从多个小鼠组织分离中间丝状蛋白以研究与老化相关的翻译后修饰

该生化程序的总体目标是从多个小鼠组织中分离富含中间丝的组分，以研究不同组织特异性中间丝蛋白的翻译后修饰。这种方法可以帮助回答中间丝领域的关键问题，例如在哺乳动物衰老过程中这些重要的应激保护细胞骨架蛋白的功能和调节如何受到影响。该技术的主要优点是，结合自动组织裂解步骤使用户能够快速有效地处理多个组织样本。

首先，将 1 毫升冰冷的 Triton X-100 缓冲液（补充有蛋白酶抑制剂）加入玻璃管匀浆器中，并将其置于冰上。从液氮储存中取出一小块组织，将其直接放入玻璃均质器中。然后，在始终将均质器和样品保持在冰上的同时，使用大约 50 次聚四氟乙烯浆料使样品均质化，同时最大限度地减少气泡的形成。

将裂解物转移至冰上的 1.5 ml 微量离心管中，并在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 离心样品 10 分钟。接下来，将 Triton X 可溶性上清液组分收集到单独的试管中。该组分可用于免疫沉淀和分析 IF 蛋白的去污剂可溶性库。

然后，向组织沉淀中加入 1 毫升补充有蛋白酶抑制剂的高盐缓冲液。将其转移到干净的均质器中，并进行 100 次冲程。将匀浆转移回微量离心管中，并将试管放在冷藏室的旋转摇床上 1 小时。

匀浆在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 离心 20 分钟，然后弃去上清液。向沉淀中加入 1 毫升冰冷的 PBS EDTA 缓冲液，并将其转移到干净的均质器中作为最终净化步骤。均质化后，将样品转移到新试管中，并在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 离心 10 分钟，以获得富含 IF 蛋白的高盐提取物 （HSC）。

弃去上清液，将沉淀溶解在 300 μL 预热的非还原性 SDS 样品缓冲液中。最初通过移液和涡旋打碎沉淀。然后将样品在 95 摄氏度下加热 5 分钟。

根据需要涡旋和移液，以确保沉淀完全溶解，这可能需要几分钟。将所有样品储存在零下 20 摄氏度直至分析。要进行 RNA 提取，请在含有赖氨酸基质 D 的试管中加入裂解缓冲液，然后将样品组织加入组织裂解仪中，脉冲两次，每次 25 秒。

通过以 20， 000 倍 G 离心将裂解物与基质分离，对于蛋白质提取，如果制备总裂解物，请添加 Triton X-100 或 SDS 样品缓冲液。放入带有赖氨酸基质 SS 的赖氨酸管中。然后，添加样品组织。对样品进行短暂脉冲以混合。

制备 HSC，使用磁铁从试管中取出不锈钢珠，并在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 离心试管 10 分钟。分离上清液和沉淀组分，并按照视频前面的演示进行作。通过添加 10 微升 T20 至 50 毫升 PBS pH 7.4 制备 PBST 缓冲液。

然后通过将 1 至 10 μg 抗体添加到 200 μL PBST 中来制备 PTM 抗体溶液。将 50 μL 磁珠分装到微量离心管中。将其放在磁力架上，吸出磁珠储存溶液。

将微珠重悬于抗体溶液中，并将样品在旋转器上室温孵育 20 分钟，使微珠与免疫沉淀抗体偶联。将试管放在磁力架上，然后吸出抗体溶液。然后使用 200 μL PBST 冲洗抗体偶联的珠子一次，并去除溶液。

向磁珠中加入 0.6 至 1 毫升组织裂解物。轻轻移液混合，并在冷藏室中将溶液在旋转器上孵育 3 小时。将试管放在磁铁上并去除裂解物，然后使用 200 微升 PBST 洗涤珠子五次。

在最后的洗涤步骤后，收集珠子和 100 μL PBS，并将珠子转移到新的干净试管中。将试管放在磁力架上，然后吸出 PBS。从磁铁上取下试管，加入 100 μL 非还原性样品缓冲液。

从试管中分装 50 μL，并将其与 5%2ME 混合制成还原样品。将样品加热至 95 摄氏度 5 分钟。将试管放在磁力架上，从磁珠中收集 IP 馏分，并将其转移到新试管中。

将样品储存在零下 20 摄氏度直至分析。为避免质谱分析中的蛋白质样品受到污染，请使用干净的手套处理所有凝胶，并将它们放在仅用 DD H2O 清洗过的干净容器中孵育。根据标准条件，在 SDS 页面凝胶上运行 20 至 50 μL HSE 样品。

根据文本方案对凝胶进行染色后，将凝胶放在塑料片保护膜之间。然后扫描并标记将被切除的条带。使用新的、干净的剃须刀切除 IF 蛋白条带，并将条带放入冰上干净的微量离心管中，然后再提交进行质谱分析。

该图显示了使用快速方法从 9 个小鼠组织中分离的 HSE 的典型结果。请注意，这种方法在胰腺和脾脏上效果不佳，并在大肠样品中产生额外的条带。该基因表达分析表明，角蛋白 8 在衰老过程中上调。

此外，蛋白质印迹显示角蛋白 8 在老年小鼠的肝脏中强烈上调。在这里，使用自动化方案获得的肝脏 HSE 表明角蛋白 8 和 18 在凝胶上强烈富集。质谱分析表明，老年小鼠肝脏中的 K8 和 K18 具有多个磷酸化和乙酰化位点，这些位点在年轻小鼠的肝脏中不存在。

与肝脏中的角蛋白变化类似，通过 QPCR 对脑组织进行的分析显示，与 3 个月大的小鼠相比，24 个月大的小鼠大脑中 GFAP mRNA 的诱导作用提高了 5 倍。最后，通过考马斯染色对高盐提取物进行蛋白质分析，并对总和乙酰赖氨酸富集级分进行免疫印迹分析，发现 GFAP 蛋白在老年小鼠大脑中上调和乙酰化。在此程序之后，其他方法（例如基于质谱的蛋白质混合物）可用于回答其他问题，例如在不同生理和病理生理条件下中间丝蛋白的重要翻译后修饰和结合伴侣是什么。

看完这个视频，你应该对如何从不同的哺乳动物组织中分离中间丝蛋白有了很好的了解。