从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰

本项生物化学实验的总体目标是从多种小鼠组织中分离富含中间丝的组分，以研究不同组织特异性中间丝蛋白的翻译后修饰。该方法有助于解答中间丝研究领域中的关键问题，例如这些重要的细胞骨架蛋白在哺乳动物衰老过程中其功能与调控如何受到影响。该技术的主要优势在于引入了自动化的组织裂解步骤，使研究人员能够快速高效地处理多个组织样本。

首先，将1毫升冰预冷的Triton X-100缓冲液（含蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，并置于冰上。从液氮储存中取出一小块组织，直接放入玻璃匀浆器中。在整个操作过程中，始终保持匀浆器和样品处于冰上，使用聚四氟乙烯杵头进行约50次上下研磨，充分匀浆样品，同时尽量减少气泡的产生。

将裂解液转移至预冷的1.5毫升微量离心管中，置于冰上，于4°C以20,000 × g离心10分钟。随后，收集Triton X可溶性上清组分至另一新管中。该组分可用于免疫沉淀以及IF蛋白的去垢剂可溶性组分的分析。

然后，向组织沉淀中加入一毫升含有蛋白酶抑制剂的高盐缓冲液。将其转移至洁净的匀浆器中，研磨100次。将匀浆液转移回微量离心管中，并将管子置于冷室内的旋转摇床上孵育一小时。

将匀浆在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 20 分钟，弃去上清液。向沉淀中加入 1 mL 冰冷的 PBS EDTA 缓冲液，并转移至洁净的匀浆器中进行最终的纯化步骤。匀浆后，将样品转移至新管中，在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟，获得富含 IF 蛋白的高盐提取物（HSC）。

弃去上清液，将沉淀重悬于300微升预热的非还原性SDS样品缓冲液中。先通过移液吹打和涡旋振荡分散沉淀，然后在95摄氏度加热样品5分钟。

根据需要进行涡旋和移液，以确保沉淀物完全溶解，此过程可能需要数分钟。所有样品均应于负20摄氏度保存，直至分析。进行RNA提取时，向含有溶菌素基质D的离心管中加入裂解缓冲液，然后将待测组织加入组织裂解仪中，脉冲处理两次，每次25秒。

通过20,000 × g离心将裂解液与基质分离。如需提取蛋白质，在制备总裂解液时加入Triton X-100或SDS上样缓冲液。将裂解液加入含有赖氨酸基质SS的赖氨酸管中，然后加入待测组织样本。短暂脉冲振荡以混匀样本。

为制备 HSC，使用磁铁从离心管中移除不锈钢珠，并在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟。分离上清液和沉淀组分，并按照视频中先前演示的步骤进行操作。通过将 10 µL 的 T20 加入 50 mL pH 7.4 的 PBS 中来配制 PBST 缓冲液。

然后，通过将1至10微克抗体加入200微升PBST中，制备PTM抗体溶液。取50微升磁珠分装至微量离心管中。将管子置于磁力架上，吸除磁珠储存液。

通过将磁珠重悬于免疫沉淀抗体溶液中，并在室温下于旋转仪上孵育样品 20 分钟，使磁珠与抗体结合。将离心管置于磁架上，吸除抗体溶液。随后用 200 µL PBST 洗涤抗体偶联磁珠一次，并移除洗涤液。

向珠子中加入0.6至1毫升组织裂解液。轻轻吹打混匀，于4℃旋转孵育3小时。将离心管置于磁力架上，吸除裂解液，再用200微升PBST洗涤珠子5次。

最后一次洗涤步骤后，收集磁珠和100微升PBS，将磁珠转移至一个新的洁净离心管中。将离心管置于磁力架上，吸除PBS。从磁力架上取下离心管，加入100微升非还原性上样缓冲液。

从离心管中取出 50 微升分装样品，加入 5%2ME 以制备还原性样品。将样品在 95 摄氏度下加热 5 分钟。将离心管置于磁力架上，从磁珠中收集免疫沉淀组分，并转移至新的离心管中。

将样品在负20摄氏度下保存至分析前。为避免蛋白质样品在质谱分析中受到污染，操作所有凝胶时应佩戴洁净手套，并将其置于仅用去离子水清洗过的洁净容器中孵育。按照标准条件，在SDS-PAGE凝胶上上样20至50微升的HSE样品。

根据文本方案染色凝胶后，将凝胶置于塑料膜保护袋之间。然后扫描凝胶并标记出将被切下的条带。使用一把新的、洁净的剃刀切下IF蛋白条带，并在提交质谱分析前将条带放入冰上的洁净微量离心管中。

该图展示了使用快速方法从小鼠九种组织中分离得到的HSE的典型结果。需要注意的是，该方法在胰腺和脾脏中的效果不佳，并且在大肠样本中会产生额外的条带。该基因表达分析显示，Keratin 8在衰老过程中表达上调。

此外，Western印迹显示，Keratin 8在老年小鼠肝脏中显著上调。此处采用自动化方案获得的肝脏HSE电泳图显示，Keratin 8和Keratin 18在凝胶中显著富集。质谱分析表明，来自老年小鼠肝脏的K8和K18存在多个磷酸化和乙酰化位点，而这些修饰位点在年轻小鼠肝脏中不存在。

与肝脏中角蛋白的变化类似，通过定量PCR分析脑组织发现，与3月龄小鼠相比，24月龄小鼠脑内GFAP mRNA的表达水平升高了五倍。最后，对高盐提取物进行考马斯亮蓝染色的蛋白质分析，以及对总蛋白和乙酰化赖氨酸富集组分的免疫印迹分析表明，GFAP蛋白在老龄小鼠脑组织中表达上调且发生乙酰化修饰。在完成该实验流程后，可进一步采用基于质谱的蛋白质组学等其他方法，探究中间丝蛋白在不同生理和病理生理条件下重要的翻译后修饰类型及其相互作用蛋白等科学问题。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从不同哺乳动物组织中分离中间丝蛋白。