Name: 定量蛋白质组学使用还原二甲基化的稳定同位素标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学习使用还原二甲基化（ReDi）标记和质谱技术进行定量蛋白质组学分析。该方法快速、经济且适用于多种样本类型，可准确比较复杂样本中蛋白质的相对丰度差异。

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感谢 SP Gygi 和 GM Church 提供的帮助与指导。本工作得到了法国国家科学研究中心（CNRS）卓越讲席对 ACT 的资助。

注意：此方法先前已有描述12。
1. 蛋白质分离
通过裂解细胞制备1 mg的细胞蛋白，优先采用物理方法，如法式压榨、珠磨或超声处理。避免使用溶菌酶介导的细胞裂解，因为该酶会干扰质谱测量。
2. 蛋白质的三氯乙酸沉淀
向4体积的蛋白质样品中加入1体积三氯乙酸（TCA），冰上孵育10分钟&#160;以沉淀蛋白质。在4 °C下以12,000 × g离心5分钟，弃去上清液。用1 ml预冷的丙酮重悬沉淀物，在4 °C下以12,000 × g再次离心5分钟。弃去上清液，将离心管倒置在实验台上干燥沉淀物15分钟。将蛋白质沉淀物于-80 °C保存。
3. 变性蛋白质并还原二硫键
用 500 μl 变性与还原缓冲液（含 4 M 尿素或含 3% SDS 的 50 mM HEPES pH 8.5 缓冲液）将蛋白质重悬至浓度约为 2 mg/ml。可选择在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。56 °C 孵育 30 分钟，随后在室温孵育 10 分钟。
4. 烷基化游离巯基以不可逆地破坏二硫键形成
配制新鲜的0.3 M碘乙酰胺水溶液。注意！碘乙酰胺具有高毒性。向500 μl蛋白质样品中加入25 μl 0.3 M碘乙酰胺（终浓度为15 mM），室温避光孵育20分钟。加入10 μl 300 mM DTT（终浓度为5 mM DTT）以淬灭碘乙酰胺反应。将烷基化后的蛋白质于-80 °C保存。
5. 蛋白质消化
用TCA沉淀蛋白质（如步骤2所述），并在1 ml含50 mM HEPES（pH 8.2）和1 M尿素的溶液中重悬。将赖氨酰内肽酶（Lys-C）溶于水，配制成2 µg/µl的储存液，取5 µl加入蛋白质溶液中。室温孵育16小时。确保最终Lys-C浓度为10 ng/µl，蛋白质与Lys-C的质量比（w/w）为1/50至1/200。将20 μg测序级胰蛋白酶溶于40 μl 50 mM乙酸中，取5 µl（含10 µg胰蛋白酶）加入Lys-C消化液中，37 °C孵育6小时。Lys-C的蛋白酶浓度及蛋白酶与蛋白质的比例应与胰蛋白酶所用条件相同。
6. 反相肽段提取
<ol>
	<li>通过加入三氟乙酸（TFA）将肽段酸化至终浓度为0.5%（pH≈2）。将C18柱连接至萃取装置。除肽段上样和洗脱步骤外，其余所有步骤均使用尽可能高的流速。</li>
	<li>用6 ml乙腈（ACN）润湿柱子。用6 ml含80% ACN和0.1% TFA的溶液洗涤柱子，然后用6 ml含0.1% TFA的溶液平衡柱子。各步骤之间不得让柱子完全干燥。</li>
	<li>停止真空压力，以约1 ml/min的流速将500 μg肽段上样至柱子。待肽段完全结合后，重新开启真空，用6 ml含0.1% TFA的溶液洗涤柱子，随后用3 ml柠檬酸缓冲液（0.09 M柠檬酸，0.23 M Na2HPO4，pH 5.5）洗涤。 
	注意：可标记更高量的肽段，但C18柱的结合容量应至少为肽段量的两倍，以避免样品损失。</li>
</ol>
7. 通过还原性二甲基化进行柱上肽段标记（ReDi 标记）
由于标记过程中会释放低浓度的氰化氢，因此该步骤必须在化学通风橱中进行。
<ol>
	<li>准备 12 ml 的“轻”和“重”ReDi 缓冲液，用于甲基化肽段中的游离胺基。轻链 ReDi 缓冲液含有 0.8% 甲醛和 0.12 M 氰基硼氢化钠，其中氢原子为天然同位素分布，溶于柠檬酸缓冲液中。重链 ReDi 缓冲液含有 0.8% 氘代甲醛和 0.12 M 氘代氰基硼氢化钠，溶于柠檬酸缓冲液中。</li>
	<li>向含有肽段的柱子中加入 10 ml 轻链或重链 ReDi 缓冲液，以 1 ml/min 的流速孵育柱子，并重复操作以确保完全标记。用 6 ml 0.1% TFA 洗脱柱子，然后用 1 ml 0.5%&#160;乙酸冲洗。</li>
	<li>停止抽真空，首先用 1 ml 40% ACN、0.5% 乙酸以约 0.5 ml/min 的流速洗脱标记的肽段，然后用 1 ml 80% ACN、0.5% 乙酸继续洗脱。如需要，可在混合重链和轻链样品前通过质谱法测定各单一样品的标记效率（参见“代表性结果”）。将待通过质谱定量的重链和轻链标记肽段样品等体积混合。</li>
</ol>
8. 通过碱性 pH 反相色谱法分离肽混合物
采用碱性pH反相（BPRP）色谱法将肽段混合物分离为多个组分，随后通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对各组分进行独立分析，以提高蛋白质组覆盖度。
<ol>
	<li>使用C18-HPLC色谱柱对肽段混合物进行分级分离，流动相为10 mM碳酸氢铵（pH 8）中乙腈（ACN）浓度递增的梯度洗脱。起始条件为5%（v/v）ACN，维持5分钟，随后在60分钟内将ACN浓度升至35%，再用1分钟升至90%。保持90% ACN 4分钟，然后将ACN浓度降至5%，重新平衡色谱柱9分钟。在96孔板（A1至H12）中收集等体积的96个组分。在肽段洗脱过程中（本实验条件下为10–70分钟），使用220 nm紫外检测器监测分离情况。</li>
	<li>将A1、C1、E1和G1孔的组分合并为A1组分，B1、D1、F1和H1孔的组分合并为B1组分，A2、C2、E2和G2孔的组分合并为A2组分，其余组分依此类推进行合并。使用真空离心浓缩仪去除溶剂。将A1、B2、A3、B4、A5、B6、A7、B8、A9、B10、A11和B12组分的肽段重悬于130 µl含1 M尿素/0.5%三氟乙酸（TFA）的溶液中，并按步骤9所述使用StageTips进行纯化。将B1、A2、B3、A4、B5、A6、B7、A8、B9、A10、B11和A12组分在-20 ºC下保存。</li>
</ol>
9. 使用停止与转移提取法（StageTips）纯化肽段
通过将两个内径（ID）为1.07 mm的C18圆盘装入200 μl移液器吸头中，制备C18-StageTip7 微柱。将StageTip插入Eppendorf管中。使用微量离心机用130 μl甲醇洗涤吸头，然后用130 μl含80%乙腈（ACN）和0.5%乙酸的溶液洗涤。用130 μl含0.1%三氟乙酸（TFA）的溶液平衡StageTip。将肽混合物转移至StageTip中，并依次用130 μl含0.1% TFA的溶液、40 μl含0.1% TFA的溶液和40 μl含0.5%乙酸的溶液洗涤。首先用20 μl含40%乙腈（ACN）和0.5%乙酸的溶液洗脱肽，然后用20 μl含80%乙腈（ACN）和0.5%乙酸的溶液洗脱。合并洗脱液并通过真空过滤干燥。
10. 微毛细管液相色谱-质谱联用
<ol>
	<li>将肽溶解于 1–5 μl 含 5% 甲酸和 5% 乙腈（ACN）的溶液中，使其浓度约为 1 μg/μl。使用 100 μm × 20 cm 的 C18 反相高效液相色谱柱，在 0.125% 甲酸溶液中以 6–22% 乙腈梯度洗脱，流速约为 300 nl/min，运行时间 75 或 100 分钟，分离约 1 μg 的肽样品。</li>
	<li>采用 LTQ Orbitrap Velos12 或类似的液相色谱-质谱联用平台进行肽段鉴定，质谱仪需具备高分辨率和高质量精度。将质谱仪设置为数据依赖模式，通过 Orbitrap 分析器采集全扫描质谱图（分辨率为 60,000）。对全扫描质谱图中检测到的丰度最高的 20 个离子生成线性离子阱 MS/MS 谱图。设定自动增益控制（AGC）目标值：全扫描 MS 为 1 ×&#160;106，MS/MS 为 2,000。设定最大离子积累时间：MS 为 1,000 毫秒，MS/MS 为 150 毫秒。对已碎裂的肽前体离子设置 20–60 秒的动态排除，防止其再次被选中进行 MS/MS 分析。</li>
</ol>
11. 串联质谱数据采集
通过使用SEQUEST8等算法，将MS/MS谱图的RAW文件与理论数据库进行比对，以鉴定肽段（参数见表1）。
表1. 肽段数据库搜索参数。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180">通用参数</td>
			<td>完全胰蛋白酶消化，最多允许2个漏切位点</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td>前体离子容差为25 ppm</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td>碎片离子容差为1.0 Da</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:36px;">固定修饰</td>
			<td>半胱氨酸上+57.02146 Da，羧甲基化</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td>赖氨酸及肽段N端+28.03130 Da，轻型二甲基化标记</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" rowspan="2" style="height:19px;">动态修饰</td>
			<td>甲硫氨酸上+15.99491 Da，氧化</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td>赖氨酸及肽段N端+6.03766 Da，重型二甲基化标记</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol>
	<li>使用目标-诱饵9策略等方法，基于实际和反向开放阅读框数据库，将肽段筛选至1%的错误发现率。</li>
</ol>
12. 肽段定量
计算重链和轻链MS1提取离子色谱图（MS1峰面积）的峰面积以及肽段的信噪比（S/N）10。仅当肽段对的平均信噪比大于5时，才将其纳入分析。将同一肽段重链与轻链形式的MS1峰面积之比（MS1峰面积比）作为该肽段在两个样品中相对丰度的量化指标。蛋白质的相对丰度则通过其所有肽段的MS1峰面积比的中位数来计算。

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

多个因素使得利用还原性二甲基化（ReDi标记）对肽段进行稳定同位素标记成为定量蛋白质组学中一种极具吸引力的方法：标记试剂价格低廉（每样本试剂成本低于1美元）、反应速度快（约10分钟）、无副产物生成、重现性高（图示&#160;3, 4），稳定的反应产物，可使用任意蛋白酶，以及标记肽段的高离子化效率。与代谢标记相比，ReDi的化学标记具有优势，因其无需具有特定氨基酸营养缺陷型的菌株或细胞系，也无需在合成培养基中培养。因此，ReDi可应用于几乎所有类型的蛋白质样品，包括新型微生物12 可用于研究的突变菌株较少13 和人类干细胞14以及其他15.
ReDi标记的一个局限性是其多重样本检测能力相较于同重标记等其他方法较低例如，iTRAQ 或 TMT），目前可同时对最多 8 个样品进行定量16该方法可实现对两种不同标记样品的定量比较。通过使用其他同位素组合的甲醛和氰基硼氢化钠，可生成最多3种标记物，其质量差异至少为4 Da。...

在蛋白质组学中，测量复杂样品间多种蛋白质的浓度差异是一个核心挑战。目前，这一目标正越来越多地通过使用不同的同位素标签对各样品中的蛋白质进行标记，然后将样品混合，并利用质谱技术来定量分析浓度差异。目前已有多种用于蛋白质和肽段稳定同位素标记的方法。15N标记1和SILAC2是在活体（in vivo）条件下通过代谢方式引入同位素标签，而iCAT3、iTRAQ4和还原性二甲基化标记5则是在蛋白质提取和消化后添加稳定同位素标签。在这些方法中，还原性二甲基化（ReDi标记）因其成本低廉、可重复性好，正逐渐成为在几乎所有类型样品中定量蛋白质浓度差异的常用方法。
ReDi 标记技术涉及将肽与甲醛反应生成席夫碱，随后由氰基硼氢化物还原。该反应可使肽的N端和赖氨酸侧链上的游离氨基发生二甲基化，并使N端为脯氨酸的肽发生单甲基化。本文所述方案使用天然同位素分布的氢原子试剂对样本1进行“轻”标记，使用氘代甲醛和氘代氰基硼氢化物对样本2进行“重”标记（图&#160;1）。肽上每一个二甲基化的氨基在轻标与重标形式之间产生6.0377 Da的质量差异，利用质谱仪可区分这两种形式。具体而言，每对肽离子的相对丰度通过其MS1提取离子色谱峰面积之比（MS1峰面积比）来定量。蛋白质的相对丰度则通过该蛋白质所有肽段的MS1峰面积比的中位数计算得出。本报告中，我们描述了一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的稳定可靠的ReDi标记实验流程，包括反相肽段固相萃取、柱上ReDi标记、碱性pH反相（BPRP）色谱进行肽段分级以及使用StageTips纯化肽段混合物（图&#160;2）。我们还讨论了ReDi标记技术在定量蛋白质组学应用中的优势与局限性。

<table><tbody><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>蛋白质沉淀</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>蛋白质沉淀</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>变性、还原蛋白质</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>变性、还原蛋白质</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>变性、还原、烷基化蛋白质</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂完全迷你混合液</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>变性、还原蛋白质</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>烷基化蛋白质</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>重悬、提取、标记蛋白质</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>重悬蛋白质</td></tr><tr><td>赖氨酰内肽酶</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>蛋白质消化</td></tr><tr><td>测序级胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>蛋白质消化</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>蛋白质消化</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>反相肽提取</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 小柱</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td>反相肽提取</td></tr><tr><td>提取装置</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td>反相肽提取</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>多种用途</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>&amp;ldquo;轻标&amp;rdquo;肽标记</td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>&amp;ldquo;轻标&amp;rdquo;肽标记</td></tr><tr><td>氘代甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>&amp;ldquo;重标&amp;rdquo;肽标记</td></tr><tr><td>氰基硼氘化钠</td><td>CDN isotopes</td><td>D-1797</td><td>&amp;ldquo;重标&amp;rdquo;肽标记</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>肽标记</td></tr><tr><td>C18-HPLC 色谱柱（4.6 × 250 mm，5 &amp;micro;m 粒径）</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>碱性 pH 反相色谱</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>多种用途</td></tr><tr><td>C18 Empore 圆盘</td><td>3M</td><td>14-386-3&amp;nbsp;</td><td>STAGE 小尖</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>STAGE 小尖</td></tr></tbody></table>

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种利用质谱技术精确量化样本间蛋白质表达差异的方法。ReDi 标记使用普通（轻）或氘代（重）的甲醛和氰基硼氢化钠，将两个甲基基团添加至每个游离胺基上。本文展示了一种可靠的 ReDi 标记实验流程，用于复杂蛋白质混合物的定量比较。待比较的蛋白质样品经酶解生成肽段后，分别标记轻或重甲基标签，混合后共同进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。通过比较来自全扫描质谱数据中各肽段的重标与轻标形式的离子色谱峰面积，实现对相对蛋白质丰度的定量。本文所述方法包括采用反相固相萃取进行样品制备、柱上肽段 ReDi 标记、基于碱性 pH 反相（BPRP）色谱的肽段分级以及 StageTip 肽段纯化。我们讨论了 ReDi 标记与其他稳定同位素掺入方法相比的优势与局限性，并强调了 ReDi 标记作为一种快速、经济且准确的方法，在几乎任何类型样品中比较蛋白质丰度的新型应用。

我们使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物发酵梭菌（Clostridium phytofermentans）的全细胞裂解液评估了ReDi标记的准确性、精确性和可重复性。我们首先量化了来自纤维素（重标记，H）和葡萄糖（轻标记，L）培养物的C. phytofermentans蛋白裂解液混合物的ReDi标记效率。在肽段假发现率过滤至1%时，该样品包含11,194条独特肽段序列，ReDi标记效率达98%。同样地，将酿酒酵母（S. cerevisiae）未分级蛋白裂解液用H或L试剂标记后，以不同比例混合并进行分析。蛋白质表达差异（log2 （MS1中位峰面积））在广泛的混合比例范围内可重复地反映了H与L样品的混合比例（图3）。具体而言，在1:1混合样品中，99%蛋白质的倍数变化被测定为小于1.6倍。在1:10和10:1的样品中，99%的蛋白质测量值在预期比例的3.8倍范围内，表明随着与1:1混合比例的差距增大，标准偏差有所增加。当ReDi标记应用于植物发酵梭菌（Clostridiu...

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi 方法制备和分析蛋白质混合物的可靠方案，该方法可适用于几乎任何类型的样品。

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi标记）是一种用于精确定量不同样本间蛋白质表达差异的方法。

本实验的总体目标是利用现成的蛋白质组学方法，通过质谱技术比较不同样品间多种蛋白质的浓度。该目标首先通过将每个样品中的蛋白质进行消化，从而生成肽段混合物来实现。随后，将两个样品混合，并对混合样品中的肽段进行分级分离和脱盐处理。接下来，通过质谱分析混合样品。最后，通过将质谱的两个谱图与样品中所有潜在肽段的目标-诱饵数据库进行比对来鉴定肽段，并对样品间肽段的相对丰度进行定量。最终，就地蛋白质组学能够实现对复杂样品间多种蛋白质相对丰度的定量。与iLite等其他稳定同位素标记方法相比，还原性去甲基化的主要优势在于，ready是一种快速、经济且准确的方法，无需特定的培养基或合成培养基，因此几乎可应用于任何类型的样品。首先，通过超声处理或使用法国压榨器裂解细胞，制备一毫克细胞蛋白和500微升样品，以沉淀蛋白质。向四体积的蛋白溶液中加入一体积的三氯乙酸，并在冰上冷却10分钟。在4°C条件下以12,000 G离心五分钟，弃去上清液。然后加入1毫升冰预冷的丙酮重悬沉淀，再次离心。吸出上清液后，将沉淀置于56摄氏度的加热块中干燥，以变性蛋白质并还原染料中的二硫键。加入500 µL变性与还原缓冲液进行重悬。将蛋白质重新悬浮至浓度约为2 mg/mL。将蛋白质在56摄氏度孵育30分钟，随后在室温下孵育10分钟。为烷基化游离的巯基，向500微升蛋白质溶液中加入25微升新配制的0.3摩尔碘乙酰胺水溶液，在室温下避光孵育20分钟。孵育结束后，加入10微升3毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）以终止反应。将烷基化后的蛋白质在负80摄氏度下保存。在三氯乙酸（TCA）沉淀后，使用含1摩尔尿素的50毫摩尔HEPES缓冲液（pH 8.2）重悬蛋白质。将溶菌酶、内肽酶或ly C配制成浓度为2微克/微升的水溶液储备液，并将酶以终浓度10纳克/微升加入已消化的蛋白质中，样品于室温孵育6小时或过夜。将20微克测序级胰蛋白酶悬浮于40微升50毫摩尔乙酸溶液中，取5微升加入ly C消化反应体系中。将烷基化后的蛋白质在37摄氏度下孵育六小时。加入三氟乙酸（TFA）至终浓度为0.5%。将C18柱连接至萃取装置，然后用6毫升乙腈（ACN）润洗柱子。接下来，以尽可能高的流速，先用6毫升含0.1%三氟乙酸（TFA）的80%乙腈（ACN）冲洗色谱柱，再用6毫升0.1% TFA平衡色谱柱，停止真空压力，以约每分钟1毫升的流速将500微克肽段上样至柱中。待肽段完全结合至色谱柱后，重新启动真空，以尽可能高的流速依次用0.1% TFA和3毫升柠檬酸缓冲液冲洗色谱柱，以进行还原性二甲基化或Ready标记。在化学通风橱中，分别配制12毫升轻标和重标Ready缓冲液，用于甲基化无肽段的空白对照。加入10毫升轻链或重链预装缓冲液至层析柱中，流速为每分钟1毫升。加入第二份10毫升等分试样后，为确保标记完全，依次使用6毫升0.1%三氟乙酸（TFA）和1毫升0.5%乙酸进行处理。为洗涤色谱柱并洗脱蛋白质，停止真空，以每分钟0.5毫升的流速加入1毫升40%乙腈（含0.5%乙酸）。然后加入1毫升80%乙腈（含0.5%乙酸），必要时可用5毫升注射器进行洗脱。将重标记和轻标记的肽样品按1:1比例混合，并通过质谱定量，以确认重链和轻链标记均有效。通过将肽混合物首先上样至C18高效液相色谱柱，对肽混合物进行分级分离。然后用5% A相乙腈（CN）洗涤色谱柱5分钟，接着在60分钟内使用5%至35% A相乙腈（CN）的梯度洗脱肽段，并收集等体积的组分。将组分收集至96孔板中，随后用90% A相乙腈（CN）冲洗1分钟。再用90% A相乙腈（CN）继续冲洗4分钟后，使用5% A相乙腈（CN）重新平衡色谱柱。然后使用真空离心浓缩仪以下述方式合并组分。从合并的组分中去除溶剂。接着用130 µL的1 M尿素0.5%TFA溶液重悬。悬浮以下组分中的多肽，并将该组分集合于负20摄氏度保存，以对重悬的组分进行停止-走提取。使用两个内径为1.07毫米的C18圆盘，将200微升移液器吸头制备成C18阶段尖端微柱。将阶段尖端放入微量离心管中，加入130微升甲醇并离心。然后，在使用130 µL 0.1% TFA平衡小柱后，加入130 µL 80%乙腈（ACN）和0.5%乙酸，再次离心。将肽段混合物转移至小柱并进行洗涤：首先用130 µL 0.1% TFA洗涤，随后用40 µL 0.1% TFA洗涤。最后用40 µL 0.5%乙酸洗脱肽段。首先，向 CN 0.5% 乙酸中加入 20 µL 的 40% 溶液。然后，向 CN 0.5% 乙酸中加入 20 µL 的 80% 溶液。合并 IITs 并通过真空过滤干燥，以进行微毛细管液相色谱分析。串联质谱或液相色谱-质谱-质谱（L-C-M-S-M-S）首先使用5%甲酸和5%乙腈（A CN）将蛋白质重新悬浮至浓度约为每微升1微克。取约1微克肽段上样至尺寸为100微米×20厘米的C18反相高效液相色谱柱，以0.125%甲酸中含6%至22%乙腈（A CN）的流动相进行梯度洗脱，流速约为每分钟300纳升，洗脱时间持续75至100分钟。使用具有高分辨率和高质量精度的质谱仪，通过将样品的二级质谱（MS/MS）原始谱图文件与理论数据库进行比对来鉴定肽段，可采用SE quest等算法，并使用此处所示参数及正向与反向开放阅读框数据库；利用靶向-诱饵（target decoy）等方法，将肽段筛选至1%的假发现率。为定量已鉴定的肽段，计算一级质谱（MS1）中重链与轻链肽段对的提取离子色谱峰面积以及肽段的信噪比；仅当肽段对的平均信噪比大于5时才予以纳入。将同一肽段重链与轻链版本的一级质谱峰面积比值作为该肽段在两个样品中的相对丰度；在肽段假发现率筛选为1%的条件下，以蛋白内所有肽段的一级质谱峰面积比值的中位数计算该蛋白的相对丰度。由重链和轻链标记的培养物混合得到的c植物发酵物的标记效率为98%，其中包含11,194条独特的肽段序列。同样对未分级的Visier蛋白裂解液进行了分析。蛋白质表达差异在广泛的混合比例范围内均能稳定反映重链与轻链样本的混合比例。具体而言，在1:1混合样本中，99%蛋白质的倍数变化小于1.6；在1:10和10:1混合样本中也观察到类似结果。99%的蛋白质的比值在预期值的3.8倍范围内，表明当偏离一比一混合时，标准差有所增加。当将该标记方法应用于植物梭菌（Clostridium phytofermentans）的蛋白质组时，在以葡萄糖为碳源的重复培养中，定量了2000多种蛋白质，其中94%的蛋白质测量值处于两倍范围内。重复培养样本之间的变化也表现出高度相关性。这些实验共同表明，Ready蛋白质组学是一种准确且可重复的定量分析复杂样本间蛋白质表达差异的方法。由于该技术几乎可应用于任何类型的样本，因此为蛋白质组学领域的研究人员探索各类样本中的蛋白质表达变化铺平了道路，包括新型微生物、鱼类以及哺乳动物细胞。

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定量蛋白质组学使用还原二甲基化的稳定同位素标记

13C-同位素标记是一种用于确定多种微生物细胞中心代谢的有效技术。在使用特定标记底物培养细胞后，通过GC-MS检测可基于蛋白质源性氨基酸中的独特标记模式，揭示功能性的代谢通路。...

通过13C标记的蛋白质源性氨基酸进行代谢通路的验证与发现

当细胞遇到应激条件时，活性氧水平会升高。本文以Pseudomonas...

使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化还原蛋白质组

两种用于指定还原性α-和ε-二甲胺核磁共振信号的方法 13C-甲基化 N-末端赖氨酸的描述。一种方法利用还原性甲基化反应的pH诱导选择性，另一种方法使用氨肽酶选择性去除...

用于鉴定还原甲基化蛋白质N端二甲基胺13C标记核磁共振信号的方法

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。...

脂滴分离用于定量质谱分析

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本文通过内源性修饰与使用稳定同位素标记酸酐进行定量化学酰化后引入的修饰之间的比率分析，实现了对整个蛋白质组中位点特异性蛋白质乙酰化和/或琥珀酰化占有率（化学计量比）的无偏定量。结合高灵敏度的数据非依赖性采集质谱技术，可获得准确的位点占有率测量结果。...

使用数据非依赖性采集质谱法定量位点特异性蛋白质赖氨酸乙酰化与琥珀酰化化学计量比

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。...

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

本文介绍了一种基于加热灭活的样品制备方法，用于保护内源性肽段以避免死后降解，随后采用同位素标记结合液相色谱-质谱法（LC-MS）进行相对定量。...

用于肽组学研究的胺类还原甲基化法样品制备与相对定量

学习使用还原二甲基化（ReDi）标记和质谱技术进行定量蛋白质组学分析。该方法快速、经济且适用于多种样本类型，可准确比较复杂样本中蛋白质的相对丰度差异。

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

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