用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

利用低温凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的总体目标是促进可注射的再生治疗以及体外高通量药物筛选。本视频展示了制备多功能三维微组织并将其应用于再生治疗和药物筛选的实验方案。该再生治疗技术可提高干细胞在注射至伤口部位后的滞留率、存活率及治疗功能。

由于操作简便且具有高通量筛选的潜力，药物筛选也因此得到改进。通常，刚接触三维培养的研究人员会因复杂的实验流程而遇到困难。该技术简化了三维培养过程，使研究人员能够更有效地控制所形成的三维微组织。

参与演示这些步骤的有本实验室的四名研究生：Zhou Lyu、Liu Wei、Li Yaquian 和 You Zhifeng。用去离子水清洗PMMA微模板阵列芯片，以去除激光雕刻后残留的碎屑。随后，将微模板阵列芯片在60°C下干燥。

接下来，将干燥的芯片每四个一组放入等离子清洗机中进行处理。首先，运行真空泵两分钟。然后，使用18瓦的射频功率处理三分钟，以提高芯片的亲水性。

现在，每五个芯片配制一毫升明胶前体溶液。在60摄氏度水浴中溶解明胶，然后将溶液置于冰上孵育五分钟。待溶液稍冷却但仍为液态时，将戊二醛充分混入明胶前体溶液中，使戊二醛的终浓度为0.3%。

现在，将200微升制备好的溶液移液至每块芯片的上表面。使用弯头玻璃棒将溶液均匀地分布在芯片上。接着，立即将载有溶液的阵列芯片转移至-20摄氏度的冰箱中，冷冻16小时以进行冷冻凝胶化。

第二天，将冻干机在约30分钟内冷却至零下40摄氏度。然后装载微阵列芯片，在真空条件下冻干两小时。在此条件下，冰将发生升华，芯片即可准备用于后续实验。

首先从芯片上收获单个微冷冻凝胶。将制备好的微冷冻凝胶阵列芯片覆盖在制备好的PDMS推出针阵列上，使每个微冷冻凝胶与一个推出针对齐。

然后将微冻胶阵列芯片压入阵列中，使微冻胶从其孔穴中脱出。接着，将被推出的微冻胶收集到水浴中，并借助细胞筛网进行收集。每个芯片使用一个筛网来收集全部的微冻胶。

接下来，将微冷冻凝胶置于冰上，用硼氢化钠洗涤。使未交联的醛基残基淬灭约20分钟。然后弃去硼氢化钠溶液，并用5毫升去离子水洗涤微冷冻凝胶15分钟。

总共进行三到五次水洗后再继续操作。从最后一次水洗中取出微冻凝胶后，用镊子将其从细胞滤筛转移至35毫米的培养皿中。每一批微冻凝胶构成一个簇。

现在，向每簇微冷冻凝胶中加入 50 至 70 微升去离子水，并盖上培养皿。然后轻轻敲击培养皿，使堆叠的微冷冻凝胶分布均匀。接着，将微冷冻凝胶在 -20 °C 下冷冻 4 至 16 小时。

随后，按之前方法冻干两小时。下一步是制备三维微组织。首先，对微冻凝胶进行灭菌。

然后，用胰蛋白酶消化收集细胞，测定细胞密度，并将细胞重悬于生长培养基中，调整浓度为每毫升八百万个细胞。接着，将60微升细胞悬液滴加至每簇微冻胶上。将培养皿置于湿化 chamber 中，在37摄氏度下孵育2小时，使细胞充分吸收进入凝胶中。

孵育结束后，向每皿中加入2 mL培养基，继续培养，并每隔一天更换一次培养基。两天后，将形成3D微组织。将3D微组织注射入小鼠前，首先将其转移至5 mL移液管中，然后加载到细胞筛中以过滤培养基。

然后，将3D微组织重悬于15%的明胶溶液中。在完成动物植入前准备后，将微组织注射至股薄肌的三个部位，注射方式为肌肉内注射。每次注射应包含150个微冻凝胶，溶液体积为150微升。

使用带有23号针头的1毫升注射器。在组装好用于芯片上细胞培养的微冷冻凝胶阵列后，小心将其放入预热的湿化室中，避免沾水。然后，将3微升充分混匀的细胞悬液直接小心地分装到每个微冷冻凝胶孔中。

将移液器吸头轻轻接触微凝胶表面后再排出溶液。不要向周边孔中接种细胞。加样后，使用96通道液体分配器向每个孔中加入10 µL筛选培养基，并向周边孔中加入培养基以减缓蒸发。

随后，将芯片置于湿化培养箱中培养24小时，以形成三维微组织。次日，使用96通道液体分配器，以浓度梯度方式向每孔加入10微升药物，重复加样四次，完成全部384孔的加药，包括DMSO对照组。然后继续培养24小时。

药物处理24小时后，向每个孔中加入4 µL刃天青储备液，并将培养板孵育2小时，使细胞代谢刃天青。为检测细胞对刃天青的代谢情况，使用酶标仪进行检测。收获的明胶微冷冻凝胶具有预定义的形状和尺寸。

扫描电镜分析显示，微冻凝胶具有相互连通的大孔结构，孔径范围为30至80微米。明胶微冻凝胶的可注射性通过注射后培养进行了定量评估。每毫升1,000个微冻凝胶在低于临床可接受的10牛顿力6牛顿的条件下进行注射。

在注射后培养五天期间，微冻凝胶中的干细胞保持了较高的存活率和强大的增殖能力。利用这些细胞对小鼠肢体缺血模型进行了治疗性处理，并在术后28天检测了缺血肢体的生理状态。使用100,000个干细胞的微组织治疗显著改善了肢体挽救效果。

28天后，仅有25%的小鼠出现自发性脚趾截断。在另一项应用中，三维微组织阵列被用于高通量药物筛选。肝细胞癌细胞用多柔比星处理，非小细胞肺癌细胞用IMMLG-8439处理。

在两种情况下，三维培养均提高了耐药性。观看本视频后，您应充分了解如何制备可注射再生治疗中用于芯片外三维培养的弹性三维多孔微冷冻凝胶，或用于体外高通量药物筛选的芯片上三维细胞培养阵列。该技术为细胞治疗与药物筛选领域的研究人员利用三维细胞培养技术铺平了道路，从而推动了这两个研究领域的发展。

请注意，使用戊二醛和硼氢化钠时可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取适当的预防措施，例如穿戴合适的防护服，并在通风橱内操作。