利用四种生物传感器平台测定高亲和力抗体-抗原结合动力学

本项生物传感器研究的目的是比较四种常规使用的生物传感器平台在提供高质量动力学数据方面的能力，并针对评估高亲和力抗体-抗原相互作用的实验设计中的技术挑战和注意事项提供见解。该研究回答了药物发现领域中关于选择生物传感器平台和检测方法的关键问题，以在评估治疗性抗体候选分子时获得最可靠的结果。本研究的主要优势在于，对不同生物传感器平台在数据一致性、数据质量以及操作效率方面进行了直接且全面的比较。

四种实验方案的视频演示至关重要，有助于缺乏实际操作经验的新用户学习如何在这些仪器上设置实验。在 Biacore T100 中进行动力学测量时，点击“文件”，选择“打开新方法”，然后打开方法文件，并仔细检查其中的参数设置。

在循环类型中，设置捕获1在流路2上的接触时间为220秒，捕获2在流路3上的接触时间为110秒，捕获3在流路4上的接触时间为55秒。所有捕获循环的流速均为10 µL/min。选择样品1，并将样品溶液设为变量。

然后，将结合时间设置为600秒，解离时间设置为2,700秒，流经通道1、2、3、4，流速设为30微升/分钟。接下来，选择再生步骤1，在溶液栏中输入甘氨酸盐酸盐（pH 1.5），并将接触时间设置为20秒，流经通道1、2、3、4。

在变量设置中，输入循环1-3的两倍梯度稀释浓度，范围为100纳摩尔至6.25纳摩尔；循环4-8为50纳摩尔至3.12纳摩尔；循环9-10为5纳摩尔至0.323纳摩尔。在运行设置中，选择检测流路2-1、3-1、4-1，然后点击下一步。勾选运行前预润洗，再次点击下一步。

选择样品和试剂架1，并定义试剂的位置。根据需要将试剂移液至各个样品瓶中，然后将试剂架插入仪器。单击“弹出架”以打开样品托盘舱门，随后将样品架插入仪器中。

然后点击“开始”，输入实验名称以保存并启动运行。在 ProteOn XPR36 中进行动力学检测时，依次选择“程序”和“样品”以开始固定化。将 EDC/Sulfo-NHS 定义为 H1-H6 孔中的活化剂，蛋白 A/G 为 G1-G6 孔中的配体，乙醇胺为 F1-F6 孔中的封闭剂，甘氨酸为 E1-E6 孔中的再生液，PBS-T-EDTA 为 D1-D6 孔中的空白对照，单克隆抗体 X 样品为 C1-C6 孔中的配体，人 PCSK9 为 B1-B6 孔中的分析物。

选择步骤，然后在协议编辑器中双击固定化。这些步骤包括连续三次水平注射 EDC/Sulfo-NHS、蛋白 A/G 和一摩尔乙醇胺。每次注射的流速应为 30 微升每分钟，接触时间为 300 秒。

接下来，点击“重新生成”。在水平和垂直方向上，均以每分钟100微升的速度注入三次持续18秒的甘氨酸溶液。随后，在两个方向上均以每分钟25微升的速度注入两次持续60秒的PBS-T-EDTA溶液。

然后，点击“配体”（Ligand），以每分钟 25 微升的流速和 160 秒的接触时间，垂直方向注入单克隆抗体 1 和单克隆抗体 2。点击“分析物”（Analyte）后，在空白缓冲液中同时向六个水平通道注入五种不同浓度的人源 PCSK9。以每分钟 40 微升的流速进行 600 秒的结合反应，随后进行 2,700 秒的解离反应。

然后，点击“再生”按钮，并以每分钟100微升的速度在水平和垂直方向各注入两次持续18秒的甘氨酸脉冲。接下来，根据规定的试剂位置，在一个96孔板中准备样品和试剂。将该板转移至仪器中，然后点击“运行”选项卡，选择相应的实验方案，再点击“开始”。

展示了在记录活体实验数据时使用六针平行进样。在 Octet RED384 中进行动力学测定时，首先在数据采集软件中点击 Experiment，然后依次点击 New Experiment Wizard、New Kinetics Experiment，再选择 Basic Kinetics，以设置实验方法。接着点击 Modify Plates，并将 Plate 1 和 Plate 2 中的 96 Wells 均更改为 384 Wells。

按照文本方案中的描述定义样品类型及在孔板中的位置。进入检测定义界面以设定实验方案。实验方案定义为：30秒的基线时间、30秒的再生时间、18秒的平衡时间、200秒的上样时间、500秒的结合时间以及1,800秒的解离时间。

振荡速度设定为 1,000 RPM。要将步骤添加到检测步骤列表中，首先点击一个步骤，然后点击位于样品板或试剂板中的孔。首先输入平衡再生指令，通过在甘氨酸中浸入15秒并交替在1XKB中浸入15秒，重复三个循环，以预处理抗人Fc捕获传感器。

然后，输入加载指令，将单克隆抗体样本固定在抗人 Fc 捕获传感器上，孵育 200 秒。接着，输入基线指令，在结合步骤前建立 60 秒的生物膜层干涉信号基线。输入结合步骤，将传感器浸入含有不同浓度人 PCSK9 的孔中，进行 500 秒的结合反应。

进入解离步骤，将结合了PCSK9的传感器浸入新的1XKB孔中，进行持续1,800秒的解离。最后，在再生步骤中，将结合了单克隆抗体PCSK9的传感器浸入含有甘氨酸的孔中，并在每个结合循环之间施加两次持续18秒的脉冲。进入“查看实验”界面，滑动浏览各步骤，然后点击绿色打开按钮以打开样品室。

将样品板转移至仪器中。进入“运行实验”界面，设置60秒延迟时间，并在等待期间振荡样品板。将板温设置为25摄氏度，输入实验运行名称，然后点击“开始”。此处显示实时数据采集。

在 IBIS-MX96 中进行多循环动力学检测时，将传感器芯片安装至连续流式微阵列点样仪中。打开 CFM2.0 软件，点击“加载设置”，选择“96 个胺偶联”程序。将样品板和试剂板放入 CFM 打印仪中。

为制备抗体芯片，点击运行以启动打印机，通过48个微通道将试剂板上半部分的EDC/Sulfo-NHS输送至传感器，并在传感器表面循环反应5分钟。随后，将源板上半部分的单克隆抗体样品输送至传感器，使其在活化表面循环反应10分钟。接着，从50毫升锥形管中将固定化缓冲液输送至抗体表面，循环处理5分钟。

将打印好的传感器芯片装入仪器中。在控制软件中，依次点击文件、打开测量、现有测量，并选择方法文件。将打印好的传感器芯片转移至仪器内。

在主菜单中，选择“完整系统脚本”下的 G-System Prime。然后，选择 G-Quench，通过注入 150 µL 1 M 乙醇胺使单克隆抗体表面失活。在分析循环中，选择 IBIS 脚本下的 A-AP 标准运行。

设定1.0分钟为基线期，10.0分钟为结合期，90步为解离期，流速为每秒八微升。在循环过程中，每次注入一种浓度的人PCSK9，每次结合循环前进行五次缓冲液注入。每次结合循环后，使用甘氨酸再生单克隆抗体表面。

四种仪器上，抗体与人PCSK9相互作用的结合传感器图谱在一对一动力学模型拟合叠加图中显示。在不同仪器上，抗体在多个密度下的结合曲线相似。尽管各抗体相关的速率常数在不同仪器间有所差异，但其排序基本保持一致。

研究了多种抗体表面动力学速率中亲和力的可重复性和一致性。如图所示，使用Biacore T100和ProteOn XPR36生成的所有速率常数均表现出良好的线性关系。然而，由于部分解离速率存在波动，Octet RED384生成的速率常数线性较差。

这可能是由于样品在微孔板中随时间推移发生蒸发所致。IBIS-MX96 生成的速率常数也因表面异质性的波动而线性较差。大多数系统的抗体结合活性保持一致，而 IBIS-MX96 上的胺偶联方法观察到的活性则大约低十倍。

这可能是由于抗体失活，或产生了不利于抗原结合的抗体取向所致。观看本视频后，您应能够充分理解如何在四种生物传感器平台中分别建立实验，以及如何为自己的研究目的选择合适的生物传感器技术。我们的直接比较研究表明，每种生物传感器平台都有其自身的优缺点。

尽管这些仪器在设计上存在某些固有的系统性局限，但它们在直接测定结合与解离速率常数的顺序方面具有高度相关性。在进行候选分子排序时，假设样品数量和材料用量并非限制因素，则可使用其中任何一种仪器，因为这些仪器在区分抗体性能方面具有可比性，且不受具体仪器型号的影响。数据可靠性与样品通量之间存在权衡。

Biacore T100 和 ProteOn XPR36R 表现出最佳的数据质量和一致性，其中 Biacore T100 紧随其后。而 Octet RED384 和 IBIS-MX96 虽然在灵活性和通量方面表现较高，但在数据准确性和一致性方面有所妥协。对于需要高灵敏度和可靠检测的研究，Biacore T100 或 ProteOn XPR36 均为最合适的选择。

对于速度是关键因素且涉及大量样本的研究，优先选择 Octet Red384 或 IBIS-MX96。采用连续流动液体 X 的仪器可提供高质量数据，适用于解析解离速率较慢的相互作用。BRI 液体 ex-a-fray 仪器的主要局限性在于微孔板中样品随时间发生的蒸发，可能导致信号上漂，影响数据准确性。