3D Microtissues 用于可注射再生疗法和高通量药物筛选
2017年10月4日
本协议描述了通过将微细加工与 cryogelation 技术相结合的方法制备弹性3D 大孔 microcryogels。在加载与细胞, 3D microtissues 生成, 这可以很容易地注入在体内, 以促进再生治疗或组装成阵列的体外高通量药物筛选。
使用冷冻凝胶制备弹性 3D 大孔微凝胶的总体目标是促进注射再生疗法和体外高通量药物筛选。本视频介绍了制造多功能 3D 微组织并将其应用于再生疗法和药物筛选的方案。再生疗法技术改善了注射到伤口部位后的干细胞保留、存活和治疗功能。
由于易于使用和高通量筛选的潜力，药物筛选也得到了改进。一般来说，由于复杂的协议，刚接触 3D 文化的人会很挣扎。该技术简化了 3D 培养，并为研究人员提供了对所得 3D 微组织的更大控制。
协助演示这些程序的是来自我们实验室的四名研究生 周 Lyu、Liu Wei、Li Yaquian 和 You Zhifeng。用去离子水清洗 PMMA 微模板阵列芯片，以去除激光雕刻中残留的碎屑。然后，在 60 摄氏度下干燥微模板阵列芯片。
接下来，将干燥的木片在等离子清洁剂中以四人一组处理。首先，运行真空泵 2 分钟。然后，使用 18 瓦的射频功率三分钟，以增加芯片的亲水性。
现在，每 5 个芯片制备 1 毫升明胶前体溶液。将明胶溶解在 60 摄氏度的水浴中，并在冰上孵育溶液 5 分钟。稍微冷却但仍为液体后，将戊二醛彻底混合到明胶前体溶液中，最终浓度为 0.3% 戊二醛。
现在，将 200 微升准备好的溶液移液到每个芯片的上表面。使用弯曲的玻璃棒将溶液均匀地分布在芯片上。接下来，立即将加载溶液的阵列芯片转移到零下 20 摄氏度的冰箱中 16 小时进行冷冻凝胶。
第二天，将冻干机冷却至零下 40 摄氏度，持续约 30 分钟。然后，加载阵列芯片，并在真空下冻干 2 小时。在这些条件下，冰会升华，然后木片就可以使用了。
首先从芯片中收集单个微cryogel。首先将制造的微cryo凝胶阵列芯片覆盖在制造的 PDMS 顶针阵列顶部。将每个微cryo凝胶与顶针对齐。
然后将微低温凝胶阵列芯片压入阵列中，以将微低温凝胶从其孔中移出。现在，将喷射的微cryogel收集到水浴中，并在细胞过滤器的帮助下收集它们。使用一个过滤器从一个芯片中收集所有微冻凝胶。
接下来，在冰上用硼氢化钠洗涤微冷冻凝胶。让非交联醛残留物淬火约 20 分钟。然后，弃去硼氢化钠，用 5 毫升去离子水洗涤微低温凝胶 15 分钟。
在继续之前，总共进行 3 到 5 次水洗。从最后一次水洗中取出微cryogel后，使用镊子将它们从细胞过滤器转移到 35 毫米培养皿中。每个微低温凝胶集合构成一个簇。
现在，向每簇微低温凝胶中加入 50 至 70 微升去离子水，并盖上培养皿。然后，轻轻敲击培养皿以调平任何堆叠的微冷冻凝胶。然后，将微低温凝胶在零下 20 摄氏度下冷冻 4 至 16 小时。
稍后，像以前一样将它们冻干两个小时。下一步是制作 3D 微组织。首先，对微冷冻凝胶进行消毒。
然后，用胰蛋白酶收获细胞，定量其密度，并以每毫升 800 万个细胞的速度重悬于生长培养基中。接下来，将 60 微升细胞悬液移液到每簇微冻凝胶上。将培养皿保存在加湿室中，并在 37 摄氏度下孵育 2 小时，以便细胞吸收到凝胶中。
孵育后，向每个培养皿中加入 2 毫升培养基，并继续培养，每隔一天更换一次培养基。两天后，3D 微组织将形成。要将 3D 微组织注射到小鼠中，首先将它们转移到 5 毫升移液器中，然后将它们加载到细胞过滤器中以过滤培养基。
然后，将 3D 微组织重悬于 15% 明胶溶液中。在为动物准备植入后，将微组织肌肉注射到股薄肌的三个位置。每次注射应在 150 微升溶液中含有 150 块微冻凝胶。
使用带有 23 号针头的 1 毫升注射器。组装用于芯片细胞培养的微cryogel阵列后，小心地将它们放入预热的湿度室中，不要弄湿它们。然后小心地将 3 微升充分混合的细胞悬液直接分装到每个微冻凝胶孔上。
在排出溶液之前，让移液器吸头轻轻接触微低温凝胶的表面。不要在外围孔中播种。加载孔后，向每个孔中加入 10 μL 选择性培养基，并使用 96 通道液体分配器将培养基添加到外围孔中以减缓蒸发。
然后，将芯片在湿度室中培养 24 小时以形成 3D 微组织。第二天，使用 96 通道液体分配器，按浓度梯度向每个孔中加入 10 μL 药物 4 次，以完成所有 384 个孔的加入，包括 DMSO 对照。然后，继续培养 24 小时。
药物治疗 24 小时后，向每个孔中加入 4 微升刃天青储备液，并将板孵育 2 小时，让细胞代谢刃天青。为了检测细胞对刃天青的代谢，请使用读板器。收获的明胶微冻凝胶具有预定义的形状和大小。
SEM 分析表明，微低温凝胶包含互连的大孔结构，孔径在 30 至 80 微米范围内。通过在注射后培养明胶微cryo凝胶来定量评估明胶微凝胶的注射性。每毫升注射 1， 000 个，比临床可接受的 10 牛顿的力小 6 牛顿。
微低温凝胶中的干细胞在注射 5 天后保持了高活力和强大的增殖能力。使用此类细胞对小鼠肢体缺血模型进行治疗性治疗，并在手术后 28 天检查缺血肢体的生理状态。用 100， 000 个干细胞进行微组织处理改善了肢体挽救。
只有 25% 的小鼠在 28 天后表现出自发性脚趾截肢。在不同的应用中，3D 微组织阵列用于高通量药物检测。肝细胞癌细胞用阿霉素处理，非小细胞肺癌细胞用 IMMLG-8439 处理。
在这两种情况下，3D 培养都增加了耐药性。观看本视频后，您应该对如何使用可注射再生疗法或片上 3D 细胞培养阵列进行体外高通量药物筛选来制备用于芯片外 3D 培养的弹性 3D 微孔微cryo凝胶有很好的了解。这项技术为基于细胞的再生疗法和药物筛选领域的研究人员铺平了道路，以利用 3D 细胞培养，从而推动了这两个研究领域的发展。
不要忘记，使用戊二醛和硼氢化钠可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着适当的防护服和在实验室罩下工作。
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概述
本协议描述了使用冷冻凝胶技术制造弹性3D大孔微冷冻凝胶的方法。这些微冷冻凝胶可以装载细胞，用于创建再生治疗和高通量药物筛选的3D微组织。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 再生医学
- 药物筛选
背景
- 3D培养技术通常对研究人员来说复杂且具有挑战性。
- 微冷冻凝胶为组织工程提供了一个多功能平台。
- 改善干细胞的保留和存活对于有效的再生治疗至关重要。
- 高通量药物筛选可以从简化的3D培养方法中受益。
研究目的
- 简化研究人员的3D培养过程。
- 增强干细胞在再生治疗中的治疗功能。
- 使用3D微组织促进高通量药物筛选。
使用的方法
- 微制造与冷冻凝胶技术的集成。
- 将细胞装载到3D微冷冻凝胶中。
- 在体内注射微组织用于再生应用。
- 将微组织组装成阵列用于药物筛选。
主要结果
- 成功制造弹性3D大孔微冷冻凝胶。
- 注射后改善干细胞的保留和存活。
- 增强了药物筛选应用的易用性。
- 对3D微组织特性有更大的控制。
结论
- 开发的协议简化了3D培养技术。
- 微冷冻凝胶可以显著改善再生治疗结果。
- 该方法在推进高通量药物筛选方面具有前景。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the discovery-stage challenge of translating 3D cell culture into scalable, reproducible workflows for regenerative therapy and drug screening. By enabling injectable 3D microtissues with enhanced cell survival and compatibility with standard 384-well formats, it supports predictive confidence in target validation and lead identification. The method bridges early discovery and preclinical continuity through mechanistically relevant, disease-relevant systems that reduce biological risk in portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through 3D microtissues that clarify pathway functionality in regenerative contexts.
- Operational Value: Supports biological de-risking by improving stem cell retention and survival post-injection, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Enhances lead identification confidence via controlled 3D microtissue formation that models tissue-level responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by forming size- and shape-controllable 3D microtissue arrays.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through on-chip assembly in 384-multi-well format compatible with common laboratory equipment.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation by facilitating high-throughput drug screening with quantitative metabolic readouts like resazurin reduction.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrates translational continuity from discovery through preclinical validation using the mouse limb ischemia model to assess therapeutic outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports predictive de-risking by showing improved limb salvage with microtissue treatment, informing go/no-go decisions.
- Biomarker Alignment: Connects to preclinical continuity through quantifiable physiological endpoints like toe amputation rates in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification to Preclinical work, supporting hypothesis testing, assay readiness, and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling 3D microtissue formation that models complex tissue interactions.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible 3D microtissue array formation in 384-well format for scalable compound screening.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as resazurin-based metabolism assays that allow teams to compare drug conditions across wells.
- Translational Research: Connects method to preclinical continuity via demonstrated therapeutic efficacy in mouse limb ischemia model, supporting biomarker-aligned advancement.
- Enterprise Reuse: frames the method as a reusable capability for both regenerative therapy and drug screening workflows across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity through 3D microtissue models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via cryogel-based microtissue arrays in multi-well formats.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through improved preclinical predictivity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on enhanced stem cell survival and therapeutic outcomes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microfabrication, cryogelation, and 3D cell culture techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including plasma cleaners, lyophilizers, cell strainers, and plate readers for resazurin assays.
- Cross-team standardization requirements for hydrogel preparation, cell seeding density, and injection protocols across biology and engineering teams.
- Adaptation considerations across model systems, including varying cell types and drug compounds as demonstrated with hepatocellular carcinoma and NSCLC cells.
- Practical limitations supported by source material: hazardous reagents (glutaraldehyde, sodium borohydride) require proper protective garments and laboratory hood use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Fabrication of 3D Microcryogels
3:11
Injectable 3D Microtissues for Treatment of Critical Limb Ischemia
7:09
Assembly of Microtissue Array Chip for High-throughput Drug Screening
9:05
Results: Microcryogels Used as a Therapeutic and for High-throughput Drug-screening
10:31
Conclusion
