Name: 3D Microtissues 用于可注射再生疗法和高通量药物筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T11:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学习利用低温凝胶技术制备弹性三维大孔微凝胶，构建可注射微组织用于再生治疗和高通量药物筛选。该方法简化三维培养流程，提高干细胞存活率与治疗功能。

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本工作受到国家自然科学基金（项目编号：81522022，51461165302）的资助。作者谨此感谢杜实验室全体成员提供的常规协助。

动物实验遵循清华大学生物医学分析中心动物伦理委员会批准的严格方案。在伦理委员会批准下，通过患者知情同意，从北京协和医院整形外科获取人体脂肪组织。
1. 3D 微型冷冻凝胶的制备
<ol>
	<li>微模板阵列芯片的设计与制备
	<ol>
		<li>使用商业软件设计特定几何形状的阵列，例如圆形、椭圆形、三角形或三叶形14，具体形状根据后续应用而定。 
		注意：有关再生医学的设计细节，请参见本方案第2节；有关药物筛选的设计细节，请参见本方案第3节。</li>
		<li>将设计导入激光雕刻机配套的激光雕刻软件中。根据激光雕刻机厂家推荐的激光参数设置，将导入的设计图案激光雕刻至聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板材上。</li>
		<li>用去离子水清洗微模板阵列芯片，以去除激光雕刻产生的碎屑。在60 °C下干燥芯片，并于室温下密封保存数月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微冷冻凝胶阵列芯片的制备
	<ol>
		<li>将4个微模板阵列芯片放置于样品托盘上，插入等离子清洗机中。关闭清洗机门，开启真空泵抽真空2分钟，然后开启最大射频功率（18 W），在室温下对微模板阵列芯片进行3分钟的等离子处理，以增强其亲水性。</li>
		<li>将0.06 g明胶加入1 mL去离子水中，配制成6%（wt/vol）的明胶前体溶液（足够制备5个芯片）。在60 °C水浴中加热使其充分溶解，随后在冰上孵育5分钟。</li>
		<li>向明胶前体溶液中加入3 µL戊二醛，使终浓度为0.3%，充分混匀。</li>
		<li>用移液器吸取200 µL含戊二醛的前体溶液，滴加至微模板阵列芯片的上表面。 
		注意：无论芯片设计如何，200 µL足以覆盖一个75 mm × 25 mm的芯片。当芯片表面积增大时，应按比例增加溶液用量。</li>
		<li>使用弯头玻璃棒前后刮涂2至3次，手动将溶液均匀分布于芯片表面。 
		注意：由于等离子处理后微模板芯片上的各个微孔具有亲水性，前体溶液可自动填充至每个微孔中。</li>
		<li>立即将充满前体溶液的阵列芯片置于-20 °C冰箱中冷冻16小时，以完成冷冻凝胶化过程。</li>
		<li>将冻干机预冷至-40 °C并保持30分钟。将完成冷冻凝胶化的阵列芯片放入冻干机中，在真空条件下冻干2小时。 
		注意：在冻干过程中，冷冻凝胶化阶段形成的冰晶升华，从而形成具有相互连通大孔结构的明胶微冷冻凝胶。</li>
		<li>如需用于治疗严重肢体缺血（CLI），请进入第2节；如需用于高通量药物筛选，请进入第3节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 收获单个微冷冻凝胶以形成可注射的三维微组织用于治疗严重肢体缺血
<ol>
	<li>收获单个微冻胶
	<ol>
		<li>设计用于可注射3D微组织构建的阵列（75 mm × 25 mm），包含600个直径为400 µm的圆形结构，使用商业软件进行设计。按照1.1节所述，采用300 µm厚的PMMA材料制备微模板阵列芯片。</li>
		<li>按照第1.2节的方法制备微冷冻凝胶阵列芯片。</li>
		<li>采用标准软光刻技术，制备与步骤2.1.1相同设计的PDMS顶出针阵列16,17.</li>
		<li>将微冷冻凝胶阵列芯片覆盖在PDMS弹射针阵列上，使每个微冷冻凝胶与阵列上的弹射针对齐。将微冷冻凝胶阵列芯片压向弹射针阵列，利用PDMS弹射针阵列上的凸出针将微冷冻凝胶从微孔中推出，从而收获单个微冷冻凝胶。</li>
		<li>将微冻胶收获至水中，并借助细胞筛收集。使用一个筛子从一个芯片上收集微冻胶即，600 个微冻胶。</li>
		<li>用 0.1 M NaBH 洗涤微冻凝胶4 冰上孵育20分钟，以淬灭任何未交联的醛基残留。使用5 mL 0.1 M NaBH4 每芯片。弃去 NaBH4 用5 mL去离子水洗涤3至5次，每次15分钟。</li>
		<li>弃去细胞滤筛中的水，用弯头镊子将每个细胞滤筛中的微冻凝胶收集成一个簇，每簇放入一个35 mm培养皿中。向每个微冻凝胶簇中加入50–70 µL去离子水，盖上培养皿盖。轻轻敲击培养皿底部，使微冻凝胶均匀分布，确保微冻凝胶之间无重叠，形成单层结构铺展于培养皿表面。</li>
		<li>将收获的微冷冻凝胶在 -20 °C 冻存 4 至 16 小时，然后冻干 2 小时（见步骤 1.2.7）。将微冷冻凝胶于室温下真空保存，直至后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微冷冻凝胶的表征
	<ol>
		<li>通过扫描电子显微镜（SEM）成像评估微冷冻凝胶的孔隙结构。
		<ol>
			<li>将收获并冻干的微冻胶用双面胶固定在样品台上，使用溅射镀膜仪喷金90秒，随后进行扫描电镜成像。11使用图像分析软件，基于七张不同的扫描电镜图像，评估并分析微冷冻凝胶中孔径的分布情况。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在35 mm培养皿中称量一簇600个冻干的微冷冻凝胶，以获得干燥明胶微冷冻凝胶（GMs）的质量。向该簇冻干微冷冻凝胶中加入60 µL去离子水，静置30 s，使微冷冻凝胶充分吸水膨胀。称量溶胀后的微冷冻凝胶质量。
		<ol>
			<li>测定微冻凝胶的平衡溶胀比和孔隙率，分别定义为溶胀后微冻凝胶重量与干燥明胶微冻凝胶重量之比，以及微冻凝胶中持留水的重量与水合微冻凝胶重量之比13.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用集成数字测力计的可编程注射泵测量微冻凝胶的可注射性14.
		<ol>
			<li>用台盼蓝染色600个微冻凝胶，并将其悬浮于600 µL 15%明胶溶液中以实现均匀分布。将1 mL微冻凝胶悬液装入1 mL注射器中。使用可编程注射泵，以1 mL/min的流速通过连接在1 mL注射器上的27号针头注入该混合物。</li>
			<li>通过数字测力计测试实时监测注射力，并绘制力-时间曲线。注射后，在显微镜下观察微冷冻凝胶的完整性。 
			注意：悬浮于15%（wt/vol）明胶溶液中的GMs可顺利注射，且注射后仍保持完整。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>表征微冷冻凝胶的降解性。
		<ol>
			<li>首先，将600个冻干微冻凝胶置于35 mm培养皿中，称量其重量作为干重。然后，将600个冻干微冻凝胶浸入2 mL 0.025%（体积/体积）胰蛋白酶/EDTA溶液中。</li>
			<li>在不同时间点使用细胞筛从溶液中收集微冻胶即，10、20、30、40、50、60 和 70 分钟）。用纸巾吸去多余溶液。在不同时间点称量微冷冻凝胶的重量，并计算降解程度，即特定时间点微冷冻凝胶重量与零时微冷冻凝胶重量的比值。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞自动装载到微冷冻凝胶中以形成三维微组织
	<ol>
		<li>采用环氧乙烷灭菌系统对2.1.8步骤中的微冻干胶进行灭菌，气体暴露12小时，随后在真空条件下脱气12小时。</li>
		<li>选择人脂肪源性间充质基质细胞（hMSCs）用于小鼠缺血性后肢的治疗。按照先前报道的方法进行细胞分离。18.</li>
		<li>在含有2%胎牛血清（FBS）、10 ng/mL表皮生长因子（EGF）、10 ng/mL血小板源性生长因子bb（PDGF-bb）、1X胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、10-8 M 地塞米松，10-4 在DMEM/F12中加入M抗坏血酸2-磷酸、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。细胞汇合时按1:3比例传代。后续实验使用第3至第5代细胞。</li>
		<li>使用胰酶消化收获hMSCs，利用Fuchs-Rosenthal计数板对细胞数量进行定量，并重悬至浓度为8 x 10⁶ cells/mL6 细胞/mL，在hMSCs生长培养基中。</li>
		<li>将60 µL hMSCs悬液移液至第2.1节中制备的35 mm培养皿内的单层600个直径为400 µm的微冻凝胶上。细胞会自动被吸入微冻凝胶的多孔微结构中。</li>
		<li>在湿盒中孵育，37 °C 条件下孵育2小时，使细胞贴壁。孵育2小时后，加入2 mL培养基。每2天更换一次培养基。将负载hMSCs的微冷冻凝胶培养2天，以形成3D微组织。</li>
		<li>培养2天后，将100个载有hMSCs的微冻凝胶用移液器接种至96孔板的每个孔中，每孔加入120 µL按说明书配制的刃天青工作液，于37 °C孵育2 h。
		<ol>
			<li>在酶标仪中检测活细胞代谢刃天青产生的荧光，激发光波长为560 nm，发射光波长为590 nm。根据试剂盒说明书，使用人骨髓间充质干细胞（hMSCs）建立细胞数量与荧光强度的标准曲线，用于后续实验中根据荧光强度推算细胞数量。13.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从第0天到第4天，使用刃天青（resazurin）按照步骤2.3.7所述方法评估微冻凝胶中hMSCs的数量。</li>
		<li>用 Calcein AM（1:500 稀释）和碘化丙啶 Propidium Iodide（1:250 稀释）在磷酸盐缓冲液（PBS）中对微冻胶内的细胞进行染色（即活/死细胞染色），并在荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3D微组织注射 体内 用于小鼠模型中CLI的治疗
	<ol>
		<li>建立雌性BALB/c裸鼠的重度后肢缺血模型，方法如文献报道11,19 确定基于三维微组织疗法的治疗效果。</li>
		<li>使用5 mL移液器将步骤2.3.6中的微组织转移至细胞滤筛中，滤除培养基。</li>
		<li>将负载hMSCs的3D微组织重悬于15%明胶溶液中，密度为每100 µL溶液含100个微冷冻凝胶。</li>
		<li>手术前，使用高压灭菌器对手术器械进行灭菌，并在动物设施中心的动物手术室内进行手术。</li>
		<li>将小鼠放入麻醉诱导室中，使用1-3%异氟烷与100%氧气混合气体，气体流速为1 L/min。在小鼠眼部涂抹红霉素眼膏以防止角膜干燥。通过长约1 cm的皮肤切口，用5-10根丝线结扎股动脉及其分支，并予以切除19.</li>
		<li>通过尾静脉注射吲哚菁绿（ICG）（0.1 mL，100 µg/mL），以监测血流。使用荧光成像系统（此处为自制系统）在反射模式下进行ICG荧光成像11.</li>
		<li>使用1 mL注射器和23号针头，将微组织注射至动脉切口周围股薄肌的三个位点，采用肌内注射方式。</li>
		<li>术后，将小鼠置于恢复笼中，并使用加热垫保温。皮下注射美洛昔康以缓解疼痛，并持续监测直至小鼠苏醒。</li>
		<li>28天后，通过荧光成像监测经3D微组织处理肢体的治疗效果11. 
		&#160;注意：当小鼠出现自发性肢体脱落时，应皮下注射美洛昔康以缓解疼痛。</li>
		<li>实验结束后，用二氧化碳处死小鼠。 
		注意：此处采用二氧化碳实施安乐死 根据清华大学生物医学分析中心动物伦理委员会批准的严格规程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 高通量药物筛选用微组织阵列芯片的组装
<ol>
	<li>用于芯片上细胞培养的微冷冻凝胶阵列的组装
	<ol>
		<li>根据常规多孔板尺寸修改第1.1节中的设计， 即，针对384孔板格式，设计一个16行×24列的孔阵列，每孔直径为2 mm，孔中心间距为4.5 mm。</li>
		<li>按照第1.1节所述，使用激光在500 µm厚的PMMA板材上进行雕刻。</li>
		<li>按照第1.2节所述方法，使用3.1.2步骤获得的384多孔阵列芯片制备微冻凝胶。此含有微冻凝胶的阵列称为微冻凝胶阵列芯片。</li>
		<li>用 50 mL 0.1 M NaBH 洗涤微冷冻凝胶阵列芯片4 为淬灭任何未交联的残余醛基，随后用50 mL去离子水重复冲洗3次，每次2小时。</li>
		<li>弃去水，将微冻胶阵列芯片在 -20 °C 冻存 4 至 16 小时，然后按照步骤 1.2.7 进行冻干。</li>
		<li>将步骤3.1.1中的384孔多孔阵列设计修改为包含16 × 24个孔，每个孔直径为3 mm，孔中心间距为4.5 mm。</li>
		<li>从一片超薄（10 µm）生物相容性双面胶带的背衬上移除一侧保护膜，并将其粘贴至一块3 mm厚的PMMA板的一侧。根据第1.1节所述方法，将步骤3.1.4中的设计激光雕刻于该3 mm厚的PMMA板上。此阵列被指定为储液阵列。</li>
		<li>将微冷冻凝胶阵列芯片与储液池阵列芯片对齐并紧密贴合，组装成用于片上细胞培养的三维微冷冻凝胶阵列芯片。用紫外线照射灭菌1小时。</li>
		<li>将3D微冷冻凝胶阵列芯片于室温下真空保存，以备后续实验使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在三维微组织阵列上进行药物筛选
	<ol>
		<li>用25 mL无菌去离子水填充湿盒，作为细胞培养的保湿室。在湿润的5% CO₂、37°C培养箱中预热。2 将培养箱调至37 °C。</li>
		<li>按照标准方案从组织培养板中收集非小细胞肺癌细胞（NCI-H460）和肝细胞癌细胞（HepG2），并用培养基重悬，调整细胞密度至1.0 × 10⁶ cells/mL6 细胞/mL。充分混匀。 
		注意：NCI-H460 细胞使用含 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 RPM1640 培养基。HepG2 细胞使用含 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 DMEM 培养基。</li>
		<li>从培养箱中取出湿化室。使用镊子小心地将步骤 3.1.9 中组装好的 3D 微冻胶阵列芯片放入湿化室内。注意避免湿化室中的水润湿微冻胶。</li>
		<li>充分混匀细胞悬液，然后直接吸取3 µL细胞悬液，分别加入各孔中的微冻胶中。 
		注意：在排出细胞悬液前，移液器吸头应轻轻接触微冻胶表面。细胞通过吸收作用自动载入微冻胶中。不要将细胞接种于外周孔中。</li>
		<li>使用多通道移液器（如96通道液体处理仪）将细胞接种至微冻胶后，向每个孔中加入10 μL培养基。同时向边缘孔中加入培养基。 
		注意：H460 细胞使用含 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 RPMI1640 培养基；HepG2 细胞使用含 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 DMEM 培养基。</li>
		<li>将载有细胞的微冻胶阵列芯片置于湿润培养箱中，在5% CO₂条件下培养24 h2 在37 °C培养箱中孵育以形成三维微组织阵列。</li>
		<li>溶解阿霉素和IMMLG-84399 在二甲基亚砜（DMSO）中配制成10 mM的储存液。用培养基将药物稀释，形成从2 nM至200 µM的10倍浓度梯度。</li>
		<li>向每个孔中加入 10 µL 药物溶液。以 0.1% DMSO（用培养基稀释）作为对照。将载药的三维微组织阵列置于湿润、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育2 37 °C 培养箱中孵育 24 小时。</li>
		<li>向每个孔中加入4 µL刃天青储备液。在37 °C孵育2 h。将三维微组织阵列置于微孔板读数仪中，检测活细胞代谢的刃天青荧光，激发光波长为560 nm，发射光波长为590 nm。</li>
		<li>从所有孔中减去刃天青的基线信号，然后再进行后续数据处理。通过将每孔的荧光信号除以对照孔的平均荧光信号，计算各孔的细胞活力分数。</li>
		<li>使用绘图软件绘制剂量-反应曲线，以细胞活力分数为Y轴，药物浓度的以10为底的对数为X轴。在细胞活力分数为0.5处插值计算50%抑制浓度（IC50）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

再生医学与 体外 用于药物筛选的模型是组织工程的两个重要应用5,6,7,8,9尽管这两种应用的需求截然不同，但它们的共同之处在于需要更接近生物体内的培养条件，以增强细胞功能19只有通过提升研究中的细胞功能，我们才能更好地治疗疾病20,21，如果培养的细胞能更准确地反映药物反应，我们是否能够加速药物发现进程6,7移植后细胞存活率 体内 再生医学的关键要求是细胞载体具备体内移植的适用性，而药物筛选则需要高...

传统的二维（2D）平面培养体系（如培养皿或多孔板）难以诱导细胞表现出接近其天然状态的生物学行为。准确模拟包含多种细胞类型、细胞外基质及生物活性可溶性因子的三维（3D）结构中的天然细胞微环境1,2,3,4对于构建仿生组织至关重要 体外 在组织工程、再生医学、基础生物学研究和药物发现中的应用5,6,7,8,9.
与二维细胞培养相比，三维细胞培养被广泛用于促进培养细胞的仿生微结构和功能特征 体外一种常用的三维细胞培养方法是将细胞聚集成球状体7,8,9,10细胞球体相较于分散细胞的注射，可在注入受损组织后实现更高的细胞滞留率和存活率。然而，由于球体尺寸不均一，且注射过程中流体剪切力不可避免地对细胞造成机械损伤，导致细胞治疗效果不佳。11,12,13同样，类球体在聚集过程中固有的不均一性，使其在基于三维细胞的高通量药物筛选中的应用面临挑战。10.
另一种三维细胞培养方法借助生物材料实现，通常将细胞包封于水凝胶或 多孔支架中。该方法在构建三维结构方面具有更高的灵活性。在治疗应用中，包封于大块支架中的细胞通常需通过外科手术植入动物体内，这种侵入性操作具有创伤性，因而限制了其在临床的广泛应用。另一方面，将细胞悬浮于水凝胶前体溶液中后注射入动物体内，可借助水凝胶实现微创治疗，从而允许 原位 通过热、化学或酶交联实现凝胶化11然而，由于细胞是在水凝胶前体仍处于水溶液状态时被递送的，因此在注射过程中也会受到机械剪切力的作用。不仅如此，注射过程中还可能发生化学或酶促交联反应 原位 水凝胶的凝胶化过程也可能对其中的细胞造成损伤。在药物筛选中，生物材料辅助的细胞培养面临均匀性、可控性和通量方面的挑战。使用水凝胶时，细胞通常在凝胶化过程中被包埋，该过程可能影响细胞的存活率和功能。在接种细胞的同时进行凝胶化还会限制大多数高通量设备的使用，因为水凝胶在接种前需保持在冰上以防止过早凝胶化，且水凝胶可能堵塞加样针头——这些针头通常非常细，以确保高通量筛选的准确性。预先制备的支架材料有望将生物材料制备步骤与细胞培养分离，然而大多数基于支架的产品仅以块状材料形式提供，通量相对较低14.
为克服现有三维培养方法的一些局限性，我们开发了一种微加工-冷冻凝胶化集成技术，用于制备即用型、操作简便的微冷冻凝胶阵列芯片15在本方案中，选择明胶作为微冷冻凝胶制备技术的示例，因其具有良好的生物相容性、可降解性、成本低廉，且无需额外修饰即可支持细胞黏附。根据具体应用需求，也可选用其他天然或合成来源的聚合物进行制备。通过该技术，可制备出微型化、高弹性的微冷冻凝胶，其尺寸、形状和排列均可控。当负载多种类型的细胞时，可形成用于不同用途的三维微组织。这些独特特性使其具备理想的可注射性、细胞保护能力以及注射后的靶向滞留性能 体内 以增强治疗效果。不仅如此，微冷冻凝胶还可进一步加工形成三维微组织阵列，该阵列可与常规实验室设备和仪器兼容，实现高通量细胞培养，适用于多种药物筛选及其他细胞分析。本文将详细阐述微冷冻凝胶的制备过程及其后续处理方法，分别用于制备作为个体三维微组织或三维微组织阵列的两种重要应用：细胞治疗和药物筛选10,15.

<table><tbody><tr><td>明胶</td><td>sigma</td><td>G7041</td><td>所有其他试剂均购自 Sigma-Aldrich（St. Louis, MO），除非另有说明。</td></tr><tr><td>戊二醛&amp;nbsp;</td><td>J&amp;amp;K</td><td>902042</td><td>用作材料制备过程中的交联剂。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（24 × 50 mm）</td><td>CITOGLASS，中国</td><td>10212450C</td><td>将前驱体溶液刮涂到微模板阵列芯片上。</td></tr><tr><td>钠&amp;nbsp;硼氢化物，NaBH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>北京化工厂</td><td>116-8</td><td>凝胶化后洗去残留的戊二醛。</td></tr><tr><td>真空罐</td><td>中国台湾</td><td>VC8130</td><td>在真空条件下保存微凝胶。</td></tr><tr><td>聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板材&amp;nbsp;</td><td>新金电子有限公司，中国</td><td></td><td>普通PMMA板材。</td></tr><tr><td>Rayjet激光系统</td><td>雷捷特，澳大利亚</td><td>Rayjet 50 C30</td><td>对PMMA板材进行刻蚀以形成孔穴。</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Mycro Technologies，美国</td><td>PDC-32G</td><td>为了使PMMA具有亲水性。</td></tr><tr><td>冻干机</td><td>中国博伊康</td><td>SC21CL</td><td>用于冻干材料。</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>中国中科科奥</td><td>DA0065</td><td>对微凝胶进行染色。</td></tr><tr><td>盐酸多柔比星</td><td>ENERGY CHEMICAL，中国</td><td>A01E0801360010</td><td>在二维或三维微凝胶中检测细胞的耐药性。</td></tr><tr><td>活细胞/死细胞检测</td><td>Dojindo Molecular Technologies（日本熊本）</td><td>CS01-10</td><td>用于区分活细胞与死细胞。</td></tr><tr><td>Cell Titer-Blue</td><td>美国威斯康星州普洛麦格公司</td><td>G8080</td><td>检测细胞活力。</td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>BD 生物科学公司，美国</td><td>352360</td><td>收集微凝胶。</td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>SYNCHEM（德国）</td><td>s039</td><td>贴壁细胞。</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>FEI，美国</td><td>Quanta 200</td><td>表征微凝胶形态。</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;力学测试机</td><td>Bose，美国</td><td>3230</td><td>用于测量机械特性。</td></tr><tr><td>可编程注射泵&amp;nbsp;</td><td>美国 World Precision Instruments 公司</td><td>ALADINI 1000</td><td>测试可注射性。</td></tr><tr><td>数字测力计</td><td>HBO，中国乐清海宝仪器有限公司</td><td>H-50&amp;nbsp;</td><td>测试可注射性。</td></tr><tr><td>环氧乙烷灭菌系统</td><td>Anprolene，Anderson Sterilization, Inc.，北卡罗来纳州霍河</td><td>AN74i</td><td>使用环氧乙烷气体对微凝胶进行灭菌。</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices，美国</td><td>M5</td><td>测量微阵列中的荧光强度</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>日本尼康</td><td>A1Rsi</td><td>观察细胞在三维空间中的分布。</td></tr><tr><td>Xenogen&amp;nbsp; Lumina II 成像系统</td><td>美国Caliper生命科学公司</td><td>IVIS</td><td>在动物体内追踪细胞</td></tr><tr><td>液体处理工作站</td><td>美国杏仁设计</td><td>S-移液管</td><td>用于高通量加载培养基或细胞悬液。</td></tr></tbody></table>

用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

为了将传统的二维细胞培养升级为三维细胞培养，我们结合了微加工技术与冷冻凝胶化技术，制备出具有大孔结构的微米级冷冻凝胶（microcryogels），该凝胶可负载多种类型的细胞以形成三维微组织。本文介绍了构建多功能三维微组织的实验方案，及其在再生治疗与药物筛选中的应用。可在阵列芯片上制备尺寸和形状可控的微冷冻凝胶，这些凝胶可从芯片上分离，作为单个负载细胞的载体用于可注射的再生治疗；也可进一步在芯片上组装成三维微组织阵列，用于高通量药物筛选。由于这些微米级冷冻凝胶具有高度弹性，三维微组织在注射过程中可有效保护细胞免受机械剪切力损伤，因而表现出优异的可注射性，适用于微创细胞治疗。这在中国台湾小鼠肢体缺血模型中显著提高了细胞存活率和治疗效果。同时，将三维微组织阵列组装于标准的384孔多孔板格式中，便于使用常规实验室设备与设施，从而可在这一多功能三维细胞培养平台上实现高通量药物筛选。

用于三维微组织形成的微冻胶的制备与表征。
根据本方案，制备了微冻凝胶以形成三维微组织，以及单个微冻凝胶或微冻凝胶阵列，并分别应用于再生治疗和药物筛选（图1）。由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制备的微模板阵列芯片被用作微冻凝胶阵列芯片的微模具。微模板阵列芯片可制备成多种几何形状。本文选择一种典型的45 mm × 14 mm微模板阵列芯片作为示例，其包含多种形状（即圆形、椭圆形、三角形和三叶形），以及一组不同尺寸的圆形微模板阵列芯片（直径分别为100、200、400和800 µm）。为了增强阵列芯片上微模具的可视性，采用了透射光照明成像（图2A、B）。从阵列芯片上收获的微冻凝胶呈现出预期的形状和尺寸（图2C</st...

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外 高通量药物筛选

为了将传统的二维细胞培养升级为三维细胞培养，我们结合了微加工技术与冷冻凝胶技术，制备出具有大孔结构的...

利用低温凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的总体目标是促进可注射的再生治疗以及体外高通量药物筛选。本视频展示了制备多功能三维微组织并将其应用于再生治疗和药物筛选的实验方案。该再生治疗技术可提高干细胞在注射至伤口部位后的滞留率、存活率及治疗功能。药物筛选也因操作简便以及具备高通量筛选潜力而得到改进。通常，初涉三维培养的研究人员会因复杂的操作流程而面临困难。该技术简化了三维培养过程，使研究人员能够更有效地控制所生成的三维微组织。参与演示这些步骤的还有来自我们实验室的四名研究生：Zhou Lyu、Liu Wei、Li Yaquian 和 You Zhifeng。用去离子水清洗PMMA微模板阵列芯片，以去除激光雕刻后残留的碎屑。随后，将微模板阵列芯片在60摄氏度下干燥。接下来，将干燥的芯片每四个一组放入等离子清洗机中进行处理。首先，运行真空泵两分钟。然后，使用18瓦的射频功率处理三分钟，以提高芯片的亲水性。现在，每五个芯片配制一毫升明胶前体溶液。在60摄氏度水浴中溶解明胶，然后将溶液置于冰上孵育五分钟。待溶液稍冷却但仍为液态时，将戊二醛充分混入明胶前体溶液中，使其终浓度为0.3%戊二醛。现在，将200微升制备好的溶液移液至每块芯片的上表面。使用弯头玻璃棒将溶液均匀地分布在芯片上。接着，立即将载有溶液的阵列芯片转移至-20摄氏度冰箱中，冷冻16小时以进行冷冻凝胶化。第二天，将冷冻干燥机在约30分钟内冷却至零下40摄氏度。然后装载微阵列芯片，在真空条件下冷冻干燥两小时。在此条件下，冰将发生升华，芯片即可准备用于后续实验。首先从芯片上收获单个微冷冻凝胶。将制备好的微冷冻凝胶阵列芯片覆盖在制备好的PDMS推出针阵列上，使每个微冷冻凝胶与一个推出针对齐。然后将微冷冻凝胶阵列芯片压入阵列中，使微冷冻凝胶从其孔穴中脱出。接着将喷射出的微冷冻凝胶收集至水浴中，并借助细胞筛网进行收集。每个芯片使用一个筛网收集全部微冷冻凝胶。接下来，将微冷冻凝胶置于冰上用硼氢化钠洗涤。使未交联的醛基残基淬灭约20分钟。然后弃去硼氢化钠溶液，并用5毫升去离子水洗涤微冷冻凝胶15分钟。总共进行三到五次水洗后再继续操作。从最后一次水洗中取出微冻凝胶后，使用镊子将其从细胞滤筛转移至35毫米培养皿中。每一批微冻凝胶构成一个簇。现在，向每簇微冷冻凝胶中加入 50 至 70 微升去离子水，并盖上培养皿。然后轻轻敲击培养皿，使堆叠的微冷冻凝胶分布均匀。随后，将微冷冻凝胶在 -20 °C 下冷冻 4 至 16 小时。随后，按之前方法冻干两小时。下一步是制备三维微组织。首先，对微冻凝胶进行灭菌。然后，用胰蛋白酶消化收集细胞，测定细胞密度，并将细胞重悬于生长培养基中，调整浓度为每毫升八百万个细胞。接着，将60微升细胞悬液滴加至每簇微冻胶上。将培养皿置于湿化 chamber 中，在37摄氏度孵育两小时，使细胞充分吸收进入凝胶。孵育后，向每皿中加入2毫升培养基，继续培养，并每隔一天更换培养基。两天后，将形成3D微组织。将3D微组织注射入小鼠时，首先将其转移至5毫升移液器中，然后加载至细胞筛中以过滤培养基。然后，将3D微组织重悬于15%的明胶溶液中。在完成动物植入前准备后，将微组织注射至缝匠肌的三个部位，进行肌内注射。每次注射应包含150个微冻凝胶，溶于150 µL溶液中。使用带有23号针头的1毫升注射器。在组装用于芯片上细胞培养的微冷冻凝胶阵列后，小心地将其放入预热的湿化室中，避免沾水。然后，将3微升充分混匀的细胞悬液直接分装到每个微冷冻凝胶孔中。加样前，使移液器吸头轻轻接触微冻胶表面，再排出溶液。不要向边缘孔中接种细胞。加样后，使用96通道液体分配器向每个孔中加入10 µL筛选培养基，并向边缘孔中添加培养基以减缓蒸发。随后，将芯片置于湿化培养箱中培养24小时，以形成三维微组织。第二天，使用96通道液体分配器，以浓度梯度方式向每孔加入10微升药物，重复加样四次，完成全部384孔的加药，包括DMSO对照组。然后，继续培养24小时。药物处理24小时后，向每个孔中加入4 µL刃天青储备液，并将培养板孵育2小时，使细胞代谢刃天青。为检测细胞对刃天青的代谢情况，使用酶标仪进行检测。收获的明胶微冷冻凝胶具有预定义的形状和尺寸。通过扫描电镜（SEM）分析显示，微冻凝胶具有相互连通的大孔结构，孔径范围为30至80微米。明胶微冻凝胶的可注射性通过注射后培养进行了定量评估。每毫升1,000个微冻凝胶在低于临床可接受的10牛顿力6牛顿的条件下进行注射。在注射后培养五天期间，微冻胶中的干细胞保持了较高的存活率和强大的增殖能力。利用这些细胞对小鼠肢体缺血模型进行了治疗性处理，并在术后28天检测了缺血肢体的生理状态。使用100,000个干细胞的微组织治疗显著改善了肢体挽救效果。28天后，仅有25%的小鼠出现自发性脚趾截断。在另一项应用中，3D微组织阵列被用于高通量药物筛选。肝细胞癌细胞用多柔比星处理，非小细胞肺癌细胞用IMMLG-8439处理。在这两种情况下，三维培养均增强了耐药性。观看本视频后，您应充分了解如何制备可注射的再生治疗用弹性三维微孔微冻凝胶，用于芯片外三维培养，或如何制备用于体外高通量药物筛选的芯片上三维细胞培养阵列。该技术为细胞再生治疗和药物筛选领域的研究人员利用三维细胞培养技术铺平了道路，从而推动了这两个研究领域的发展。请注意，使用戊二醛和硼氢化钠时可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须采取适当的预防措施，例如穿戴合适的防护服，并在通风橱内操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

3D Microtissues 用于可注射再生疗法和高通量药物筛选

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