高亲和力抗体 - 抗原的结合动力学的测定，使用四个生物传感器平台

这项生物传感器研究的目的是比较四种常规使用的生物传感器平台提供高质量动力学数据的能力，并提供有关评估高亲和力抗体-抗原相互作用的实验设计中的技术挑战和注意事项的见解。本研究回答了药物发现领域中关于选择生物传感器平台和检测形式的关键问题，以便在评估治疗性抗体候选物时获得最可靠的结果。这项研究的主要优点是它提供了各种生物传感器平台在数据一致性、质量和作效率方面的直接和全面比较。

这四种方案的视频演示至关重要，因为它可以帮助实践经验较少的新用户学习如何在这些仪器上设置实验。对于 Biacore T100 中的动力学测量，请单击文件、打开新方法，然后打开方法文件。查看方法中的参数。

在 Cycle Types（循环类型）中，将捕获 1 的接触时间设置为 220 秒（流路 2）、捕获 2 的接触时间 110 秒（流路 3）和 55 秒（捕获 3 的流路 4）。所有捕获周期的流速均为 10 μL/min。选择 Sample 1 （样本 1） 并选中 Sample solution （样本溶液） 作为变量。

然后，将流路 1、2、3、4 上的接触时间设置为 600 秒，解离时间设置为 2， 700 秒。流速设置为每分钟 30 微升。接下来，选择"再生 1"，在溶液字段中输入盐酸甘氨酸 pH 值 1.5，并将流路 1、2、3、4 上的接触时间设置为 20 秒。

在"可变设置"中，输入两倍滴定浓度，即 100 纳摩尔至 6.25 纳摩尔（第 1-3 个循环），50 纳摩尔至 3.12 纳摩尔（循环 4-8）和 5 纳摩尔至 0.323 纳摩尔（循环 9-10）。在 Setup Run（设置运行）中，选择检测流路 2-1、3-1、4-1，然后单击 Next（下一步）。选中 prime before run（运行前的 prime），然后再次单击 Next（下一步）。

选择 Sample and Reagent Rack 1 并定义试剂的位置。将试剂相应地移液到各个样品瓶中，然后将支架插入仪器。单击 Eject Rack（弹出架）打开样品盘隔间门，然后将样品架插入仪器。

然后单击 Start 并输入要保存的实验名称以开始运行。对于 ProteOn XPR36 中的动力学测量，通过选择 Protocols（方案）和 Samples（样品）开始固定。将 EDC/Sulfo-NHS 定义为 H1-H6 孔中的激活剂，将蛋白 A/G 定义为 G1-G6 中的配体，乙醇胺在 F1-F6 中定义为钝化剂，甘氨酸在 E1-E6 中作为再生剂，PBS-T-EDTA 在 D1-D6 中定义为空白，单克隆抗体 X 样品在 C1-C6 中定义为配体，人 PCSK9 在 B1-B6 孔中作为分析物。

选择 Steps（步骤），然后双击方案编辑器中的 Immobilization（固定化）。这些步骤包括随后的三次水平进样 EDC/Sulfo-NHS、蛋白 A/G 和一次摩尔乙醇胺。每次注射的流速应为每分钟 30 微升，接触时间为 300 秒。

接下来，单击 Regenerate（重新生成）。以每分钟 100 微升的速度在水平和垂直方向上注入三个 18 秒的甘氨酸脉冲。然后以每分钟 25 微升的速度进行两个 60 秒的 PBS-T-EDTA 脉冲，也是双向的。

然后，单击配体并垂直方向注射单克隆抗体 1、单克隆抗体 2，流速为每分钟 25 微升，接触时间为 160 秒。单击分析物后，在空白缓冲液中同时通过 6 个水平通道注入 5 种浓度的人 PCSK9。使用 40 μL/min，保持 600 秒的缔合时间，然后是 2， 700 秒的解离时间。

然后，单击 Regenerate（再生），以每分钟 100 微升的速度在水平和垂直方向上注入两个 18 秒的甘氨酸脉冲。接下来，根据定义的试剂位置在一个 96 孔板中制备样品和试剂。将板转移到仪器上，然后单击 Run（运行）选项卡，选择方案，然后单击 Start（开始）。

演示了实时实验数据记录中的六针平行注射。对于 Octet RED384 中的动力学测量，首先在数据采集软件中单击实验，然后单击新实验向导、新动力学实验和基本动力学来设置实验方法。然后单击"修改板"，并将板 1 和板 2 中的 96 孔更改为 384 孔。

如文本协议中所述，定义板中的样品类型和位置。导航到分析定义以定义实验设置。实验装置定义为基线时间为 30 秒，再生时间为 30 秒，平衡时间为 18 秒，加载时间为 200 秒，缔合时间为 500 秒，解离时间为 1， 800 秒。

摇动速度设置为 1， 000 RPM。要将步骤添加到检测步骤列表中，首先单击一个步骤，然后单击位于样品或试剂板中的孔。首先，输入平衡再生指令，通过在甘氨酸中浸泡 15 秒和在 1XKB 中交替浸泡 15 秒的三个周期来预处理抗人 Fc 捕获传感器。

然后，输入上样说明，将单克隆抗体样品捕获到抗人 Fc 捕获传感器上 200 秒。接下来，输入基线说明，在关联步骤前 60 秒建立生物膜干涉测量信号。输入关联步骤，将传感器浸入含有不同浓度人 PCSK9 的孔中，持续 500 秒的关联期。

进入解离步骤，将 PCSK9 结合的传感器浸入 1XKB 的新孔中，解离时间为 1， 800 秒。最后，对于再生步骤，将单克隆抗体 PCSK9 结合的传感器浸入甘氨酸孔中，每个结合循环之间有两个 18 秒的脉冲。转到 Review Experiments （查看实验），滑动完成步骤，然后单击绿色的 open 按钮以打开样品隔室。

将样品板转移到仪器中。导航到 Run Experiments （运行实验），输入 60 秒的延迟时间，并在等待时摇动样品板。将板温度设置为 25 摄氏度，输入实验运行名称，然后按 Go.Live 数据收集在此处显示。

对于 IBIS-MX96 中的多周期动力学测量，请将传感器芯片安装到连续流微点剂中。打开 CFM2.0 软件，然后单击 Load Settings（加载设置）和 96 Amine Couple（96 胺耦合）。将两个样品板和试剂板放入 CFM 打印机中。

要创建抗体阵列，请点击"运行"以启动打印机，并使用 48 个微通道将试剂板上半部分的 EDC/Sulfo-NHS 输送到传感器，并在传感器表面循环 5 分钟。将源板上半部分的单克隆抗体样品输送到传感器，并在活化的表面循环 10 分钟。然后，将固定缓冲液从 50 mL 锥形管中输送到抗体表面 5 分钟。

将打印的传感器芯片对接到仪器中。在控制软件中，单击 File（文件）、Open measurement（打开测量）、Existing measurement（现有测量），然后选择方法文件。将打印好的传感器芯片转移到仪器中。

在常规菜单中，选择 Full system script 下的 G-System Prime。然后，选择 G-Quench，通过注射 150 μL 1 摩尔乙醇胺来灭活单克隆抗体表面。在分析周期中，选择 IBIS 脚本下的 A-AP 标准运行。

以每秒 8 微升的速度将基线设置为 1.0 分钟，将关联设置为 10.0 分钟，将解离设置为 90 步。在循环内，在缓冲液注射 5 次后，一次注射一种浓度的人 PCSK9。在每个结合循环之间用甘氨酸再生单克隆抗体表面。

显示了在四种仪器中与人 PCSK9 相互作用的抗体在一对一动力学模型拟合叠加中记录的结合传感图。多种密度抗体的结合谱在仪器中相似。尽管与每种抗体相关的速率常数因仪器而异，但它们的等级顺序基本相同。

研究了多个抗体表面动力学速率亲和力的重现性和一致性。如图所示，使用 Biacore T100 和 ProteOn XPR36 生成的所有速率常数均具有很强的线性度。然而，由于某些关闭率的波动，Octet RED384 生成的速率常数的线性度较低。

这可能是由微孔板中样品随时间蒸发引起的。由于表面异质性的波动，IBIS-MX96 产生的速率常数的线性度也较低。与大多数系统相关的抗体结合活性是一致的，而观察到 IBIS-MX96 的胺偶联方法的活性低约 10 倍。

这可能是由于抗体失活，或产生不利于抗原结合的抗体方向。观看本视频后，您应该对如何在四个生物传感器平台中分别设置实验以及如何根据自己的研究目的选择合适的生物传感器技术有一个很好的了解。我们的头对头比较研究表明，每个生物传感器平台都有自己的优点和缺点。

尽管仪器存在某些固有的系统局限性，但这些仪器之间缔合常数和解离速率常数的直接顺序高度相关。为了进行候选药物排名，假设样品数量和材料数量不是限制因素，可以使用这些仪器中的任何一种，因为它们可以比较地区分抗体，而与进口仪器无关。数据可靠性和样品通量之间存在权衡。

Biacore T100 和 ProteOn XPR36R 表现出最佳的数据质量和一致性。而 Octet RED384 和 IBIS-MX96 表现出高灵活性和吞吐量，但在数据准确性和一致性方面有所妥协。对于需要灵敏可靠检测的研究，Biacore T100 或 ProteOn XPR36 是最佳选择。

对于速度是关键因素且涉及大量样品的研究，首选 Octet Red384 或 IBIS-MX96。配备连续流液 X 的仪器为解析慢解离速率的相互作用提供了高质量的数据。BRI 流体出厂时仪器的主要限制是微孔板中的样品随时间蒸发，这可能导致向上漂移，从而影响数据准确性。