谷氨酰胺和天冬酰胺的去酰胺化异构体。鉴定出转酰胺作用中酶促修饰的中间体谷氨酰胺残基，其γ-α-谷氨酰基比例发生倒置。

该方法还鉴定出了天冬酰胺残基中的琥珀酰亚胺中间体。由于温和的酸性样品处理条件能够稳定琥珀酰亚胺中间体，这表明 LERLIC MS/MS 技术可应用于全蛋白质组范围的琥珀酰亚胺中间体研究。

该技术问世后，为生物化学领域的研究人员表征蛋白质脱酰胺反应开辟了道路，其应用范围涵盖从考古学到生物医学研究等多个领域。