微流控成像流式细胞仪通过不对称检测时间延伸光学显微镜（ATOM）

该协议的总体目标是准备和使用不对称检测时间拉伸光学显微镜系统，用于超快微流体流中的无标记高对比度单细胞成像。ATOM 的主要优点是它允许以高达数十兆赫兹的线扫描速率进行超快速图像捕获，同时增强未标记细胞的图像对比度。ATOM 能够以高达每秒 100， 000 个细胞的速度对细胞和亚细胞结构进行非居中细胞的分析，这在标准流式细胞术中是不可能的。

要开始设置系统，请使用光纤准直器将宽带飞秒或皮秒近红外脉冲激光器耦合到连接到光放大器的单模色散光纤上。用激光照射透射衍射分级，以产生光谱淋浴。将分级定向到靠近 littrow 配置的位置，以最大限度地提高衍射效率。

在 4f 成像系统中配置伸缩式中继镜头组件，以将光谱淋浴引导到样品平台下方物镜的后焦平面上。确保光谱淋浴充满物镜的后孔径。将另一个物镜放在样品平台上方的后孔处，其后孔处有平面镜。

调整物镜，直到它们的焦平面重叠。验证 spectral shower double 是否通过图像平面并遵循相同的路径返回分级。将微流控芯片放在样品平台上，并确保光谱淋浴落在微流控通道上。

返回的光源通过放坡后，使用分束器重定向返回的光源。使用另一个分束器将返回的光分成两束。使用光纤准直器将光束耦合到不同长度的单模光纤上，以在光束之间引入时间延迟。

通过光纤耦合器和光电探测器将光纤连接到实时示波器。调整光放大器增益，直到光信号的信噪比大于 10 分贝。然后用刀口梁块状每个返回的梁块的大约一半。

调整光束块，直到每根光纤中测得的光功率约为块前功率的一半。验证示波器带宽和采样率是否都足够高，不会影响图像分辨率。实验开始时，用磷酸盐缓冲盐水或泉水将细胞样品稀释至每毫升 10 至 5 至 10 至 6 个细胞之间。

然后将细胞溶液装入 10 毫升注射器中。将注射器连接到微流体通道入口。将微流体通道出口对准离心管。

将注射器固定在注射泵中，并根据通道宽度适当设置流速。选择要为实验保存的数据点数。然后采集并保存光信号数据。

将数据从示波器数字化并导出到计算机。将数据处理成 2D 图像并从图像中提取参数库。将参数库中的图像导入到可视化程序中。

为每个轴分配一个感兴趣的参数，然后选择要显示为散点图的数据集。检查与图中每个组关联的单元格图像以确定趋势。根据需要使用手动门控或显示其他数据集以进行进一步分析。

ATOM 用于获取人类细胞和浮游植物的高对比度单细胞图像。特征性细胞结构，如液泡、类除虫和鞭毛，在浮游植物图像中可见。从 ATOM 图像中确定细胞大小和圆度等参数，以对细胞进行分类以进行细胞计数分析。

分类结果可以显示为 2D 散点图。这里绘制了 MCF7 的体积与圆度的关系图，MCF7 以黄色显示，PBMC 以红色显示。观察到 MCF7 的两个集群。

通过识别对应于单个数据点的高对比度图像，发现较低的簇对应于细胞片段和碎片。一旦掌握，如果作得当，成像系统可以在 2 到 3 小时内设置好。成像程序可以在一小时内完成。

在使用激光源和激光束对准时，不要忘记特别注意眼睛安全。在执行这些程序时，应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜。在尝试此过程时，请记住在整个成像系统设置过程中监控光束对准，以确保最佳成像质量。

虽然该技术可以深入了解疾病过程中稀有或明显细胞的检测和定量，但它也可以应用于大型和异质细胞群中的细胞类型分类。当希望克服成像细胞术的通量限制，同时保持图像质量时，这种技术特别有利。观看此视频后，您应该对如何从系统设置到成像程序实施 ATOM 有很好的了解。