Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

该方法的总体目标是创建用于研究细胞反应的固定化生物活性空间蛋白模式。该方法允许使用生物材料策略概括体内信号。该技术允许准确模拟使用标准培养方法无法实现的某些信号转导动机，例如顺序生长因子、细胞信号转导和空间特异性生化线索。

该协议对现有方法具有重要意义，因为它提供了一种调整底物刚度和蛋白质图案化的简单方法。虽然这种方法可以进一步推进组织工程和再生医学技术，但它也可以应用于研究其他系统，例如组织发育和干细胞命运。首先，在无菌条件下，如随附文本方案所述，为主要水凝胶成分聚乙二醇二丙烯酸酯、光引发剂、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂和 ECM 蛋白纤连蛋白制备储备溶液。

或储存单个等分试样之前，使用 0.22 微米针式过滤器对每种溶液进行过滤消毒。然后，用箔纸包裹 PEG-DA 溶液以保护其避光。将光引发剂原液包裹在铝箔中以保护其避光，并将制备好的溶液在 4 摄氏度下储存长达数月。

如果纤连蛋白原液是冷冻的，则让无菌等分试样在冰上解冻数小时或在 4 摄氏度下解冻过夜。首先为每个凝胶模具高压灭菌一块聚酯片材。然后，将两个载玻片浸泡在每个凝胶模具的三个塑料垫片中，在 70% 乙醇中至少两个小时。

此外，将每个凝胶模具的 5 个粘合剂夹浸泡在 70% 乙醇中 10 分钟。将载玻片、垫片和活页夹放在细胞培养通风橱中的小高压灭菌器板上，让它们风干数小时。接下来，通过将 0.5 毫米厚的塑料垫片放在载玻片的边缘周围来准备水凝胶模具。

将第二个载玻片放在顶部，然后用活页夹将垫片紧紧地固定在一起。最后，将模具放入引擎盖中，并在使用前打开紫外线灯 30 分钟，对模具进行表面消毒。灭菌过程进行到一半时，将模具翻转以露出两个表面。

按照随附文本协议的表 1 中所述创建凝胶前体溶液。然后，将 PEG-DA、纤连蛋白和光引发剂体积混合在一起，制成水凝胶。用力移液以确保溶液均匀，但要避免产生气泡。

在凝胶模具的两个载玻片之间小心地移液凝胶前体溶液。然后，将模具放在紫外线下，暴露一到两分钟以形成水凝胶。凝胶化后，取下粘合剂夹，对两侧垫片施加相反的压力，轻轻地取下顶部载玻片。

然后，使用适当大小的活检打孔器切出水凝胶样本。从矩形凝胶中打出多个水凝胶，用作重复和对照样品。将光面膜浸泡在 70% 乙醇中 10 分钟，使其消毒。

然后，让光掩模在细胞培养罩中风干。接下来，将每平方厘米 1 至 2 微升的硫醇化蛋白质溶液移液到每个切出的水凝胶的表面以进行表面图案化。将蛋白质溶液均匀地铺布在水凝胶表面以确保均匀的蛋白质固定非常重要。

小心地将光罩放在水凝胶表面。轻轻按压面膜，去除面膜和水凝胶表面之间形成的任何气泡。接下来，将水凝胶置于紫外线下，并将其暴露在第二轮紫外线下 30 至 60 秒。

用 PBS 洗涤水凝胶以去除任何未反应的物质，并将每个水凝胶放入孔板中，使图案表面朝上。然后，在 4 摄氏度的 PBS 中洗涤凝胶过夜。从孔中去除 PBS，然后向每个孔中加入 250 μL 基础 EGM2，并在 37 摄氏度下孵育凝胶 5 至 10 分钟。

在孵育过程中，胰蛋白酶使用标准技术将一板接近汇合的 HUVEC 消化成单细胞悬液。然后，旋转细胞悬液并小心去除上清液。重新悬浮细胞沉淀和基础 EGM2，不添加生长因子，并将一些细胞悬液添加到血细胞计数器中。

计数细胞以确定浓度。接下来，将含有 He 水凝胶的板以 300 x G 的离心力旋转 3 分钟，以确保水凝胶位于孔底部且不会漂浮。水凝胶不能漂浮在孔内至关重要。

漂浮的水凝胶会限制细胞接种的成功率，并导致水凝胶成像出现问题。将每平方厘米 75， 000 个细胞缓慢移液到每个水凝胶表面的中心，以免干扰凝胶。然后，将板放入 37 摄氏度的细胞培养箱中。

几天后，定期取出培养皿以观察响应蛋白质模式的细胞迁移。每 2 到 3 天更换 50% 的媒体。在形成水凝胶时，可以使用各种前驱体 PEG-二丙烯酸酯浓度来产生所需的基材刚度。

如图所示，20%PEG-DA 溶液与超过 100 千帕的刚度相关。同时考虑光引发剂浓度和紫外线暴露时间也很重要，因为任一变量的增加都会降低附着分子的生物活性，此处以溶酶体的生物活性表示。在水凝胶形成过程中尽量减少紫外线暴露对于维持游离丙烯酸酯官能团以进行后续的蛋白质固定反应至关重要。

水凝胶暴露在紫外光下超过 2 分钟无法产生红色的固定化蛋白质图案。此外，随着蛋白质模式的紫外线暴露增加，更多的蛋白质会与表面发生反应。如果制备正确，细胞可以在这些图案化的水凝胶底物上培养以纵它们的行为。

在这里，内皮细胞均匀接种到 VEGF 型 PEG 水凝胶的表面上。接种后两天，观察到内皮细胞向含有固定化 VEGF 的水凝胶的空间区域迁移。随着该方案的开发，研究人员可以使用它来固定任何蛋白质或肽，以探索体外细胞系统的新生物活性平台。

在尝试此程序时，重要的是要记住尽量减少光引发剂浓度和紫外线暴露时间，以保持固定分子的生物活性。观看此视频后，您应该对如何将生物活性蛋白和肽图案化到 PEG 水凝胶上、将细胞均匀接种到水凝胶上并观察随之而来的细胞反应有很好的了解。