基于激光显微切割的神经黑色素颗粒蛋白质组学谱LC-MS/MS分析方案

我们结合激光显微切割与质谱技术，能够对任何类型的组织中蛋白质组水平上的空间分辨变化进行研究。在本案例中，研究对象为神经黑色素颗粒。本方案可基于有限的样品材料实现蛋白质组学分析。

这在使用死后脑组织进行研究时通常是一个巨大的挑战。由于可以分离单个细胞，从而在蛋白质组学水平上比较健康与疾病状态，这可能会加深我们对疾病机制的理解。

首先，将组织膜玻片放置在机器人载台的玻片架上，确保组织面朝上。为获取组织切片的概览扫描图像，使用扫描功能，从左上角和右下角选定感兴趣的区域。

然后选择扫描所有 ROI 以执行扫描。为在当前视野中自动选择神经黑色素颗粒，请选择视野分析。

然后选择“反选结果”，并设置 RGB 通道的阈值，使预览窗口中仅神经黑色素颗粒以红色高亮显示。现在单击“确定”，以使用调整后的设置应用于当前视野。

仅使用载玻片上被膜覆盖的区域调整激光参数。在样品收集管盖中加入 50 µL 超纯水，并将管盖插入 robo mover 的收集装置中。

使用软件界面，将 robo 移动装置定位到 robo 平台二的上方，以开始样品采集。启动激光器。在激光过程中控制能量和聚焦设置，并在必要时调整参数。

确保前10个分离物体能够正确隔离，并弹射至样品收集管盖中。采样完成后，将机械臂移回起始位置，并取出样品收集管。随后通过离心对样品进行处理。

在真空浓缩仪中将样品干燥 1.5 小时。按照文中所述进行胰蛋白酶消化后，将 200 至 400 纳克的样品肽溶解于一定体积的 0.1% TFA 中，以制备用于 HPLC-MS 分析的样品。

在惰性质谱玻璃进样瓶入口中。如果由于样品量过低而无法进行浓度测定，请通过比较总离子流来验证样品加载量的一致性。

开始进行蛋白质组学原始数据分析。点击“加载”以将原始文件载入软件中。点击“设置实验”以指定样本名称。

用于定义组别特异性参数。通过选择脱酰胺化 NQ、氧化 M 和 N 端羧甲基化作为可变修饰来添加修饰，然后将 C 位羧甲基化作为固定修饰添加。

在消化选项卡中选择胰蛋白酶作为消化酶。在无标记定量选项卡中，添加LFQ选项；若需处理的文件超过10个，则选择快速LFQ选项以缩短处理时间。确保所有其他组别特异性参数保持出厂设置。

进入全局参数选项卡，在序列选项卡中添加从 uniprot.org 获取的 FASTA 文件。相应地修改标识符规则。

并添加智人（Homo sapiens）的分类学编号 9606。在蛋白质定量时选择唯一肽段和 razor 肽段。然后在无标记定量选项卡中添加 iBAQ 选项，作为蛋白质定量的度量方法。

确保所有其他全局参数保持出厂设置，然后点击开始。分析成功完成后，获取 proteingroups.txt 输出结果。

在分析软件中载入 proteingroups.txt 文件。将 iBAQ 值作为主列，并根据其他各列的类型对其进行排序。

通过基于分类列筛选行并根据有效值过滤结果，去除诱饵和污染物。将输出结果以 txt 格式导出以进行后续处理。并根据研究问题评估结果。

本研究中，在 NMGs 中鉴定了 1,898 个蛋白质群，在邻近的 SN 组织中鉴定了 1,565 个蛋白质群，其中 1,384 个蛋白质群在两种组织区域中均有检出。因此，分别有 514 个和 181 个蛋白质群特异性地存在于 NMGs 和 SN 组织中。在代表性 DDA 检测中。

NMGs 中略高的 iBAQ 值与 SN 相比表明，NMGs 中细胞质动力蛋白-1 重链 1 蛋白的丰度更高。该观察结果在针对肽段 ESPEVLLTLDILK 的 PRM 实验中得到验证，其中检测到 NMGs 中该肽段的丰度更高。

根据MS1和MS2水平的峰面积。迄今为止，最重要的步骤是NMGs的分离，因为后续所有实验步骤均依赖于该步骤的准确执行。经过LMD程序后，样品可被用于进一步处理，并适用于各类组学技术，如基因组学、转录组学、蛋白质组学或脂质组学。