Name: 高亲和力抗体 - 抗原的结合动力学的测定，使用四个生物传感器平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 学习使用四种生物传感器平台测定高亲和力抗体-抗原结合动力学的方法。本研究比较了Biacore T100、ProteOn XPR36、Octet RED384和IBIS-MX96的数据质量与操作效率，为药物研发中选择可靠平台提供指导。

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作者感谢 Noah Ditto 和 Adam Miles 在 IBIS MX96 上提供的技术支持。

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本视频文章的出版费用由&#160;Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals 支付。

我们的直接对比研究表明，每种生物传感器平台都有其各自的优势与局限性。尽管通过肉眼比较可见抗体的结合谱相似（图3 - 6），且在不同仪器间获得的动力学速率常数的排序高度一致图7），我们的结果表明，采用连续流动流体系统的 SPR 仪器在解析具有慢解离速率的高亲和力相互作用方面更具优势。在解离相期间，数据集中观察到向上的漂移例如单克隆抗体2、单克隆抗体5和单克隆抗体9； 图5由BLI无流体系统生成。这一发现在很大程度上可归因于微孔板中样品随时间发生的蒸发，这是该系统的主要局限性。由于这一固有缺陷，实验时间也被限制在12小时以内；因此，该平台的实验程序设置的时间较短（500秒结合期和30分钟解离期），而其他平台的实验时间较长（10分钟结合期和45分钟解离期）。然而，缩短实验时间似乎并未减轻蒸发对数据质量/一致性的不利影响，因为基于BLI的仪器所获得的速率常数由于部分解离速率的波动而表现出较低的线性度。图8C）。除了样品蒸发因素外，所用捕获试剂的差异也可能导致了实验结果的不同。尽管三种基于微流控的SPR平台均使用了蛋白A/G，但非微流控的BLI平台则采用了AHC传感器。由于蛋白A/G对单克隆抗体（mAbs）的亲和力可能弱于AHC这种基于抗体的生物传感器表面，因此mAb-抗原复合物在蛋白A/G表面的解离速率可能被人为地表现为比在AHC表面更快。这一推测得到了实验数据的支持：BLI平台测得的解离速率值 consistently 低于其他仪器获得的结果。图7, 红线然而，BLI平台相较于其他平台具有多种优势。例如，由于提供多种预包被传感器可供直接使用，该平台在传感器选择和检测配置方面具有高度灵活性。在我们的实验中，使用AHC传感器省去了配体固定化步骤，从而缩短了准备时间。此外，与采用复杂管路和阀切换装置的流体SPR平台相比，BLI平台所需的维护工作显著减少。这一特性在处理可能引起堵塞和污染问题的粗样品实验中具有明显优势。
随着对高效、快速且准确鉴定治疗候选分子的需求不断增长，生物传感器通量的需求也在上升。在四种生物传感器平台中，能够进行96配体阵列打印的生物传感器通量最高，其次是采用交叉式36配体格式的生物传感器以及基于BLI、具有16通道同步检测功能的生物传感器，这三种平台将单个结合循环中可测量的相互作用数量分别提升至96、36和16。这些通量能力显著高于传统SPR平台，后者受限于仅通过单一串联流路连接的四个流动池。由于我们的实验涉及的样本量相对较小（即在多种表面密度下评估10种单克隆抗体，并采用较长的解离时间），仪器通量在决定实验效率方面仅起到中等作用。三种高通量平台的实验时间没有显著差异，且在所有情况下实验均在一天内完成。相比之下，尽管传统串联流路SPR在实验设置完成后可实现无人值守的自动化数据采集，但仍需3天才能完成实验。在其他涉及大量样本（i.e. 数百至数千个）的研究中，例如用于解离速率排序/动力学筛选或表位分组分析，通量则成为关键因素。
尽管IBIS MX96的通量远高于其他生物传感器，因此是此类应用的理想选择，但它仍存在一些不足之处。特别是，CFM阵列打印显示出较大的表面不均一性（图1）以及数据重复性降低（图8D和8E）。对于精确的动力学测量，生物传感器表面配体的量是一个关键参数，必须加以控制，以确保结合响应不会受到质量传递或空间位阻等次要因素的干扰。对于Biacore T100和ProteOn XPR36，最优RL水平是基于标准Rmax值计算方法确定的，如研究论文17所述。而对于Octet RED384和IBIS MX96平台，则通过一系列在恒定时间内连续两倍稀释的抗体经验性地获得单克隆抗体（mAb）捕获水平。由于对捕获步骤缺乏了解或控制，导致表面抗体密度较高，结合响应信号较强（图2），这可能影响了动力学速率常数的准确性。此外，打印机与SPR检测器分离的设计在进行涉及再生步骤的多循环结合测量时也带来了挑战。唯一可行的多循环动力学实验方案是通过直接胺偶联将mAb固定在芯片表面，而不是像其他三种生物传感器平台那样利用固定化的蛋白A/G表面捕获mAb的Fc段。因此，必须额外进行再生条件筛选实验以确定最佳再生条件。该方案的结果导致观察到的表面活性比Fc捕获法低约90%（图9），同时实验耗时更长。为了实施Fc捕获方法，采用了另一种单循环动力学策略。该策略包括依次注入浓度递增的分析物，且每次注入之间不进行再生（图2）。这种极为便捷但较少使用的方法不仅缩短了实验时间并减少了试剂消耗，而且获得的动力学速率常数与其他生物传感器的结果高度一致（图7）。因此，采用这种单循环动力学方法克服了仪器固有的结构限制，为高通量获取高分辨率动力学速率常数提供了可能。
尽管Biacore T100在通量方面存在主要局限性，但我们的结果总体表明，其产生的数据一致性最高，质量最优。紧随其后的是通量约高10倍的ProteOn XPR36。当表征高亲和力抗体-抗原相互作用时，若接近仪器检测极限，此类技术挑战较大，而这些仪器生成高质量数据的能力便成为显著优势。然而，Octet RED384仪器在系统层面存在局限性，阻碍了对解离速率常数的准确测定即，无法达到检测慢解离速率所需信号衰减的灵敏度），Biacore T100 和 ProteOn XPR36 均可提供灵敏且可靠的检测以实现区分。

获得可靠的动力学参数以表征抗体-抗原相互作用，是药物发现与开发过程中的关键环节1。光学表面等离子共振（SPR）生物传感器作为实时检测此类相互作用的“金标准”，已应用约二十年，可用于早期筛选符合标准的治疗性抗体候选分子2,3。除了可通过粗制上清液的快速结合筛选对抗体候选分子进行亲和力排序4，以及对纯化样品进行严格的动力学常数测定5外，生物传感器还可通过表位分组研究进一步区分先导候选分子的功能活性6,7。
为了满足针对多种治疗适应症的抗体类产品的日益增长的需求8，近年来已开发出多种创新的生物传感器仪器，以提高候选分子的筛选与表征效率9,10。这些仪器在微流控通道结构设计和/或检测生物分子相互作用所采用的光学原理方面有所不同。具体而言，Octet RED38411、ProteOn XPR3612 和 IBIS MX967 已将单个结合循环中可测量的相互作用数量分别提升至16、36和96，相较于传统的Biacore平台，通量显著提高。尽管这些不同的生物传感器平台均能提供用于表征抗体-抗原相互作用的关键动力学数据，但由于仪器配置的差异，它们在实验设置和操作流程上各不相同。例如，在IBIS MX96的表面等离子共振成像阵列平台中，多重配体固定步骤需在独立于检测器的外部打印设备中以离线模式完成7,13；相比之下，其余三种生物传感器平台采用“一体化”设计，所有组分（无论是活化试剂、配体还是分析物）添加至传感器表面的过程均通过预设程序按顺序实时记录。在Octet RED384中，这一基于生物膜干涉技术（BLI）的平台具有一个独特优势：提供预包被的光纤生物传感器，可直接用于“浸入即读”操作14，从而无需进行配体表面准备以及启动/平衡等步骤——而这些步骤在基于SPR的平台中通常必不可少。该仪器无流路的设计也简化了机械结构，并在处理粗样品时避免了堵塞和污染问题。ProteOn XPR36采用了新颖的6×6交叉流路设计，可通过切换流道方向（横向与纵向交替）实现“单次注射”动力学方法，生成36个相互作用位点15。与传统串联流路的Biacore T100平台一次仅评估单一配体或分析物浓度的结合动力学不同，该方法可在单个结合循环中同时监测多达36种不同的相互作用。
尽管这四种生物传感器平台存在差异，但它们在全球范围内的许多实验室中均被广泛使用。对于缺乏实际生物传感器操作经验的新用户而言，由于仪器设计上的差异，选择使用哪种仪器可能是一项具有挑战性的任务。为了确定最适合其研究目的的仪器，需要综合考虑数据质量、性能稳定性、通量、操作便捷性以及材料消耗等因素。尽管已有若干基准研究探讨了从多个实验室和生物传感器获得的结合动力学速率常数的变异性5,16，但最近发表的一项直接比较研究进一步从仪器性能的角度，深入分析了影响数据可靠性的系统性因素17,18。本视频提供的实验方案详细聚焦于实验设置与操作流程，并与题为《高亲和力抗体-抗原结合动力学评估中生物传感器平台的比较》的研究论文相配套17。这些方案不仅旨在帮助新的生物传感器用户将其应用于自身研究，同时也为现有用户在设计评估高亲和力抗体-抗原相互作用的实验时，提供有关技术挑战与注意事项的进一步见解。

<table><tbody><tr><td>Biacore T100 系统</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>T100 系统已升级至 T200</td></tr><tr><td>CM5 传感芯片&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>版本 4.1</td></tr><tr><td>Biacore T100 控制软件</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>T100 控制软件已升级至 T200</td></tr><tr><td>胺偶联试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050&amp;nbsp;</td><td>包含：750 mg 盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC），115 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），10.5 mL 1.0 M 盐酸乙醇胺，pH 8.5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP+ 缓冲液 10&amp;times;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>浓缩储备液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>塑料小瓶，外径 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>橡胶盖，3 型</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>塑料小瓶和盖，外径 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn XPR36 蛋白质相互作用阵列系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn Manager 软件&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>版本 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM 传感芯片</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>胺偶联试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>包含 EDAC（EDC）、sulfo-NHS、盐酸乙醇胺&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>再生与平衡试剂盒及缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>包含甘氨酸缓冲液（pH 1.5、2.0、2.5、3.0）各 1 份，以及 NaOH、SDS、HCl、磷酸、NaCl；每种溶液 50 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2 L PBS/Tween/EDTA 缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>包含磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4，0.005% Tween 20，3 mM EDTA&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Octet RED384 系统</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td></td><td>版本 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Dip and Read 抗人 IgG Fc 捕获（AHC）生物传感器</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5060</td><td>每盘 96 个生物传感器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>384 孔斜底板&amp;nbsp;</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>生物传感器分配器</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>动力学缓冲液 10x</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-1092</td><td>10 倍浓度，含 ProClin 300。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi 系统</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微流控连续流动微点样（CFM）打印机</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>版本 2.0</td></tr><tr><td>SensEye COOH-G 芯片</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>版本 6.19.3.17</td></tr><tr><td>SPRint 数据分析软件</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>版本 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Scrubber 2</td><td>BioLogic Software</td><td></td><td>版本 2</td></tr><tr><td>Pierce 重组蛋白 A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

利用四种生物传感器平台测定高亲和力抗体-抗原结合动力学

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

无标记光学生物传感器在药物发现中是表征生物分子相互作用的有力工具。本研究中，我们描述了实验室常规使用的四种生物传感器平台，用于评估十种高亲和力单克隆抗体（mAbs）与人前蛋白转化酶枯草溶菌素9型（PCSK9）之间的结合亲和力和动力学特性。Biacore T100 和 ProteOn XPR36 均基于成熟的表面等离子体共振（SPR）技术，但前者采用串联流路配置连接四个流路池，而后者则通过改进的6×6交叉微流控通道结构实现36个反应位点的并行检测。IBIS MX96 同样基于SPR传感器技术，并额外具备成像功能，可提供空间取向上的检测能力。该检测技术结合连续流动点样仪（CFM），能够同时进行96个反应位点的多重阵列点样与检测，显著提高了通量。相比之下，Octet RED384 基于生物膜干涉（BLI）光学原理，其光纤探针作为生物传感器，通过检测结合相互作用引起探针尖端表面干涉图样的变化来实现检测。与基于SPR的平台不同，BLI系统不依赖连续流动的流体系统，而是将传感器探针浸入384孔微孔板中的分析物溶液中，在轨道振荡条件下直接采集读数。
这些生物传感器平台各有优缺点。为了直接比较这些仪器获取高质量动力学数据的能力，所述方案通过采用相同的检测模式和相同高质量的试剂，来表征符合简单1:1分子相互作用模型的抗体-抗原动力学。

图1展示了来自CFM的抗体阵列图像以及两种固定方法下 spotted mAb 的水平，图2展示了在MX96上对这些mAb阵列进行多循环动力学和单循环动力学测量所生成的相应结合传感图。在四种生物传感器平台上，由多个抗体包被表面生成的实时结合曲线及动力学拟合曲线如图3-6所示。图7展示了通过对这些结合曲线进行全局分析所获得的最终动力学速率和平衡结合常数的比较结果。各个关联（ka）、解离（kd）和平衡（KD）结合常数列于表1中。为展示在同一仪器内生成数据集的变异性，图8展示了在不同mAb表面密度下ka、kd和KD的分布图，图9进一步比较了不同生物传感器平台间mAb表面计算结合活性的结果。
<img alt="SPR检测；显示单克隆抗体浓度-反应关系的曲线图；带有标记孔位的微阵列图像。" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 通过IBIS MX96中的CFM打印制备的胺偶联（A）和Fc捕获（B）抗体表面的多重配体阵列。 打印阵列的图像如图所示 左侧 面板中，红色方框包围的灰色区域表示抗体的存在。位于活性抗体斑点之间的较暗的间隔区域用于参考减除。每列包含以图像下方和左侧所示滴定浓度打印的抗体。通过计算活性位点与参考位点之间整体位移的差异，得出打印抗体的量，结果如图所示。 右侧 面板 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="表面等离子共振图，显示蛋白质相互作用分析中响应值随时间的变化。" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. IBIS MX96 系统中多循环（A）与单循环（B）动力学实验实时结合传感图的比较。在每段相应传感图上方标注了在 10 × 8 抗体阵列上依次注入的递增浓度人源 PCSK9。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Biacore T100 传感器图谱，单克隆抗体结合动力学，表面等离子体共振分析。" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3. Biacore T100 中捕获抗体与人 PCSK9 结合的传感图谱及 1:1 动力学模型拟合叠加图。 相互作用在高密度（上图）、中等密度（中图）和低密度（下图）表面条件下进行评估。叠加的平滑黑线表示在不同人 PCSK9 浓度（彩色线条）下，结合响应信号按 1:1 相互作用模型进行的动力学拟合结果。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质相互作用分析、单克隆抗体结合亲和力的传感图谱、ProteOn XPR36 结果。" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4. 捕获抗体与人 PCSK9 结合的传感图谱及 ProteOn XPR36 上 1:1 动力学模型拟合叠加图。 相互作用在高密度（上图）、中密度（中图）和低密度（下图）表面条件下进行评估。叠加的平滑黑线表示在不同人 PCSK9 浓度（彩色线）下的结合响应信号，按照 1:1 相互作用模型进行的动力学拟合结果。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Octet RED384 结合曲线、单抗动力学、传感器图数据、免疫分析结果、图表结果。" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5. Octet RED384 中捕获抗体与人 PCSK9 相互作用的结合传感器图及 1:1 动力学模型拟合叠加图。该相互作用在高密度（上图）、中密度（中图）和低密度（下图）表面条件下进行评估。叠加的红色曲线表示在不同人 PCSK9 浓度下的结合响应信号（彩色曲线）按 1:1 相互作用模型进行的动力学拟合结果。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IBIS MX96 结合实验结果，伯胺偶联和 Fc 捕获的微阵列传感器图谱。" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6. 在 IBIS MX96 上，伯胺偶联（A）和 Fc 捕获（B）抗体与人 PCSK9 结合的传感器图谱及 1:1 动力学模型拟合叠加图。 结合曲线按照 图 1 中的阵列板图排列为 10 × 8 的图示面板。黑色线条表示在不同浓度人 PCSK9 条件下记录的结合响应信号，叠加的红色线条表示拟合曲线。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="动力学分析图，显示10种单克隆抗体的结合速率（ka、kd）和亲和力（KD）；数据比较。" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7. 四种生物传感器平台测得的结合动力学参数——关联速率常数 ka（A）、解离速率常数 kd（B）和平衡解离常数 KD（C）的比较。 动力学参数来源于对图3至图6中结合曲线的全局分析。各仪器表示如下：Biacore T100（蓝色）、ProteOn XPR36（绿色）、Octet RED384（红色）、IBIS MX96，胺偶联（紫色）和IBIS MX96，Fc捕获（橙色）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="表面等离子体共振（SPR）中抗体捕获密度与动力学常数（kon, koff, KD）关系的动力学分析图" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 8"> 
图 8. Biacore T100（A）、ProteOn XPR36（B）、Octet RED384（C）、IBIS MX96 胺偶联（D）和 IBIS MX96 Fc 捕获（E）系统中，多种抗体表面密度下动力学速率常数一致性的比较。动力学参数 ka（上子图）、kd（中子图）和 KD（下子图）均通过单个抗体表面密度的群体分析获得。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="四种生物传感器系统中单克隆抗体表面活性的百分比柱状图比较：Biacore、ProteOn、Octet、IBIS。" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9. 四种生物传感器平台中抗体表面的结合活性及其标准差（误差线）。 数值根据相关研究文献中描述的公式计算得出17。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>ka</td>
			<td>kd</td>
			<td>KD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(M-1s-1)</td>
			<td>(s-1)</td>
			<td>(nM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 1</td>
			<td>11.7 (7.8) x 105</td>
			<td>4.89 (4.18) x 10-5</td>
			<td>0.052 (0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 2</td>
			<td>1.53 (0.28) x 105</td>
			<td>1.30 (1.54) x 10-5</td>
			<td>0.092 (0.12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 3</td>
			<td>11.4 (8.3) x 105</td>
			<td>27.6 (11.0) x 10-5</td>
			<td>0.333 (0.20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 4</td>
			<td>3.61 (1.6) x 105</td>
			<td>20.1 (12.3) x 10-5</td>
			<td>0.659 (0.54)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 5</td>
			<td>0.59 (0.21) x 105</td>
			<td>3.46 (2.50) x 10-5</td>
			<td>0.663 (0.46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 6</td>
			<td>1.19 (0.78) x 105</td>
			<td>7.21 (3.83) x 10-5</td>
			<td>0.894 (0.64)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 7</td>
			<td>1.29 (0.53) x 105</td>
			<td>16.4 (5.63) x 10-5</td>
			<td>1.57 (1.02)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 8</td>
			<td>4.02 (2.23) x 105</td>
			<td>22.8 (10.7) x 10-5</td>
			<td>0.768 (0.68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 9</td>
			<td>4.20 (2.13) x 105</td>
			<td>6.67 (4.3) x 10-5</td>
			<td>0.197 (0.16)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 10</td>
			<td>1.20 (0.49) x 105</td>
			<td>12.5 (7.64) x 10-5</td>
			<td>1.27 (0.80)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 通过四种生物传感器仪器获得的结合曲线，采用1:1相互作用模型进行全局拟合，得到10种单克隆抗体的动力学速率和平衡结合常数。

本文介绍了使用四种常用生物传感器平台测定抗体-抗原结合亲和力和动力学的实验方案。

无标记光学生物传感器是药物发现中用于表征生物分子相互作用的有力工具。在本研究中，我们描述了……

本项生物传感器研究的目的是比较四种常规使用的生物传感器平台在提供高质量动力学数据方面的能力，并针对评估高亲和力抗体-抗原相互作用的实验设计中的技术挑战和注意事项提供见解。该研究回答了药物发现领域中关于生物传感器平台及检测方法选择的关键问题，以在评估治疗性抗体候选分子时获得最可靠的结果。本研究的主要优势在于，对不同生物传感器平台在数据一致性、数据质量以及操作效率方面进行了直接且全面的比较。四种实验方案的视频演示至关重要，有助于缺乏实际操作经验的新用户学习如何在这些仪器上设置实验。在 Biacore T100 中进行动力学测量时，单击“文件”，选择“新建方法”，然后打开方法文件，并检查其中的参数设置。在循环类型中，设置捕获1在流路2上的接触时间为220秒，捕获2在流路3上的接触时间为110秒，捕获3在流路4上的接触时间为55秒。所有捕获循环的流速均为10 µL/min。选择样品1，并将样品溶液设为变量。然后，将结合时间设置为600秒，解离时间设置为2,700秒，流经通道1、2、3、4，流速设为30微升/分钟。接下来，选择再生步骤1，在溶液字段中输入甘氨酸盐酸盐（pH 1.5），并将接触时间设置为20秒，流经通道1、2、3、4。在变量设置中，为第1-3个循环输入从100纳摩尔到6.25纳摩尔的两倍梯度浓度，为第4-8个循环输入从50纳摩尔到3.12纳摩尔的两倍梯度浓度，为第9-10个循环输入从5纳摩尔到0.323纳摩尔的两倍梯度浓度。在运行设置中，选择检测流路2-1、3-1、4-1，然后单击下一步。勾选运行前预冲洗，然后再次单击下一步。选择样品和试剂架1，并定义试剂的位置。根据需要将试剂移液至各个样品瓶中，然后将试剂架插入仪器。单击“弹出试剂架”以打开样品托盘舱门，随后将样品架插入仪器中。然后点击“开始”，输入实验名称以保存并启动运行。在 ProteOn XPR36 上进行动力学检测时，首先选择“程序”和“样品”以开始固定化。在 H1–H6 孔中设定 EDC/Sulfo-NHS 为活化剂，G1–G6 孔中设定蛋白 A/G 为配体，F1–F6 孔中设定乙醇胺为封闭剂，E1–E6 孔中设定甘氨酸为再生液，D1–D6 孔中设定 PBS-T-EDTA 为空白对照，C1–C6 孔中设定单克隆抗体 X 样品为配体，B1–B6 孔中设定人 PCSK9 为分析物。选择“步骤”，然后在方案编辑器中双击“固定化”。这些步骤包括依次进行的三次水平注射：EDC/Sulfo-NHS、蛋白A/G，以及一摩尔乙醇胺。每次注射的流速应为30微升每分钟，接触时间为300秒。接下来，点击“重新生成”。在水平和垂直方向上，均以每分钟100微升的速度注入三次持续18秒的甘氨酸脉冲。随后，在两个方向上均以每分钟25微升的速度注入两次持续60秒的PBS-T-EDTA脉冲。然后，点击“配体”（Ligand），以25微升/分钟的流速和160秒的接触时间，垂直方向注入单克隆抗体1和单克隆抗体2。点击“分析物”（Analyte）后，在空白缓冲液中同时向六个水平通道注入五种浓度的人PCSK9，流速为40微升/分钟，结合时间为600秒，随后进行2,700秒的解离阶段。然后，点击“再生”并以每分钟100微升的速度在水平和垂直方向各注入两段18秒的甘氨酸脉冲。接着，根据预先设定的试剂位置，在一个96孔板中准备样品和试剂。将该板转移至仪器中，然后点击“运行”选项卡，选择实验程序并点击“开始”。展示了在记录活体实验数据时的六针平行注射操作。在 Octet RED384 中进行动力学测定时，首先在数据采集软件中点击 Experiment，然后依次点击 New Experiment Wizard、New Kinetics Experiment，再选择 Basic Kinetics，以设置实验方法。接着点击 Modify Plates，将 Plate 1 和 Plate 2 中的 96 Wells 均更改为 384 Wells。按照文本方案中的描述定义样品类型及在孔板中的位置。进入检测定义界面以设定实验方案。实验方案定义如下：30秒的基线时间、30秒的再生时间、18秒的平衡时间、200秒的上样时间、500秒的结合时间以及1,800秒的解离时间。振荡速度设定为 1,000 RPM。要将步骤添加到检测步骤列表中，首先单击一个步骤，然后单击位于样品板或试剂板中的相应孔。首先输入平衡再生指令，通过在甘氨酸中浸入15秒、再在1XKB中浸入15秒，重复三个循环，对抗人Fc捕获传感器进行预处理。然后，输入上样指令，将单克隆抗体样本固定在抗人 Fc 捕获传感器上，孵育 200 秒。接着，输入基线指令，在结合步骤前将传感器置于缓冲液中 60 秒，以建立生物膜层干涉信号基线。输入结合步骤指令，将传感器浸入含有不同浓度人 PCSK9 的孔中，进行持续 500 秒的结合反应。进入解离步骤，将结合了PCSK9的传感器浸入含有1XKB的新孔中，进行持续1,800秒的解离。最后，在再生步骤中，将结合了单克隆抗体PCSK9的传感器浸入含有甘氨酸的孔中，在每个结合循环之间使用两次18秒脉冲进行再生。进入“查看实验”界面，滑动浏览各步骤，然后点击绿色开启按钮以打开样品舱。将样本板转移至仪器中。进入“运行实验”界面，设置60秒延迟时间，并在等待期间振荡样本板。将板温设置为25摄氏度，输入实验运行名称，然后点击“开始”。此处显示实时数据采集。在 IBIS-MX96 中进行多循环动力学检测时，将传感器芯片安装至连续流式微阵列点样仪中。打开 CFM2.0 软件，点击“Load Settings”，然后选择“96 Amine Couple”。将两个样品板和试剂板放入 CFM 打印仪中。为制备抗体芯片，点击“运行”以启动打印机，通过48个微通道将试剂板上半部分的EDC/Sulfo-NHS输送至传感器，并在传感器表面循环反应5分钟。随后，将源板上半部分的单克隆抗体样品输送至传感器，使其在活化表面循环10分钟。接着，从50毫升锥形管中输送固定化缓冲液至抗体表面，循环5分钟。将打印好的传感器芯片装入仪器中。在控制软件中，依次点击文件、打开测量、现有测量，并选择方法文件。将打印好的传感器芯片转移至仪器内。在主菜单中，选择“完整系统脚本”下的 G-System Prime。然后，选择 G-Quench，通过注入 150 µL 1 M 乙醇胺使单克隆抗体表面失活。在分析循环中，选择 IBIS 脚本下的 A-AP 标准运行。设定1.0分钟的基线期，10.0分钟的结合期，以及以每秒八微升流速进行90步的解离期。在循环过程中，每次结合周期先进行五次缓冲液进样，随后依次注入一个浓度的人源PCSK9。每次结合周期之间，使用甘氨酸再生单克隆抗体表面。四种仪器中，抗体与人PCSK9相互作用的一对一动力学模型拟合叠加图显示了记录的结合传感图。各仪器间，抗体在多种密度下的结合谱相似。尽管各仪器测得每种抗体相关的速率常数有所不同，但其排序基本保持一致。研究了多种抗体表面动力学速率亲和力的可重复性和一致性。如图所示，使用Biacore T100和ProteOn XPR36生成的所有速率常数均表现出良好的线性关系。然而，Octet RED384生成的速率常数线性较差，这归因于部分解离速率存在波动。这可能是由于微孔板中样品随时间推移发生蒸发所致。由于表面异质性的波动，IBIS-MX96 生成的速率常数线性度也较低。大多数系统的抗体结合活性保持一致，而 IBIS-MX96 上的胺偶联方法则观察到大约低十倍的活性。这可能是由于抗体失活，或产生了不利于抗原结合的抗体取向所致。观看本视频后，您应能够充分了解如何在四种生物传感器平台中分别设置实验，以及如何为自己的研究目的选择合适的生物传感器技术。我们的直接比较研究表明，每种生物传感器平台均有其各自的优势与局限性。尽管这些仪器在设计上存在某些固有的系统性局限，但它们在结合与解离速率常数的直接测定顺序上具有高度相关性。就候选分子的排序而言，假设样品数量和材料用量并非限制因素，则可使用其中任意一种仪器，因为它们均能以相似的分辨能力区分抗体，而不受具体仪器类型的影响。数据可靠性与样品通量之间存在权衡。Biacore T100 和 ProteOn XPR36R 表现出最佳的数据质量和一致性，其中 Biacore T100 紧随其后。而 Octet RED384 和 IBIS-MX96 虽然在灵活性和通量方面表现较高，但在数据准确性和一致性方面有所妥协。对于需要高灵敏度和可靠检测的研究，Biacore T100 或 ProteOn XPR36 均为最合适的选择。对于速度至关重要且涉及大量样本的研究，优先选择 Octet Red384 或 IBIS-MX96。采用连续流动液体 X 的仪器可提供高质量数据，适用于解析解离速率较慢的相互作用。BRI 液体外排装置的主要局限性在于微孔板中样品随时间推移可能发生蒸发，导致信号上漂，从而影响数据的准确性。

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