基于非对称检测时间拉伸光学显微术（ATOM）的微流控成像流式细胞仪

本方案的总体目标是构建并使用一种非对称检测时间拉伸光学显微系统，用于在超快速微流控流动中实现无标记、高对比度的单细胞成像。ATOM 的主要优势在于能够以高达数十兆赫兹的线扫描速率实现超快速图像采集，同时增强未标记细胞的图像对比度。ATOM 可在每秒高达 100,000 个细胞的通量下，对细胞及亚细胞结构进行复杂的形态学分析，并支持基于未固定细胞的检测，这是传统流式细胞术无法实现的。

开始搭建系统时，使用光纤准直器将宽带飞秒或皮秒近红外脉冲激光器耦合至连接有光放大器的单模色散光纤。用激光照射透射式衍射光栅以产生光谱雨。将光栅取向调整至接近利特罗（Littrow）构型，以最大化衍射效率。

在样品平台下方，将一个望远镜式中继透镜组件配置于4f成像系统中，以将光谱束引导至物镜镜头的后焦平面。确保光谱束充满物镜镜头的后孔径。在样品平台上方，放置另一个在其后孔径处带有平面反射镜的物镜镜头。

调节物镜，直至其焦平面重合。确认光谱光束两次穿过像平面，并沿原路径返回至分光系统。将微流控芯片置于样品载台上，确保光谱光束横跨微流控通道。

在光束通过分光元件后，利用一个分束器将返回的光重新引导。使用另一个分束器将返回的光分成两束。采用光纤准直器将这两束光分别耦合到长度不同的单模光纤中，以在光束之间引入时间延迟。

通过光纤耦合器和光电探测器将光纤连接至实时示波器。调节光放大器增益，直至光信号的信噪比大于10分贝。然后使用刀口式光束挡块遮挡每束返回光约一半的光束。

调节光束挡块，直至每根光纤中测得的光功率约为挡块前光功率的一半。确认示波器的带宽和采样率均足够高，以免影响图像分辨率。开始实验时，用磷酸盐缓冲液或泉水将细胞样品稀释至每毫升10^5到10^6个细胞。

然后将细胞溶液加入10毫升注射器中。将注射器连接至微流控通道的入口。将微流控通道的出口导向离心管。

将注射器固定在注射泵上，并根据通道宽度适当设置流速。选择实验中要保存的数据点数量，然后采集并保存光学信号数据。

将示波器中的数据数字化并导出至计算机。将数据处理成二维图像，并从图像中提取参数库。将图像及参数库导入可视化程序中。

将感兴趣的参数分配给每个坐标轴，并选择要显示为散点图的数据集。检查图中各组对应的细胞图像，以识别趋势。根据需要使用手动设门或显示其他数据集进行进一步分析。

采用ATOM技术获取了人源细胞和浮游植物的高对比度单细胞图像。在浮游植物图像中，可观察到液泡、蛋白核和鞭毛等典型细胞结构。通过ATOM图像测定了细胞大小和圆度等参数，用于细胞分类及流式分析。

分类结果可以二维散点图形式展示。此处绘制了MCF7（黄色）和PBMC（红色）的体积与圆度关系图。MCF7显示出两个聚类群。

通过识别与各个数据点相对应的高对比度图像，发现较低的簇对应于细胞碎片和碎片。一旦熟练掌握，如果操作得当，成像系统可在两到三个小时内完成设置。成像程序可在一小时内完成。

使用激光光源和进行激光束准直时，切记特别注意眼部安全。执行这些操作时，应始终采取佩戴安全护目镜等预防措施。在进行该操作过程中，请务必在整个成像系统搭建过程中持续监控光束的准直情况，以确保获得最佳的成像质量。

尽管该技术可用于研究疾病过程中稀有或明显细胞的检测与定量，也可应用于大规模且异质性细胞群体中的细胞类型分类。当需要在保持图像质量的同时克服成像流式细胞术通量限制时，该技术尤为有利。观看本视频后，您应能充分理解如何从系统搭建到成像操作全过程实施ATOM技术。