Name: 从交联骨骼肌制备高质量核的基于过滤的方法进行染色质免疫沉淀 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 了解基于过滤的方法从交联骨骼肌制备高质量细胞核用于染色质免疫沉淀研究。该技术无需超速离心，可有效减少肌原纤维污染，适用于骨骼肌、心肌和平滑肌等多种肌肉组织的基因组学研究。

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感谢 Karyn Esser、Nobuya Koike 和 Noheon Park 提供的有益建议。本工作部分由美国国立卫生研究院/普通医学科学研究所（NIH/NIGMS，项目号 R01GM114424）资助 S.-H.Y.，以及由罗伯特·A·韦尔奇基金会（AU-1731）和美国国立卫生研究院/国家衰老研究所（NIH/NIA，项目号 R01AG045828）资助 Z.C.。

动物护理工作遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行，实验操作均依照休斯顿德克萨斯大学健康科学中心批准的动物实验方案开展。
1. 交联骨骼肌中细胞核的分离
<ol>
	<li>称取并切碎从约20周龄C57BL/6雄性小鼠分离的后肢骨骼肌组织，置于冰上预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，具体操作如前所述22。 
	注意：通常每只小鼠可获得1.0–1.5 g骨骼肌组织。
	<ol>
		<li>将切碎的骨骼肌组织放入含有10 mL PBS的50 mL锥形管中，置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C条件下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心吸弃上清液。</li>
	<li>使用分别装有1、2、3和4 mL水的对照管，估测每个50 mL管中沉淀的体积。</li>
	<li>加入7倍体积的冰上预冷的含1%甲醛的PBS溶液，并使用探头式组织匀浆器在冰上进行匀浆（见材料表）。 
	可选：匀浆过程可在低温室中进行。</li>
	<li>在室温下孵育10分钟，完成交联反应。</li>
	<li>加入1 M甘氨酸至终浓度为0.125 M，以终止交联反应，并在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟，吸弃上清液。</li>
	<li>用10 mL冰上预冷的基础缓冲液（10 mM HEPES-KOH，pH 7.3，10 mM EDTA，10 mM KCl，5 mM MgCl2，0.5 mM DTT）洗涤，其中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂（0.2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和10 µg/mL亮抑蛋白酶肽）。在4 °C条件下以3,000 × g离心5分钟，小心吸弃上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于6 mL裂解缓冲液（10 mM HEPES-KOH，pH 7.3，10 mM EDTA，10 mM KCl，5 mM MgCl2，0.5 mM DTT，1% Triton X-100）中，其中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂（0.2 mM PMSF和10 µg/mL亮抑蛋白酶肽）。</li>
	<li>将样品转移至预冷的15 mL Dounce匀浆器中，在冰上孵育10分钟。在冰上使用松散研杵缓慢匀浆15次，再用紧密研杵匀浆15次，以释放细胞核。</li>
	<li>将匀浆液（6 mL）通过细胞筛（孔径：100 µm）过滤，并用4 mL裂解缓冲液冲洗。在4 °C条件下以1,000 × g离心10分钟。将沉淀重悬于5 mL冰上预冷的基础缓冲液中，并用紧密研杵匀浆10次，进一步释放细胞核。
	<ol>
		<li>取20 µL样品用于分光光度计测定DNA浓度（OD260/OD280），必要时用台盼蓝染色进行显微镜观察（见下文）（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将悬液通过细胞筛（孔径：70 µm）过滤，用2 mL基础缓冲液冲洗管和滤膜，再次过滤（操作同上）。</li>
	<li>按照步骤1.13的方法，依次使用孔径逐渐减小的细胞筛（40 µm、30 µm、20 µm和10 µm）重复过滤。 
	注意：在步骤1.12–1.14中，共使用了6种不同孔径的细胞筛。</li>
	<li>在4 °C条件下以1,000 × g离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL基础缓冲液中。</li>
	<li>按上述方法测定DNA浓度。 
	注意：从一只动物的双侧后肢组织合并处理后，可获得约200 µg核DNA。可选：保留20 µL样品，用台盼蓝染色（储存浓度0.4%，1:5稀释）进行显微镜观察；细胞核将被染成蓝色（图1B）。</li>
	<li>在4 °C条件下以1,000 × g离心10分钟，弃去上清液。将沉淀在-80 °C保存。</li>
</ol>
2. 超声处理
<ol>
	<li>在500 µL SDS裂解缓冲液中解冻样品，并用移液器轻轻重悬。</li>
	<li>将核DNA悬液转移至冰上的玻璃小瓶中。</li>
	<li>使用碟形换能器产生的聚焦超声波能量进行超声处理。设备详细信息见材料表。使用以下设置：每脉冲循环数：200；强度：5；占空比：20；温度：4 - 6 °C；开启/关闭时间：30秒。 
	注意：超声处理效果评估示例见图2。</li>
	<li>将超声处理后的染色质转移至1.5 mL离心管中。在12,000 × g离心15分钟，将上清液转移至新管中。取50 µL超声处理后的样品（约每肌肉样品7 - 10 µg）放入新的1.5 mL离心管中，在65 °C下反向交联过夜。其余样品于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 超声处理与定量评估
<ol>
	<li>向保存的 50 µL 超声处理样品中加入 1.0 µL RNase A（500 U/mL RNase A：20,000 U/mL RNase T1），在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>加入 8 µL 蛋白酶 K（10 mg/mL），在 55 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>使用 DNA 提取试剂盒回收 DNA。
	<ol>
		<li>加入 5 倍体积的结合缓冲液，将混合物加入离心柱中，在 4,000 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
		<li>将穿流液重新加入同一离心柱中，再次离心。</li>
		<li>用洗涤缓冲液洗涤两次，每次在 13,000 × g 条件下离心 1 分钟。</li>
		<li>再次在 13,000 × g 条件下离心 1 分钟，以干燥离心柱。</li>
		<li>加入 50 µL H2O，在 13,000 × g 条件下离心 1 分钟，洗脱 DNA。</li>
		<li>将洗脱液重新加入同一离心柱中，再次离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分光光度计（OD260/OD280）定量 DNA 含量。将样品在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳，以评估超声处理产物的大小和量（1 µg）（图 2）。 
	注意：染色质的平均得率约为 20%。</li>
</ol>
4. 染色质免疫沉淀（ChIP）
<ol>
	<li>将先前保存在 -80 °C 的染色质解冻，并分装至每管约 100 - 120 µg。用放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA 缓冲液）（20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM NaF，1 mM Na₃VO₄，1 mM PMSF，1×蛋白酶抑制剂混合物（PIC），0.1% 脱氧胆酸钠（w/v），1% Triton X-100）按 1:10 稀释。
	<ol>
		<li>若每组包含多个样本，将等量的染色质 DNA 混合，使最终总量约为每样本 100 - 120 µg。保留 10% 作为输入样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 40 µL（在 RIPA 缓冲液中为 50% v/v 悬浮液）经 BSA 预封闭（约 2 小时，4 °C）的 Protein A/G 琼脂糖（用于非鸡源抗体）或 IgY 磁珠（用于鸡源抗体），在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 3 小时。</li>
	<li>以 1,000 × g 离心 10 分钟，小心将上清转移至新管中。</li>
	<li>每约 25 - 100 µg 染色质 DNA 加入 1 µg 抗体。</li>
	<li>在 4 °C 轻柔旋转过夜（约 15 rpm）。</li>
	<li>加入 10 µL 经 BSA 预封闭（约 2 小时，4 °C）的 Protein A/G 琼脂糖（用于非鸡源抗体）或 IgY 磁珠（用于鸡源抗体），在 4 °C 冷室中旋转孵育 2 小时。</li>
	<li>按以下步骤洗涤磁珠：用 1 mL RIPA 缓冲液洗涤 3 分钟，重复两次；用 1 mL 高盐缓冲液&#160;（20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，500 mM NaCl，2 mM EDTA，1 mM PMSF，1% Triton X-100）洗涤 3 分钟，重复两次；用 1 mL LiCl 缓冲液&#160;（20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，250 mM LiCl，2 mM EDTA，1 mM PMSF，1% 脱氧胆酸钠，0.5% NP40）洗涤 3 分钟，重复两次。
	<ol>
		<li>用 1 mL Tris-EDTA（TE）缓冲液&#160;（10 mM Tris-HCl (pH 7.4)，1 mM EDTA）洗涤 3 分钟，一次。然后用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl，5 mM EDTA 和 0.5% SDS）洗脱 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 1,000 × g 离心 1 分钟，小心移除上清。</li>
	<li>用 50 µL 洗脱缓冲液重悬磁珠。</li>
	<li>在 65 °C 孵育 10 分钟。</li>
	<li>以 12,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将上清转移至新管，再加入 50 µL 洗脱缓冲液，再次以 12,000 × g 离心 5 分钟。最终洗脱体积为 100 µL。</li>
	<li>逆转交联并回收 DNA。
	<ol>
		<li>将洗脱的染色质在 65 °C 孵育过夜。</li>
		<li>加入 1.0 µL RNase A，在 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>加入 8 µL 蛋白酶 K（10 mg/mL），在 55 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>按照制造商说明书，使用 PCR 纯化试剂盒回收 DNA，洗脱体积为 50 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按先前所述方法通过实时定量 PCR 分析结果25,26。 
	注：引物序列列于 图 3 图注 中。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示（图 3）。</li>
</ol>

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<li>Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+PGC-1alpha+directly+controls+the+expression+of+the+hypothalamic+neuropeptide+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin.</a> J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种可靠的方法，利用交联的骨骼肌组织分离高质量的细胞核。通过连续过滤有效将细胞核与碎片分离，并利用碟形换能器产生的超声波声能对染色质进行剪切，以用于ChIP分析。结果表明，BMAL1在特定昼夜节律时间结合到靶基因启动子区域。
染色质免疫沉淀（ChIP）可用于在交联发生时捕获蛋白质在基因组DNA上的实时占据情况。为了充分利用这一潜力，我们旨在开发一种方法，能够在组织解剖的同时对骨骼肌进行交联，并在无需梯度超速离心的情况下简化细胞核的分离流程。由于富含纤维的骨骼肌组织相较于肝脏等软组织更难均质化，我们将肌肉组织在冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）中切碎，随后在甲醛缓冲液中进行均质化处理。交联反应终止后，将组织悬液离心，并用冰冻的基础缓冲液洗涤，以去除残留的甲醛。通过Dounce匀浆器释放细胞核，匀浆液依次经过滤处理，逐步去除细胞碎片和肌原纤维。我们设计了这一系列过滤步骤，以最大程度减少滤器堵塞，避免影响细胞核得率。完成逐级过滤后，仅残留极短的肌原纤维片段。
超声处理和染色质免疫沉淀（ChIP）步骤参照先前的报道<sup cla...

骨骼肌在生理和行为中发挥着重要作用。多核的肌纤维由肌原纤维组成，其中肌动蛋白和肌球蛋白形成称为肌节的功能单位，以产生收缩力。骨骼肌也是人体最大的代谢器官，占餐后葡萄糖摄取量的&#62;80%，并调节胰岛素反应和代谢稳态1,2。肌肉的生理功能和代谢过程受到生物节律钟的紧密调控，生物节律钟是一种内在的生物计时系统3,4,5,6。例如，特异性敲除骨骼肌中的核心生物节律钟组分之一Bmal1基因，会导致骨骼肌胰岛素抵抗和葡萄糖摄取能力下降，动物模型最终发展为2型糖尿病7。此外，骨骼肌也日益被认为是一种内分泌器官8，可通过分泌肌因子来调节全身的代谢和生理功能。要全面理解骨骼肌中的这些调控功能，仍需开展深入的机制性研究。
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种强大的方法，可用于阐明DNA结合蛋白在启动子区域的招募情况。ChIP最初被开发用于鉴定染色质DNA上的核小体排列结构9,10。此后，已有多种方法被报道用于通过甲醛、二甲基硫酸酯或紫外线照射（UV）将蛋白质与染色质DNA交联11,12。其中，甲醛交联应用最为广泛，可有效保持染色质结构及DNA-蛋白质相互作用9,13,14。交联后的染色质通过超声处理被打碎，并使用针对特定DNA结合蛋白的抗体进行免疫沉淀15,16。近年来，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术——即ChIP与高通量测序（NGS）相结合的方法——已被开发用于研究全基因组范围内的转录因子结合情况17，并在某些情况下用于监测时间序列中的动态变化18,19,20。例如，昼夜节律相关的ChIP-seq研究揭示了昼夜节律钟组分和组蛋白标记在基因组上高度有序的结合序列，从而驱动基因表达在约24小时的昼夜节律周期中实现时间上的精确调控18。
大多数现有的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案均针对软组织设计例如 肝脏，大脑 等等。），且针对骨骼肌等硬组织发表的方法极少。由于骨骼肌富含纤维，因此在技术上难以实现充分匀浆并分离出高质量的细胞核21，尤其是对于需要交联的ChIP实验。在最近的一项肌肉组织ChIP研究中22，卫星细胞从肌纤维中分离，并通过长时间的组织消化过程分别从这两种细胞类型中制备细胞核。整个过程耗时约三小时，之后才对分离的细胞核进行甲醛交联。尽管该方法避免了对肌纤维进行交联（因为交联会使肌肉组织更难有效匀浆），并能够获得高质量的细胞核，但从组织取样到细胞核交联之间存在显著的时间延迟，可能导致DNA-蛋白质相互作用发生改变。相比之下，大多数研究通常在实验处理或组织采集后立即进行交联，以保持DNA-蛋白质结合状态的实时性12另一个在交联前进行细胞核分离的缺点是，它排除了对时间敏感的应用，例如通常以3-4小时间隔采集的昼夜节律样本。由于未交联的细胞核在解剖后必须立即进行分离，而交联后的样本则可在整个时间过程结束后统一处理，从而确保更高的实验一致性。
已有其他关于从未交联的骨骼肌中分离细胞核的方案被报道。两项研究描述了使用梯度超速离心法将细胞核与残留的肌原纤维及细胞碎片分离的方法23,24。尽管蔗糖或胶体梯度超速离心法对未交联的肌肉组织有效，但我们的实验表明，在交联后，梯度超速离心法无法在梯度中将细胞核与细胞碎片有效分离。
因此，我们开发了一种利用交联的小鼠骨骼肌组织分离高质量细胞核的方案。我们设计了一种连续过滤方法，以有效将细胞核与碎片分离，而非采用梯度超速离心法。经过超声处理后，染色质样品成功应用于ChIP研究，结果显示BMAL1蛋白结合到靶启动子上呈现昼夜节律模式。我们的方法可广泛适用于肌肉组织的各种机制研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗BMAL1抗体</td><td></td><td></td><td>以氨基酸318–579为抗原免疫鸡（Cocalico Biologicals）制备，IgY通过相同抗原亲和纯化获得。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>鸡IgY沉淀树脂</td><td>GenScript</td><td>L00405</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KINEMATICA&amp;nbsp;Polytron PT2100 台式匀浆器</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-178</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Dounce 组织研磨器</td><td>Wheaton</td><td>357544</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛 100 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛 70 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛 40 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 30 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 10 &amp;micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50010-03</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S2 聚焦式超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>型号 S2</td><td></td></tr><tr><td>Labquake&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>CCD 显微镜相机</td><td>&amp;nbsp;Leica Microsystems</td><td>DFC3000 G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA提取试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>所有缓冲液组分均在实验方案中描述，各组分均购自Sigma Aldrich</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于过滤法的交联骨骼肌细胞核高质量制备方法，用于染色质免疫沉淀

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于确定蛋白质与染色质DNA结合的强大方法。然而，由于富含纤维的骨骼肌在分离高质量细胞核时难以避免肌原纤维的污染，因此在ChIP应用中一直存在技术挑战。以往的实验方案尝试在交联前纯化细胞核，但这一过程耗时较长，可能导致DNA-蛋白质相互作用发生改变。在本方案中，我们首先对从小鼠获取的骨骼肌组织进行交联处理，随后将组织切碎并进行超声处理。由于我们发现使用交联后的肌肉组织时，超速离心法无法有效分离细胞核与肌原纤维，因此设计了一种连续过滤步骤，以获得几乎不含肌原纤维污染的高质量细胞核。接着，我们利用超声破碎仪制备染色质，并使用抗BMAL1抗体进行ChIP实验，结果清晰地揭示了BMAL1在靶基因启动子区域呈现显著的昼夜节律性结合模式。该过滤方案提供了一种简便可行的方法，可用于从交联的骨骼肌组织中分离高质量细胞核，从而实现昼夜节律及其他时间敏感型研究中样本处理的一致性。结合下一代测序技术（NGS），本方法可广泛应用于针对骨骼肌功能的多种机制性与基因组学研究。

我们在组织采集后立即进行甲醛交联，以保存实时的DNA-蛋白质相互作用。然而，我们发现蔗糖或胶体梯度（常用于细胞核分离23,24）在分离细胞核与肌原纤维方面效果不佳（数据未显示）。原因可能是交联使细胞核和肌原纤维具有相似的沉降重力。因此，我们开发了一种连续过滤方法，以有效去除细胞核组分中的大块肌原纤维及其他碎片。经过100 µm过滤后，仍存在大量组织碎片和肌原纤维（图1A）；相比之下，在完成连续过滤后，绝大多数大块组织碎片、完整细胞以及大块肌原纤维均被成功去除（图1B）。
这些细胞核用于碟状超声处理。将储存在 -80 °C 的细胞核重悬于 SDS 裂解缓...

我们提出了一种基于过滤的实验方案，用于从交联的小鼠骨骼肌中分离高质量的细胞核，该方法无需超速离心，因而更易于应用。我们证明，由此获得的细胞核所提取的染色质适用于染色质免疫沉淀实验，并可能适用于染色质免疫沉淀测序研究。

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于确定蛋白质与染色质DNA结合的强有力方法。然而，富含纤维的骨骼肌组织一直是一种...

本实验方案的总体目标是实现从交联的骨骼肌组织中制备高质量细胞核，进而可用于染色质免疫共沉淀研究。该方法有助于回答肌肉生物学与昼夜节律领域中的关键科学问题，例如在昼夜节律或其他时间敏感条件下利用肌肉组织和细胞开展基因组学研究。该技术的主要优势在于能够对样本进行即时交联，且基于过滤的处理步骤可稳定地分离出高质量细胞核，同时最大限度地减少肌原纤维的污染。尽管该方法可用于研究骨骼肌，也可应用于其他系统，如心肌和平滑肌。按照先前所述方法，取约20周龄的C57 black six雄性小鼠的后肢骨骼肌组织，在冰上预冷的磷酸盐缓冲液中称重并剪碎。将剪碎的骨骼肌组织放入含有10毫升PBS的50毫升锥形管中，并置于冰上。然后在4°C条件下以300 × g离心样品5分钟。小心吸去PBS上清液。通过使用分别装有1、2、3和4毫升水的对照管，估测每支50毫升离心管中沉淀物的体积。加入七倍体积的预冷的含1%甲醛的PBS溶液，于冰上使用探头式组织匀浆器匀浆样品。随后在室温下孵育10分钟以进行交联反应。通过加入1摩尔浓度的甘氨酸至终浓度0.125摩尔，淬灭交联反应，并于室温下继续孵育5分钟。在4°C条件下，以3,000 × g离心样品5分钟，通过抽吸去除上清液。用含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂的10毫升冰冻基础缓冲液重悬沉淀，洗涤沉淀。再次离心样品，并小心通过抽吸去除上清液。然后将沉淀重悬于6 mL含有新鲜添加的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。将样品转移至预冷的15 mL Dounce匀浆器中，冰上孵育10分钟。在冰上对每个样品进行Dounce匀浆，先用松动研杵缓慢研磨15次，再用紧密研杵研磨15次，以释放细胞核。以下过滤步骤是分离高质量细胞核的关键。将匀浆液通过细胞滤筛过滤，并用四毫升裂解缓冲液冲洗。然后在四摄氏度下以1,000 × g离心10分钟。将沉淀物重悬于5 mL冰预冷的基础缓冲液中，使用紧密的研杵Dounce匀浆10次，以释放细胞核。随后将悬液通过细胞滤筛过滤，并用2 mL基础缓冲液冲洗管子，再次过滤。使用孔径逐渐减小的细胞滤筛重复过滤步骤。最后，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 500 µL 基础缓冲液中，然后再次离心。弃去上清液，将沉淀物保存于 -80 °C。在500微升SDS裂解缓冲液中解冻样品，并用移液器轻轻吹打重悬。将细胞核DNA悬液转移至冰上的玻璃小瓶中。选择合适的超声破碎平台和条件对于从分离的细胞核中制备染色质至关重要。使用文本方案中所述的设置，通过盘状换能器发出的聚焦超声波能量脉冲进行超声处理。将超声处理后的染色质转移至一个1.5毫升离心管中。然后在12,000 × g 下离心15分钟，并将上清液转移至新的离心管中。接下来，将50微升超声处理后的样品转移至新的1.5毫升离心管中，在65摄氏度下过夜进行逆转交联。DNA样品的回收将在下一节中描述。根据文本方案中所述的超声处理效果评估与定量结果，将解冻的染色质分装为每管约100至120微克。然后用免疫沉淀缓冲液将染色质稀释至原体积的十分之一。接着加入40 µL 50% BSA预封闭的蛋白HE琼脂糖或IgY磁珠悬液，在4°C下旋转孵育3小时。以1,000 × g离心10分钟后，小心将上清液转移至新的离心管中。然后加入抗体，每25至100微克染色质DNA加入一微克抗体。在4°C、约15 rpm条件下轻柔旋转孵育过夜。随后加入10微升BSA预封闭的蛋白HE琼脂糖或IgY磁珠，混匀。在冷室中旋转孵育珠子悬浮液两小时。随后，按照文本方案中的说明，依次使用RIPA缓冲液、高盐缓冲液、氯化锂缓冲液和Tris EDTA缓冲液洗涤珠子。洗涤完成后，通过在1,000 × g离心一分钟并小心移除上清液，从珠子中洗脱DNA。用50微升洗脱缓冲液重悬珠子，然后在65摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，在12,000 ×g 离心5分钟。弃去上清液，再加入 50 微升洗脱缓冲液，随后在 12,000 × g 离心 5 分钟。最终洗脱体积为 100 微升。为逆转交联并进行 DNA 洗脱，首先将洗脱的染色质在 65 摄氏度下孵育过夜。然后加入1 µL RNase A，在37°C下孵育30分钟。随后加入8 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K，在55°C下孵育30分钟。按照生产商说明书，使用PCR纯化试剂盒，以50 µL洗脱体积回收DNA。最后，按照先前所述方法通过实时定量PCR分析谱型。连续过滤可有效去除组织碎片。此处展示了初始过滤后和连续过滤后的样品代表性图像，以供比较。通过琼脂糖凝胶电泳显示，经过10个循环的超声处理后，染色质逐步被剪切。对已消化的染色质进行10个循环的超声处理，可获得约500个碱基对的DNA片段。此处展示了在ZT6和ZT18时间点采集的小鼠骨骼肌样本中，B型雄性个体一次染色质免疫沉淀实验的代表性qPCR结果。对 Dbp 基因上 Dbp 位置元件的分析显示，其结合峰在 ZT6 左右，与先前的研究结果一致。一旦掌握该技术，若操作得当，可在五到六小时内完成细胞核的制备。观看本视频后，您应能充分理解如何利用基于过滤的方法，从交联的肌肉组织中纯化高质量的细胞核和染色质 DNA。在进行该实验操作时，重要的是始终将样品置于冰上或冷室中，并在过滤步骤前后保留部分样品用于显微镜检查。该技术建立后，为肌肉与基因组学领域的研究人员探索不同肌肉组织中染色质-蛋白质相互作用的昼夜节律或时间依赖性动态变化提供了重要基础。在完成本实验流程后，可进一步开展染色质免疫沉淀测序（chIP-seq）等后续方法，以回答更多科学问题，例如分析转录因子在肌肉组织中的结合模式。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

从交联骨骼肌制备高质量核的基于过滤的方法进行染色质免疫沉淀

ESC的分化伴随着染色质结构和组成的细胞类型特异性变化。检测这些变化可为定义干细胞特性及细胞分化的机制提供重要见解。染色质免疫沉淀（ChIP）是一种有价值的手段，可用于解析干细胞分化背后的分子机制。...

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了解基于过滤的方法从交联骨骼肌制备高质量细胞核用于染色质免疫沉淀研究。该技术无需超速离心，可有效减少肌原纤维污染，适用于骨骼肌、心肌和平滑肌等多种肌肉组织的基因组学研究。

一种基于过滤法的交联骨骼肌细胞核高质量制备方法，用于染色质免疫沉淀

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