从交联骨骼肌制备高质量核的基于过滤的方法进行染色质免疫沉淀

该实验程序的总体目标是允许从交联骨骼肌制备高质量的细胞核，然后将其用于染色质免疫沉淀研究。这种方法可以帮助回答肌肉和昼夜节律领域的关键问题，例如在昼夜节律或其他时间敏感的环境中使用肌肉组织和细胞进行基因组研究。该技术的主要优点是它允许样品立即交联，并且可以可靠地进行基于过滤的程序，以分离高质量的细胞核，同时将肌原纤维污染降至最低。

虽然这种方法可以提供对骨骼肌的了解，但它也可以应用于其他系统，例如心肌和平滑肌。如前所述，在冰冷的磷酸盐缓冲盐水中，将从大约 20 周龄的 C57 黑色六只雄性小鼠中分离的后肢骨骼肌称重和切碎。将切碎的骨骼肌组织放入含有 10 毫升 PBS 的 50 毫升锥形管中，置于冰上。

然后将样品在 4 摄氏度下以 300 x g 离心 5 分钟。通过抽吸小心去除 PBS 上清液。使用装有 1 毫升、2 毫升、3 毫升和 4 毫升水的参考管估计每 50 毫升试管中的沉淀体积。

加入 7 体积的冰冷的 1% 甲醛和 PBS，并使用探针组织匀浆器在冰上匀浆样品。接下来，通过在室温下孵育 10 分钟来交联样品。通过添加 1 摩尔甘氨酸至终浓度为 0.125 molar 来淬灭交联反应，然后在室温下孵育 5 分钟。

4 摄氏度下以 3， 000 倍 g 离心样品 5 分钟后，通过抽吸去除上清液。将沉淀重悬于 10 mL含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂的冰冷基础缓冲液中，冲洗沉淀。再次离心样品，并通过抽吸小心去除上清液。

然后将沉淀重悬于含有新鲜添加蛋白酶抑制剂的 6 mL 裂解缓冲液中。将样品转移至预冷的 15 mL Dounce 匀浆器中，并在冰上孵育 10 分钟。使用松散的杵在冰上缓慢敲击 15 次，然后用紧杵敲击 15 次以释放细胞核，将每个样品均质化。

以下过滤步骤是分离高质量细胞核的关键。通过细胞过滤器过滤匀浆，并用 4 毫升裂解缓冲液冲洗。然后将样品在 4 摄氏度下以 1， 000 倍 g 离心 10 分钟。

沉淀重悬于 5 毫升冰冷的基础缓冲液中，并用紧杵 Dounce 10 次以释放细胞核。然后通过细胞过滤器过滤悬浮液，用 2 mL 基础缓冲液冲洗试管并再次过滤。用孔径逐渐减小的细胞过滤器重复过滤。

最后，在 4 摄氏度下以 1， 000 倍 g 离心 10 分钟。去除上清液，将沉淀重悬于 500 μL 碱缓冲液中，然后再次离心。弃去上清液，将沉淀储存在零下 80 摄氏度。

在 500 μL SDS 裂解缓冲液中解冻样品，然后轻轻移液重悬。将细胞核 DNA 悬液转移到冰上的玻璃瓶中。选择正确的超声处理平台和条件对于从分离的细胞核制备染色质至关重要。

使用文本协议中概述的设置，从圆盘形换能器集中爆发超声波声能运行超声处理。将超声处理的染色质转移到 1.5 mL 试管中。然后以 12， 000 次 g 离心 15 分钟，并将上清液转移至新试管中。

接下来，将 50 微升超声处理样品转移到新的 1.5 毫升试管中，在 65 摄氏度下进行反向交联过夜。DNA 样品的收获在下一节中描述。按照文本方案中的说明对超声处理和定量进行评估后，将解冻的染色质分装至每管约 100 至 120 μg。

然后用免疫沉淀缓冲液将染色质稀释 1 至 10。接下来，加入 40 微升 50% BSA 预封闭蛋白 HE 琼脂糖或 IgY 珠浆液，并在旋转器上于 4 摄氏度孵育 3 小时。以 1， 000 次 g 离心样品 10 分钟后，小心地将上清液转移到新试管中。

然后以每 25 至 100 μg 染色质 DNA 添加 1 μg 抗体的抗体。在 4 摄氏度和大约 15 rpm 的转速下轻轻旋转过夜。然后加入 10 μL BSA 预封闭蛋白 HE 琼脂糖或 IgY 珠子并混合。

在冷藏室中旋转珠子悬浮液两小时。接下来，用 RIPA 缓冲液洗涤珠子，然后用高盐缓冲液、氯化锂缓冲液和 Tris EDTA 洗涤，如文本方案中所述。洗涤后，首先以 1， 000 倍 g 离心 1 分钟，然后小心去除上清液，从珠子中洗脱 DNA。

用 50 μL 洗脱缓冲液重悬磁珠。然后在 10 摄氏度下孵育 65 分钟。孵育后，以 12， 000 g 离心 5 分钟。

去除上清液，再加入 50 μL 洗脱缓冲液，然后再次以 12， 000 x g 离心 5 分钟。最终洗脱体积为 100 μL。要反向交联并进行 DNA 洗脱，首先将洗脱的染色质在 65 摄氏度下孵育过夜。

然后加入 1 微升 RNase A，然后在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。随后，在 55 摄氏度下与 8 微升 10 毫克/毫升蛋白酶 K 孵育 30 分钟。根据制造商的方案，使用洗脱体积为 50 μL 的 PCR 纯化试剂盒收获 DNA。

最后，如前所述，通过实时 QPCR 分析配置文件。顺序过滤可有效去除组织碎屑。此处显示了初始过滤后和连续过滤后的样品的代表性图像，以供比较。

通过运行琼脂糖凝胶揭示通过 10 个超声处理循环的染色质逐渐切碎。用消化的染色质进行 10 个循环的超声处理，得到大约 500 个碱基对的 DNA。这里显示了 B 雄性 one chIP 的代表性 QPCR 结果，其中小鼠骨骼肌样本在 ZT6 和 ZT18 处收集。

对 Dbp 基因上 Dbp 位置元件的分析显示，与之前的结果一致，结合峰位于 ZT6 附近。一旦掌握，如果作得当，可以在 5 到 6 小时内完成细胞核的准备。观看此视频后，您应该对如何使用基于过滤的方法从交联肌肉组织中纯化高质量的细胞核和染色质 DNA 有了很好的了解。

在尝试此程序时，请务必记住将样品保存在冰上或冷藏室中，并保存样品等分试样，以便在过滤步骤前后进行显微镜检查。开发后，这项技术为肌肉和基因组学领域的研究人员探索各种肌肉组织中染色质-蛋白质相互作用的昼夜节律或时间敏感动力学铺平了道路。按照此程序，可以执行其他方法，如 chIP 测序，以回答其他问题，例如寻找肌肉组织中转录因子结合的模式。