定量蛋白质组学使用还原二甲基化的稳定同位素标记

该程序的总体目标是使用现成的蛋白质组学通过质谱法比较样品之间许多蛋白质的浓度。这是通过首先消化每个样品中的蛋白质以生成肽混合物来实现的。接下来，将两个样品混合，对混合样品中的肽进行分馏和脱盐。

接下来，然后通过质谱分析混合样品。最后，通过将 MS 两张谱图与样品中所有潜在肽的目标诱饵数据库进行比较来鉴定肽，并量化样品之间肽的相对丰度。最终，即用型蛋白质组学能够定量复杂样品之间许多蛋白质的相对丰度。

与其他稳定同位素标记方法（如 iLite）相比，还原去甲基化的主要优点是 ready 是一种快速、廉价且准确的方法，不需要特定的三层或合成介质，这意味着它几乎可以应用于任何类型的样品。首先，通过使用超声处理或法式压榨机制备 1 毫克细胞蛋白和 500 微升，以溶解细胞以沉淀蛋白质。将 1 体积的三氯酸加入 4 体积的蛋白质中，在冰上冷却 10 分钟。

4 摄氏度下以 12， 000 Gs 离心 5 分钟，然后去除上清液。然后使用一毫升冰冷的丙酮进行 Resus。在第二次旋转之前暂停颗粒。

吸出 snat 后，在 56 摄氏度的加热块中干燥沉淀，使蛋白质变性并减少染料硫化键。使用 500 μL 变性和还原缓冲液进行重新使用。将蛋白质重悬至约 2 毫克/毫升。

将蛋白质在 56 摄氏度下孵育 30 分钟，然后在室温下孵育 10 分钟。在烷基化物游离硫化物基团旁边，将 25 微升新鲜制备的 0.3 摩尔 IDO 乙酰胺水溶液加入 500 微升蛋白质中，并在室温下避光孵育 20 分钟。孵育后，加入 10 μL 3 毫摩尔 DTT 淬灭反应。

将烷基化蛋白质储存在负 80 摄氏度以消化烷基化蛋白质，TCA 沉淀后，在 50 毫摩尔 heis pH 8.2 中使用一摩尔尿素重悬蛋白质。在水中制备浓度为 2 μg/μL 的 Lysol、endo 蛋白酶或 ly C 储备液，并将酶以终浓度为每微升 10 ng的酶添加到消化的蛋白质中，样品在室温下放置 6 小时或过夜。将 20 μg 测序级胰蛋白酶悬浮在 40 μL 50 毫摩尔乙酸中，并向 Lyce 消化反应中加入 5 μL。

37 摄氏度下孵育 6 小时，使烷基化蛋白质得到。添加 tri Fluor 乙酸或 TFA 至终浓度为 0.5%将 C 18 色谱柱连接到萃取装置上。然后使用 6 mL 乙基丁腈或 CN 润湿色谱柱。

接下来，以尽可能高的流速，使用 6 毫升 80%a CN 0.1%TFA 清洗色谱柱，然后使用 6 毫升 0.1%TFA 平衡色谱柱，停止真空压力，以大约每分钟 1 毫升的流速将 500 μg 肽加载到色谱柱上。肽与色谱柱结合后，重新启动真空，以尽可能高的流速，使用 0.1% TFA，然后用 3 mL 柠檬酸缓冲液清洗色谱柱，以进行 Onco、还原、暗淡甲基化或即用型标记。在化学罩下，制备 12 毫升不含 Tom Methylate 肽的轻质和重型即用型缓冲液。

A 方法以每分钟 1 mL 的流速向色谱柱中加入 10 mL 轻质或重质即用型缓冲液。应用第二个 10 毫升等分试样后。为确保标记，使用 6 毫升 0.1% TFA，然后是 1 毫升 0.5% 乙酸。

要清洗色谱柱以洗脱蛋白质，请停止真空，以每分钟 0.5 mL的流速将 1 mL 40% 加入 CN 0.5% 乙酸中。然后根据需要，用 5 毫升注射器加入 1 毫升 80%a CN 0.5% 乙酸洗脱液。将重标记和轻标记肽样品以一比一的比例混合，并通过质谱法定量，以确保肽混合物和轻标记都有效分离肽混合物，首先将其应用于 C 18 HPLC 色谱柱。

然后，使用 5% a CN 洗涤色谱柱 5 分钟后，在 60 分钟内使用 5 至 35% a CN 的梯度，以等馏分洗脱肽。在 96 孔板中，然后用 90%A CN 反应 1 分钟。再放置 4 min的 90% A CN 后，使用 5%A CN 重新平衡色谱柱。

然后用真空离心机按以下方式混合馏分。从合并馏分中去除溶剂。然后使用 130 微升 0.5% TFA 的单磨牙尿素进行复苏。

悬浮以下级分中的肽，并将一组级分储存在负 20 摄氏度，以对重悬的级分进行、停止和开始提取。使用两个内径为 1.07 毫米的 C 18 圆盘，从 200 微升移液器吸头制备 C 18 阶段吸头微量柱。将载物台尖端放入微量离心管中，加入 130 μL 甲醇并离心。

然后加入 130 微升 80%a CN 0.5% 乙酸，然后再次旋转，使用 130 微升 0.1%TFA 平衡吸头，将肽混合物转移到吸头上并洗涤。首先加入 130 微升 0.1% TFA，然后加入 40 微升 0.1% TFA。然后用 40 微升 0.5% 乙酸洗脱肽。

首先，将 20 微升 40% 加入 CN 0.5% 乙酸中。然后加入 20 微升 80%a CN 0.5% 乙酸。将 IIT 和真空滤液混合干燥以进行微量毛细管液相色谱。

串联质谱法或 L-C-M-S-MS 首先使用 5% 甲酸、5% A CN 将蛋白质重悬至大约每微升 1 微克的浓度。将大约 1 微克肽涂抹在 100 微米 x 20 厘米的 C 18 上。反相 HPLC 色谱柱，使用 6% 至 22% 梯度的 CN 在 0.1 25% 甲酸中以约 300 nL/min 的流速洗脱，在 75 至 100 分钟内应用。

使用高分辨率和高质量精度的质谱仪，通过使用 SE quest 等算法将 Ms.Ms Spectra 原始文件与理论数据库进行比较来识别样品中的肽，使用此处显示的参数和实际和反向开放阅读框数据库，使用目标诱饵等方法将肽过滤到 1% 的错误发现率。为了定量鉴定出的肽，计算 MS 1 提取离子色谱图的重对和轻对的面积，只有当肽对的平均信噪比高于 5 时，肽信噪比才包括肽对。将两个样品中肽的相对丰度定量为同一肽的重肽和轻肽的 MS 单峰面积比，计算蛋白质相对丰度，即过滤到 1% 肽错误发现率时，蛋白质中所有肽的中位 MS 单峰面积比。

来自含有 11， 194 个独特肽序列的重标记和轻标记培养物的 c 植物发酵混合物的即用型标记效率为 98%Unsecondated visier 蛋白裂解物进行类似分析。蛋白质表达差异可重现地反映重样品和轻样品在较宽的混合比例范围内混合的比率。具体而言，1 对 10 和 10 对 1 样品中 1 对 1 混合样品的 99% 蛋白质的 fo 变化小于 1.6。

99% 的蛋白质在预期比率的 3.8 倍以内，表明与一对一混合物的距离越远，标准偏差就越大。当将即用型标记应用于梭菌植物发酵蛋白质组时，对 2000 多种蛋白质进行定量，其中 94% 的蛋白质测量值在葡萄糖蛋白折叠上生长的重复培养物的水平为两倍。重复培养物对的变化也高度相关。

这些实验共同证明，Ready 蛋白质组学是一种准确且可重现的方法，可以量化复杂样品之间的蛋白质表达差异。由于该技术几乎可以应用于任何类型的样品，因此它为蛋白质组学领域的研究人员探索各种样品（包括新型微生物、鱼类和哺乳动物细胞）中的蛋白质表达变化铺平了道路。