使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

本实验的总体目标是利用现成的蛋白质组学方法，通过质谱技术比较不同样品间多种蛋白质的浓度。该目标首先通过将每个样品中的蛋白质进行消化，从而生成肽段混合物来实现。随后，将两个样品混合，并对混合样品中的肽段进行分级分离和脱盐处理。

接下来，通过质谱分析混合样品。最后，通过将质谱的两个谱图与样品中所有潜在肽段的目标-诱饵数据库进行比对来鉴定肽段，并对样品间肽段的相对丰度进行定量。最终，就地蛋白质组学能够实现对复杂样品间多种蛋白质相对丰度的定量。

与iLite等其他稳定同位素标记方法相比，还原性去甲基化的主要优势在于，ready是一种快速、经济且准确的方法，无需特定的培养基或合成培养基，因此几乎可应用于任何类型的样品。首先，通过超声处理或使用法国压榨器裂解细胞，制备一毫克细胞蛋白和500微升样品，以沉淀蛋白质。向四体积的蛋白溶液中加入一体积的三氯乙酸，并在冰上冷却10分钟。

在4°C条件下以12,000 G离心五分钟，弃去上清液。然后加入1毫升冰预冷的丙酮重悬沉淀，再次离心。

吸出上清液后，将沉淀置于56摄氏度的加热块中干燥，以变性蛋白质并还原染料中的二硫键。加入500 µL变性与还原缓冲液进行重悬。将蛋白质重新悬浮至浓度约为2 mg/mL。

将蛋白质在56摄氏度孵育30分钟，随后在室温下孵育10分钟。为烷基化游离的巯基，向500微升蛋白质溶液中加入25微升新配制的0.3摩尔碘乙酰胺水溶液，在室温下避光孵育20分钟。孵育结束后，加入10微升3毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）以终止反应。

将烷基化后的蛋白质在负80摄氏度下保存。在三氯乙酸（TCA）沉淀后，使用含1摩尔尿素的50毫摩尔HEPES缓冲液（pH 8.2）重悬蛋白质。将溶菌酶、内肽酶或ly C配制成浓度为2微克/微升的水溶液储备液，并将酶以终浓度10纳克/微升加入已消化的蛋白质中，样品于室温孵育6小时或过夜。将20微克测序级胰蛋白酶悬浮于40微升50毫摩尔乙酸溶液中，取5微升加入ly C消化反应体系中。

将烷基化后的蛋白质在37摄氏度下孵育六小时。加入三氟乙酸（TFA）至终浓度为0.5%。将C18柱连接至萃取装置，然后用6毫升乙腈（ACN）润洗柱子。

接下来，以尽可能高的流速，先用6毫升含0.1%三氟乙酸（TFA）的80%乙腈（ACN）冲洗色谱柱，再用6毫升0.1% TFA平衡色谱柱，停止真空压力，以约每分钟1毫升的流速将500微克肽段上样至柱中。待肽段完全结合至色谱柱后，重新启动真空，以尽可能高的流速依次用0.1% TFA和3毫升柠檬酸缓冲液冲洗色谱柱，以进行还原性二甲基化或Ready标记。在化学通风橱中，分别配制12毫升轻标和重标Ready缓冲液，用于甲基化无肽段的空白对照。

加入10毫升轻链或重链预装缓冲液至层析柱中，流速为每分钟1毫升。加入第二份10毫升等分试样后，为确保标记完全，依次使用6毫升0.1%三氟乙酸（TFA）和1毫升0.5%乙酸进行处理。

为洗涤色谱柱并洗脱蛋白质，停止真空，以每分钟0.5毫升的流速加入1毫升40%乙腈（含0.5%乙酸）。然后加入1毫升80%乙腈（含0.5%乙酸），必要时可用5毫升注射器进行洗脱。将重标记和轻标记的肽样品按1:1比例混合，并通过质谱定量，以确认重链和轻链标记均有效。通过将肽混合物首先上样至C18高效液相色谱柱，对肽混合物进行分级分离。

然后用5% A相乙腈（CN）洗涤色谱柱5分钟，接着在60分钟内使用5%至35% A相乙腈（CN）的梯度洗脱肽段，并收集等体积的组分。将组分收集至96孔板中，随后用90% A相乙腈（CN）冲洗1分钟。再用90% A相乙腈（CN）继续冲洗4分钟后，使用5% A相乙腈（CN）重新平衡色谱柱。

然后使用真空离心浓缩仪以下述方式合并组分。从合并的组分中去除溶剂。接着用130 µL的1 M尿素0.5%TFA溶液重悬。

悬浮以下组分中的多肽，并将该组分集合于负20摄氏度保存，以对重悬的组分进行停止-走提取。使用两个内径为1.07毫米的C18圆盘，将200微升移液器吸头制备成C18阶段尖端微柱。将阶段尖端放入微量离心管中，加入130微升甲醇并离心。

然后，在使用130 µL 0.1% TFA平衡小柱后，加入130 µL 80%乙腈（ACN）和0.5%乙酸，再次离心。将肽段混合物转移至小柱并进行洗涤：首先用130 µL 0.1% TFA洗涤，随后用40 µL 0.1% TFA洗涤。最后用40 µL 0.5%乙酸洗脱肽段。

首先，向 CN 0.5% 乙酸中加入 20 µL 的 40% 溶液。然后，向 CN 0.5% 乙酸中加入 20 µL 的 80% 溶液。合并 IITs 并通过真空过滤干燥，以进行微毛细管液相色谱分析。

串联质谱或液相色谱-质谱-质谱（L-C-M-S-M-S）首先使用5%甲酸和5%乙腈（A CN）将蛋白质重新悬浮至浓度约为每微升1微克。取约1微克肽段上样至尺寸为100微米×20厘米的C18反相高效液相色谱柱，以0.125%甲酸中含6%至22%乙腈（A CN）的流动相进行梯度洗脱，流速约为每分钟300纳升，洗脱时间持续75至100分钟。

使用具有高分辨率和高质量精度的质谱仪，通过将样品的二级质谱（MS/MS）原始谱图文件与理论数据库进行比对来鉴定肽段，可采用SE quest等算法，并使用此处所示参数及正向与反向开放阅读框数据库；利用靶向-诱饵（target decoy）等方法，将肽段筛选至1%的假发现率。为定量已鉴定的肽段，计算一级质谱（MS1）中重链与轻链肽段对的提取离子色谱峰面积以及肽段的信噪比；仅当肽段对的平均信噪比大于5时才予以纳入。将同一肽段重链与轻链版本的一级质谱峰面积比值作为该肽段在两个样品中的相对丰度；在肽段假发现率筛选为1%的条件下，以蛋白内所有肽段的一级质谱峰面积比值的中位数计算该蛋白的相对丰度。

由重链和轻链标记的培养物混合得到的c植物发酵物的标记效率为98%，其中包含11,194条独特的肽段序列。同样对未分级的Visier蛋白裂解液进行了分析。蛋白质表达差异在广泛的混合比例范围内均能稳定反映重链与轻链样本的混合比例。具体而言，在1:1混合样本中，99%蛋白质的倍数变化小于1.6；在1:10和10:1混合样本中也观察到类似结果。

99%的蛋白质的比值在预期值的3.8倍范围内，表明当偏离一比一混合时，标准差有所增加。当将该标记方法应用于植物梭菌（Clostridium phytofermentans）的蛋白质组时，在以葡萄糖为碳源的重复培养中，定量了2000多种蛋白质，其中94%的蛋白质测量值处于两倍范围内。重复培养样本之间的变化也表现出高度相关性。

这些实验共同表明，Ready蛋白质组学是一种准确且可重复的定量分析复杂样本间蛋白质表达差异的方法。由于该技术几乎可应用于任何类型的样本，因此为蛋白质组学领域的研究人员探索各类样本中的蛋白质表达变化铺平了道路，包括新型微生物、鱼类以及哺乳动物细胞。