Name: 用于固相合成含有2- 0 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学习固相合成法合成RNA十二聚体并进行纯化与表征的方法。本方案涵盖磷酰胺化学、紫外光谱及圆二色谱技术，为研究人员提供标准化的寡核苷酸制备流程。

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本论文的撰写工作得到了科罗拉多大学丹佛分校启动资金（JMRE）的支持。AF 感谢科罗拉多大学丹佛分校研究与创造性活动奖（RaCAS, CU Denver）提供的支持。同时感谢科罗拉多大学丹佛分校研究服务办公室为支付出版费用所提供的资助。我们谨向实验室成员 Cassandra Herbert 女士和 Yannick K. Dzowo 先生致以谢意，感谢他们在视频部分所做出的贡献。

1. RNA 寡核苷酸的固相合成
<ol>
	<li>含各亚磷酰胺溶液的制备（表1）。
	<ol>
		<li>统计核苷酸的数量，代入 n+1 公式（其中 n = 核苷酸数量），确定每个碱基对应的数值，并填写表格中的缺失值。体积为每种核苷酸 0.15 mL，浓度为 0.1 M，溶于无水乙腈中。</li>
		<li>将每种亚磷酰胺称重至已烘干的10 mL棕色瓶（Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm内径 × 20 mm外径）中，立即放入装有干燥剂的干燥器中进行真空处理。</li>
		<li>用干燥氩气充满干燥器，取出瓶子后立即用相应体积的乙腈（无水）稀释，然后固定到仪器上。 
		注意：务必使用气密性注射器，并始终保持无水环境。</li>
		<li>移除瓶上的隔垫，并通过换瓶功能将瓶放置到仪器上。 
		注意：此过程在合成前需额外使用每种溶液 0.15 mL 用于润洗管路（因此上述 n+1 公式中包含额外体积）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用软件设置序列与固相合成图3).
	<ol>
		<li>单击软件图标（例如，OligoNet 1.0.1）并选择 仪器名称&#62;好的. 通过创建新的合成方法 文件&#62;新合成方法&#62;订购.</li>
		<li>填写：日期；运行编号（RunID）；选择仪器；序列名称；序列（5'至3'端）。在 |cycle 下，指定先前创建的方法（图3）。选择结束步骤， (寡核苷酸与CPG树脂结合&#62;手动</li>
		<li>选择 DMT 关闭 &#62;（在合成最后一步使用TCA处理以获得5'-OH末端）；保存 文件&#62;保存为 并为该实验命名。</li>
		<li>发送文件以开始合成 订购&#62;将订单发送至合成仪 并选择列 1-4打开合成器窗口并选择 三苯甲基监测|选择功能|trityl&#62;监控每一步骤.</li>
		<li>根据需要重复上述步骤，具体取决于同时合成的寡核苷酸数量（注意：所有订单必须采用相同的方法）， 即，相同的偶联时间与事件顺序。</li>
		<li>开始合成 合成器&#62;准备开始将带有目标3'-端的柱子置于仪器上指定的位置。在仪器上点击 开始&#62;无 （用于ABI制备）。</li>
		<li>合成完成后，将柱子从仪器上取下，放入圆底烧瓶中，并在减压条件下干燥约0.5小时。 
		注意：建议检查随机偶联（步骤 1.2.4 - 1.2.7）过程中是否出现深橙色，以避免三苯甲基监测功能可能产生的误差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 寡核苷酸的脱保护与纯化
	<ol>
		<li>打开柱子的黑色盖帽，将全部（或根据需要取一半）白色树脂转移至1.6 mL离心管中。加入0.5 mL甲胺（40%水溶液）/氨水（40%水溶液），体积比为1:1。</li>
		<li>用封口膜封紧离心管盖，并使用金属浴加热至 60 &#176;C 1.5 小时。 
		注意：可在反应管顶部放置一个重物，以确保管内氨浓度保持恒定。</li>
		<li>从热块中取出，缓慢冷却至室温。短暂离心样品以沉淀内容物，然后将上清液转移至新的离心管中。</li>
		<li>将试管浸入液氮（或干冰/乙醇浴）中速冻样品，然后在减压条件下离心浓缩至干燥。</li>
		<li>将固体重新悬浮于0.4 mL三乙胺/N-甲基吡咯烷酮/三乙胺三氢氟化物（2:2:3比例）溶液中。加热至 60 &#176;C 1.5 小时，随后缓慢冷却至室温。</li>
		<li>加入0.04 mL醋酸钠溶液（3 M，pH 5.5，用HCl调节），用移液枪头轻轻混匀。加入乙醇（1 mL），冰浴冷却至约 -70 &#176;C （干冰/乙醇浴）15 分钟。</li>
		<li>以 15,000 rpm 离心 4 &#176;C 10 分钟。用移液器吸取等分试样，并在减压条件下干燥所得沉淀物。</li>
		<li>将所得固体重新悬浮于上样缓冲液（0.2 mL，90% 水溶液甲酰胺，1 mM EDTA）中，混匀至混合物呈均一状态。</li>
		<li>将悬液上样至预先制备的聚丙烯酰胺凝胶（20% 变性，加样孔尺寸：30 cm × 1 mm）22.</li>
		<li>将电流通过凝胶，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶下端1/2至2/3位置（凝胶尺寸：约21.5 cm × 30 cm）。</li>
		<li>将凝胶从支架上取下，把凝胶内容物从玻璃转移至双面覆盖的塑料膜上，然后置于涂有硅胶（含254 nm荧光染料）的薄层色谱（TLC）板上，用紫外灯观察条带&#955;最大值 = 254 nm</li>
		<li>用记号笔标记上层条带的位置，并使用新的剃须刀片将其切下。将含有RNA的凝胶（不带塑料膜）放入50 mL锥形管中，用玻璃棒碾碎成小碎片。</li>
		<li>将凝胶残留物悬浮于 NaCl 水溶液（200 mM NaCl）中&#160;和 1 mM EDTA）并振荡悬浮液 37 &#176;C 孵育12小时。将锥形管离心10分钟。</li>
		<li>使用反相C18柱进行脱盐。
		<ol>
			<li>使用10 mL注射器，依次用以下溶液冲洗小柱进行预处理： 
			乙腈（10 mL） 
			H2O（两次，每次10 mL） 
			5 mM NH4OAc 水溶液（3 mL） 
			含有RNA的溶液，注意不要倒入任何凝胶残留物。</li>
			<li>用 H 洗涤2O（每次10 mL，共三次）。</li>
			<li>使用60%的水-甲醇溶液（3 mL）从柱子中洗脱</li>
		</ol>
		</li>
		<li>减压浓缩后，重新溶于无RNase水（0.3 mL）中</li>
		<li>配制稀释溶液（10 &#181;L）并存入 1 &#181;L 在紫外-可见光谱仪上（例如，Nanodrop）用于测定紫外-可见吸收光谱（200–450 nm）。</li>
		<li>利用比尔-朗伯定律确定所获得溶液的浓度： 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> 
		其中 A = 测得的吸光度； &#949; = 计算的摩尔消光系数； c = 浓度，以及 l 光程为1 mm时，其值为0.1。</li>
		<li>计算寡核苷酸的摩尔消光系数；此处使用基于DINAMelt软件的在线计算器进行计算（http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt）23</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 MALDI-TOF 进行浓度测定与表征
	<ol>
		<li>使用装有C18小柱的移液枪头对样品进行脱盐，然后用移液枪将每种寡核苷酸点样至MALDI靶板上。
		<ol>
			<li>用50%乙腈冲洗尖端（10 &#181;L x 2）。用0.1%三氟乙酸（TFA； 10 &#181;L x 2）。用样品上样（通常为100–150 pmol）。</li>
			<li>用0.1% TFA冲洗尖端（10 &#181;L ×2），然后用水（10 &#181;L × 2</li>
			<li>将样品洗脱至含有目标基质的溶液中；我们使用了以下溶液： 10 &#181;L 25 mM 一水合2,4,6-三羟基苯乙酮（THAP）、10 mM 柠檬酸铵和300 mM 氟化铵溶于50%乙腈中。</li>
			<li>直接点样至MALDI靶板上 0.9 &#181;L （随后进行风干，并根据需要重复该步骤。） 
			注意：所有质谱图均在反射正离子模式下获得。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNA 结构分析 通过 CD
<ol>
	<li>CD 溶液的制备
	<ol>
		<li>制备含有修饰RNA的0.25 mL溶液3 &#181;M]，NaCl [10 mM]，磷酸钠缓冲液 [10 mM，pH 7.2]，以及 MgCl2 [5 mM]。该样品可直接用于分析，尤其适用于单分子转变的情况。</li>
		<li>如果目标是分析双链结构或双分子转变，此时可加入互补链（1 摩尔当量，若适用）；否则继续执行下一步操作。</li>
		<li>将样品置于预热至 90 &#176;C，关闭热源以控制缓慢冷却至室温（通常为2 - 4小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光谱采集
	<ol>
		<li>配制空白溶液（NaCl 10 mM，磷酸钠 10 mM，pH 7.3，MgCl2 5 mM），转移至微量比色皿（1 cm光程， 250 &#181;L 最小体积），并置于仪器样品更换器的样品架位置上。</li>
		<li>将含有RNA的样品转移至另一微量比色皿中，并置于自动进样器内。若测量热变性过程，需小心加入一层油相，避免扰动水相层，并使用一段聚四氟乙烯（Teflon）密封带固定比色皿盖。</li>
		<li>打开氮气罐，调节气流使仪器上的空气浮子升至约 40。开启冷却器。</li>
		<li>打开仪器并启动软件 光谱管理器 图标，然后打开采集窗口 光谱测量.</li>
		<li>在采集前用氮气吹扫仪器5分钟。</li>
		<li>使用以下参数获取谱图 测量&#62;参数 并按如下方式调整参数：
		<ol>
			<li>下方 通用，选择：扫描范围200-350 nm；CD和HT通道：数据步长0.1 nm；扫描速度100 nm/min；狭缝宽度1 nm；累积次数5次。</li>
			<li>下 细胞单位，选择 20 &#176;C. 在……之下 对照，选择快门自动开启和关闭。在 信息，选择名称、浓度和操作者。</li>
			<li>下 数据，浏览至目标文件夹。点击 好的.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>获取光谱 测量&#62;样品测量，确定样品架中比色皿的位置 1-6 相应地，单击 好的.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若进行热变性转变：
	<ol>
		<li>关闭采集软件 文件&#62;退出 并打开一个新程序 变温测量&#62;测量&#62;参数.</li>
		<li>应用以下参数记录热转变过程，可根据需要进行调整：
		<ol>
			<li>下方 温度，选择起始温度： 4 &#176;C；间隔：0.2；目标： 90 &#176;C梯度： 1 &#176;C/分钟；等待0秒。在下方 开始/结束，选择起始条件 &amp;#38; 根据需要设定终止条件。</li>
			<li>下 通用，选择3通道，CD/HT/Abs；带宽：1 nm；波长：270 nm（或按需设置）。在 对照，不选择任何项。在 信息，选择名称、浓度、操作员。</li>
			<li>下 数据，浏览至所需文件夹。单击 好的.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将样品冷却至 4 &#176;C 在此温度下等待5分钟，然后进行光谱测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光谱数据处理
	<ol>
		<li>使用软件中的功能，从目标采集数据中减去空白光谱，以扣除所用缓冲体系产生的背景信号： 光谱分析&#62;文件&#62;开放.</li>
		<li>打开空白文件和光谱文件后，将视图2拖动至视图1下方（屏幕左侧）。</li>
		<li>点击 处理&#62;减法&#62;好的 或 交换数据&#62;好的.</li>
		<li>以 ASCII 文件格式提取数据： 文件&#62;导出 并选择 ASCII.</li>
		<li>使用软件绘制相应的光谱。当信噪比较预期低时，数据平滑化为可选步骤。可通过应用数据平滑化选项实现此转换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>热变性转变的数据处理
	<ol>
		<li>从JASCO文件中提取数据为ASCII文件。</li>
		<li>将椭圆率数据点绘制为温度的函数。通常，根据所检测的波长，可能需要对数据进行平滑处理。在某些情况下，使用210 nm波长时，不同曲线之间的变异较大，因此需要进行平滑处理。然而，根据样品及其浓度的不同，部分计算也直接采用了原始数据。</li>
		<li>为了计算热变性转变温度（Tm) 值，需获取该曲线的一阶导数，其极大值或极小值即指示该参数。与前一步骤相同，某些情况下需对数据进行平滑处理，以获得最准确的数值。 
		注：实验通常设置三个重复，由此得到测量结果的相应平均值和标准差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).</li>
<li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li>
<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文旨在为该领域的研究人员（无论是初学者还是专家）提供一份指南，以成功实现或优化DNA或RNA寡核苷酸的合成。所述方法重点介绍利用自动化DNA/RNA合成仪，通过标准的亚磷酰胺化学法进行固相合成。本报告详细描述了RNA十二聚体的合成、纯化及表征的逐步操作过程。此外，还采用圆二色光谱（CD）技术来鉴定二级结构基序以及热变性转变过程。
需要注意的是，本研究方法可适用于其他情况， 即，固相合成中使用的不同品牌设备、修饰方法、保护基团和/或试剂。因此，通过改变该过程中涉及的多个参数中的一项或多项，或调整反应条件，可能实现优化。此外，本文提供的详细结构分析（通过CD）有望为该领域的研究人员提供一种替代方法，通常用于开展类似分析 通过 紫外-可见光谱
用于固相合成的磷酰胺单体质量计算基于以下序列，四种寡核苷酸在同一运行中制备并纯化（下划线位置表示含有2'-O-噻吩甲基修饰）。所有计算和数值均已包含在内 表1 
1 5'-[CUA CGG AA...

自20世纪70年代以来，用于合成DNA/RNA寡核苷酸的固相合成技术已成为一种强大的工具，广泛应用于多个领域的多种研究1,2,3 使用亚磷酰胺单体模块4其广泛影响的示例包括：在标记方面的应用（通过 点击化学反应5，结构探针6以及反义技术7以及其对生物学机制的阐明8,9，作为遗传物质的来源10，以及各种天然和/或化学修饰的研究11,12，以及其他多种修饰。我们在此使用的修饰方法，是我们获得含有光敏探针的RNA寡核苷酸的第一步，旨在实现对该重要生物大分子结构与功能的时间可控性调控。
合成具有以下序列的RNA十二聚体：5'-[CUA CGG AAU CAU]-3'/5'-[AUG AUU CCG UAG]-3'（下划线位置表示掺入了C2'-O噻吩甲基修饰）是本研究的重点。所选序列可用于对RNA单链或其对应的双链结构（未预测存在其他热力学稳定的二级结构）进行定量和测量。采用圆二色光谱（CD）法确定其结构参数， 即双链形成和热变性转变。
合成 
获得这些寡核苷酸的整体流程如图所示 图1 并遵循以下逐步流程：自动化固相合成 → 脱保护 → 纯化 → 定量 → 表征。 图2 显示了本实验所需的各种单体单元。RNA的固相合成与DNA类似，均基于亚磷酰胺化学方法（图2，左侧）以及对G、A和C上的亲核性环外氨基采用碱不稳定的保护基团 例如乙酰基、苯甲酰基、苯氧乙酰基 t-丁基或 N,N-二甲基甲酰胺（图2，右侧）。在RNA中，由于存在C2'-OH基团（脱氧寡核苷酸生物聚合物中缺乏该基团），还需考虑一个额外步骤，即对该亲核位点进行保护以及后续的去保护。在这方面，基于硅的保护基团已成为一种有吸引力的策略，因其可作为生物正交基团（在氟离子存在下可特异性去保护），具有潜在应用价值。 叔丁基叔丁基二甲基硅基（TBDMS）和三异丙基硅氧甲基（TOM）基团是常用的选择（图2，左下角。
本研究中，自动合成在采用标准亚磷酰胺化学法的DNA/RNA合成仪上进行。仪器的厂家设置包含一个自动稀释步骤，适用于商业化的DNA亚磷酰胺试剂，或允许用户自定义稀释体积的选项。然而，我们选择称量RNA亚磷酰胺并手动稀释，原因如下：1）RNA标准亚磷酰胺的价格较高（在某些情况下贵达50倍）；2）修饰型亚磷酰胺通常获得量较少；3）使用厂家设定的自动稀释步骤会造成大量材料浪费。此外，我们使用了：1） commercially available 固相载体（例如，CPG），其上连接有保护的碱基，作为3'-端；2）在C2'-O位由TBDMS基团保护的商业化的亚磷酰胺（标准碱基）。详细的合成步骤列于图3和Table 1中，并附有针对RNA合成所调整步骤的进一步说明与注释。此外，图4展示了选择“三苯甲基监测”（Trityl Monitor）选项后，每一步反应的逐步产率，该选项可定量每次脱三苯甲基步骤中释放的三苯甲基阳离子。
值得注意的是，根据我们的经验，通常限制因素在于获得含有目标修饰的亚磷酰胺单体，即开发出能够在特定位置引入修饰的合成方法。在本报告中，我们重点关注一种已建立相应合成方法的修饰核苷酸的引入，即C2'-O-苯硫甲基团。该基团体积较小，不会以任何方式影响固相合成。由于将该基团引入RNA寡核苷酸的研究已有报道，并且相关结构与热力学参数也已发表4，因此本文不再描述通向此类修饰亚磷酰胺单体的有机合成过程。
脱保护、纯化与表征 
外环胺基和β-氰乙基的脱保护与从CPG树脂上的裂解在同一步骤中进行。我们采用常规条件，即将所得树脂在AMA水溶液中加热，随后裂解C2'-O在氟离子存在下脱除-silyl基团，然后纯化 通过 凝胶电泳。尽管这些条件在许多情况下已成为标准，但对于在碱性条件或氟离子存在下不稳定的修饰，则可能需要更温和的条件13,14, 例如，甲醇/碳酸钾（MeOH/K₂CO₃）2CO3），或丁胺。因此，需要采用一组不同的保护基团来修饰相应的亚磷酰胺。此外，基于我们此前对该方法的经验以及缺乏其他仪器设备，我们选择电泳作为纯化去保护寡聚物的首选方法。然而，高效液相色谱（HPLC）也可作为有效的替代纯化手段。15通过质谱法对纯化的寡核苷酸进行表征，采用本课题组先前报道的方法，使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行分析。16.
对所获得的双链体进行结构表征和热稳定性分析 通过 CD。具体而言，我们利用CD通过监测约270 nm处椭圆度降低，以及具有负椭圆度的吸收带（λ最大 在210 nm处进行检测。提供了杂交前后的光谱对比，以展示其差异并验证所采用方法的有效性。圆二色光谱（CD）技术已被广泛接受用于核酸和氨基酸结构基序的测定。17，因此可作为确定多种结构和热力学参数的工具18；然而，将该技术用于评估热变性转变的例子并不多。一些案例包括测定含G-四链体的DNA的热稳定性19,20 或RNA的双链体和发夹结构21.
本报告旨在为非专业读者或观众提供一套工具，帮助其顺利开展此类研究。本报告可用于与其他参与这一激动人心的科学领域的研究实验室的方法和技术进行改进和比较。本报告的内容汇集了来自不同来源的该技术现有方案，并通过为每一步骤提供视觉辅助，丰富和便利了使用体验。

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>乙腈 99.9%，HPLC 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>乙腈 99.9%，无水，用于 DNA 测序</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺，99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸氢二铵 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>氟化铵&amp;nbsp; 98.0%，ACS 级</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵 28 - 30% 水溶液，ACS Plus 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>氩气—超高纯度</td><td>&amp;nbsp;Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺 超纯</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯，97%</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，无水，组织学级</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 100.2%</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，36.5 - 38.0%，认证 ACS Plus 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁，99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，99.9%，&amp;nbsp; HPLC 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>甲胺 40% 水溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-甲基-2-吡咯烷酮，无水，99.5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 孔插板 (123 x 81 mm)&amp;nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠，无水 99.2%，认证 ACS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，100.5%，认证 ACS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物 99.0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;,4&amp;rsquo; 三乙胺，99+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺三氢氟化物，98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸，99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;rsquo;-三羟基苯乙酮一水合物 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA 合成试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>去保护混合液，3% 三氯乙酸溶于二氯甲烷</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>封端混合液 A，THF/吡啶/乙酸酐</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>封端混合液 B，10% 1-甲基咪唑溶于 THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>活化剂，0.25 M 5-乙基硫代-1H-四唑溶于无水乙腈</td><td>Glen Research</td><td>&amp;nbsp;30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>氧化溶液，0.02 M 碘溶于 THF/吡啶/水</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE 磷酸亚胺酯&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE 磷酸亚胺酯</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE 磷酸亚胺酯</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE 磷酸亚胺酯&amp;nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

含2'-o-苯硫甲基修饰的rna寡聚物的固相合成方案及圆二色性表征

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

固相合成已被用于制备天然及修饰的核酸聚合物，特别是DNA或RNA，使其成为多种领域和不同研究目的应用中的常用方法。本文所述方案重点在于合成、纯化和表征含有零个、一个或两个位于C2'位点修饰的RNA十二聚体5'-[CUA CGG AAU CAU]-3'O-位点。探针基于2-噻吩甲基团，通过标准有机合成方法将其引入RNA核苷酸，并通过相应的亚磷酰胺试剂将这些修饰核苷酸整合到寡核苷酸中。本报告采用亚磷酰胺化学方法，利用四种经典碱基（尿苷（U）、胞苷（C）、鸟苷（G）、腺苷（A）），以及在2'-位点修饰有2-噻吩甲基功能团的核苷酸。O-位置；然而，该方法具有高度可变性，多年来已发展出多种改良版本。寡核苷酸在可控孔径玻璃（CPG）载体上合成，随后在标准条件下从树脂上切割并脱保护， 即，氨和甲胺混合物（AMA），随后使用氢氟酸/三乙胺/N-甲基吡咯烷酮处理。相应的寡核苷酸通过聚丙烯酰胺电泳（20%变性）纯化，随后洗脱、脱盐，并通过反相色谱（Sep-pak，C18-柱）。定量分析和结构参数分别通过紫外-可见光（UV-vis）和圆二色光谱（CD）光度分析进行评估。本报告旨在为初学者和资深研究人员提供进入该领域的资源与指导。随着新技术和新方法的不断发展，本报告将作为持续更新的参考资料。本文所述方法与技术对应于一台DNA/RNA合成仪（2013年购入的翻新设备），该仪器采用亚磷酰胺化学法。

本文描述了在C2'-O-位点含有零个、一个或两个2-噻吩甲基修饰的RNA十二聚体的合成方法，以及相应的纯化与表征过程。此外，还包括通过圆二色光谱（CD）进行结构分析的详细描述。
通过固相合成法获得四条RNA链（包括一条具有互补序列的链），每条寡核苷酸的纯化产率为300 - 700 nmol。对每份样品约150 pmol进行脱盐处理后，点样至靶板进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析（图5）。通过紫外光度分析对各溶液进行定量，同时利用圆二色光谱（CD）检测双链结构的形成并记录其相应的解链温度（Tm）。无论是单链样品还是双链结构，通过紫外-可见光谱（UV-vis）检测均未观察到天然寡核苷酸与修饰寡核苷酸之间存在明显差异。然而，在测定其圆二色光谱时观察到微小变化（图6）。此外，...

本文详细介绍了在C2'位点修饰的十二聚体RNA的固相合成、纯化及表征方法O-位置。采用紫外-可见吸收光谱和圆二色光谱分析来定量并表征结构特征， 即单链或双链。

含2'-O-苯硫甲基修饰的RNA寡聚物的固相合成方案及圆二色性表征

固相合成已被用于获得核酸（特别是DNA或RNA）的天然及修饰聚合物，这使其成为一种常用方法……

本报告的总体目标是展示通过固相合成法获得RNA寡核苷酸的实验步骤。将以RNA十二聚体作为模型进行合成，并演示其纯化与表征方法。通过其可视化内容，本出版物将拓展相关方法学和技术平台的应用范围，为各个领域的研究人员提供参考。提供可视化辅助工具并辅以简要的实验方案，将有助于研究人员应用这些技术。该技术的一个优势在于其适用于多种改进方法。随着当今应用需求日益提高，建立标准实验方案显得尤为重要。由于该方法具有高度的稳定性，并且在获取用于治疗应用的寡核苷酸方面具有潜力，亚磷酰胺化学正经历复兴。尽管购买寡核苷酸具有吸引力，但修饰的寡核苷酸价格较高且供应受限，这使得研究者更倾向于在实验室内部自行制备这些寡聚物，从而使该方法变得极为重要。开始该操作时，将每种亚磷酰胺称重至已烘干的10毫升棕色瓶中，并用已用20号针头穿刺过的小瓶隔垫密封每个瓶子。使用含有干燥剂的干燥器立即对瓶子进行真空处理。在干燥器中充满干燥的氩气后，取出每个瓶子，并立即加入无水乙腈，然后将其连接到固相多肽合成仪上。接着，取下每个瓶子的隔垫，通过仪器的换瓶功能将其放置到合成仪上。要设置固相合成，请选择软件图标。选择合成仪名称，然后点击“确定”。接着，通过选择“文件”和“新建合成任务”来创建新的合成任务。随后，在提示窗口中输入运行日期、客户名称和运行编号。选择仪器、序列名称和序列。在“循环”选项卡下，指定先前创建的方法。然后，选择“手动结束程序”，此程序将寡核苷酸保留在 CPG 树脂上。选择“去除 DMT”。通过选择“文件”和“另存为”来保存文件。然后，为实验提供一个名称并点击“保存”。接下来，通过选择“订单”和“发送订单至合成仪”来发送文件以开始合成。在提示窗口中，选择一个柱位置并点击“确定”。在合成仪窗口中，选择三苯甲基监测。单击“选择功能”，然后通过输入 1 来每步启动三苯甲基监测。选择“合成仪”并准备开始，以启动合成。将带有目标 3' 端的柱子放置在仪器上指定的位置。然后，在仪器上点击 Start 和 No。合成完成后，从仪器上取下色谱柱并放入圆底烧瓶中。在减压条件下干燥色谱柱约0.5小时。将白色树脂从层析柱转移至1.6毫升离心管中，加入0.5毫升水相甲胺和氨水溶液。用封口膜封紧离心管盖，将内容物在60摄氏度加热一个半小时。在管子上方放置重物，以确保浓度保持恒定。冷却至室温后，短暂离心样品以使管壁上的液体沉降至管底。然后，将上清液转移至新的离心管中。将离心管置于干冰-乙醇浴中5分钟，冷却至-70 °C，随后使用真空离心浓缩仪浓缩至干燥。现在，将沉淀物重悬于 0.4 毫升胺三氢氟化物溶液中，然后用实验室封口膜封紧管盖。将溶液在 60 摄氏度加热一个半小时。在管子上方放置重物，以确保浓度保持恒定。将溶液冷却至室温后，加入0.04毫升醋酸钠溶液，并用移液器枪头轻轻混匀。加入1毫升乙醇，然后将溶液置于干冰-乙醇浴中冷却至约70摄氏度，持续15分钟。随后，在4摄氏度条件下以15,000 RPM离心10分钟。使用移液器吸取上清液，并在减压条件下将所得沉淀干燥。干燥后，将获得的固体重新悬浮于上样缓冲液中，混匀至溶液均匀。然后，将该悬浮液上样至预先制备好的聚丙烯酰胺凝胶中。电泳至溴百里酚蓝指示剂迁移至凝胶下端约二分之一至三分之二处。将凝胶从电泳装置中取出后，将玻璃板中的凝胶内容物转移至保鲜膜上，置于覆盖有硅胶的薄层色谱板上，用紫外灯观察条带。用记号笔标出上层条带的位置，并用刀片将其切下。将含有 RNA 的凝胶放入一个 50 毫升的锥形管中，用玻璃棒将其碾碎成小块。接着，将凝胶残渣悬浮于氯化钠水溶液中，在 37 摄氏度下振荡悬浮液 12 小时。将悬浮液转移至 15 毫升离心管中，然后以 3400 RPM 离心 10 分钟。使用反相C18柱对样品进行脱盐时，首先用乙腈、水、氯化铵水溶液和RNA溶液依次洗涤柱子，使凝胶残留物留在柱上。用水洗涤后，用三毫升60%的甲醇水溶液分三次洗脱RNA至三个不同的离心管中。将离心管置于干冰浴中冷却至-70摄氏度，持续五分钟，然后使用真空浓缩仪将溶液浓缩至干燥。在减压条件下浓缩洗脱液后，将残留物重新溶解于0.3毫升无RNase的水中。稀释溶液后，取1微升样品加入紫外-可见光谱仪，测定200至450纳米范围内的紫外-可见吸收光谱。进行MALDI-TOF分析前，先用50%乙腈清洗C18移液枪头。用0.1%三氟乙酸平衡移液枪吸头。然后，将含有100至150皮摩尔样品的溶液加入移液枪吸头中。用0.1%三氟乙酸和水洗涤移液枪吸头后，将样品洗脱至含有目标基质的溶液中。将0.9微升溶液点样至MALDI靶板上，并让样品自然干燥。进行RNA结构分析时，将含有RNA的样品转移至微量比色皿中，并置于圆二色光谱仪的样品架上。打开氮气罐，调节气流使仪器上的空气浮子位置升至约40。然后，打开冷却器。接着，启动仪器。通过单击 Spectrum Manager 图标打开软件，再单击 Spectrum Measurement 打开采集窗口。用氮气吹扫仪器后，选择“测量”和“参数”以获取圆二色光谱。在“常规”选项卡下，设置扫描范围为200-350纳米，通道选择CD和HT，数据间距为0.1纳米，扫描速度为100纳米/分钟，带宽为1纳米，累加次数为5次。在“样品池单元”选项卡下，选择20摄氏度。在“控制”选项卡下，选择“快门自动开启和关闭”。在“信息”选项卡下，输入样品名称、操作者、浓度和溶剂。在“数据”选项卡下，浏览至目标文件夹，然后点击“确定”。通过点击“测量”和“样品测量”来采集光谱。最后，确认样品架中从一到六比色皿的位置，然后单击“确定”。这四条RNA链通过固相合成获得，纯化后每种寡核苷酸的产量在300至700纳摩尔之间。此处展示了寡核苷酸的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）图谱。在260纳米处的吸收峰，无论是单链样品还是双链结构，修饰与未修饰寡核苷酸的归一化紫外-可见光谱均未观察到显著差异。然而，在测定其圆二色光谱时可观察到微小变化。此外，三种双链结构的Tm值测量结果显示了明显差异，表明其中一条链上引入2'-正丙基苯甲基修饰后导致了稳定性下降。需要牢记的是，固相合成的产率依赖于试剂的纯度。水分会对每一步骤产生负面影响，因此必须始终确保所含水量为试剂级。本报道的方法学旨在为科研人员提供一种通用资源。该技术可根据所需的修饰方式、可用的仪器设备或时间限制而有所变化。本文所采用的化学方法是一种非常可靠的成熟技术，自20世纪80年代以来一直被广泛使用，目前在学术界和工业界仍被大量应用。观看本视频后，您应能够独立完成RNA或DNA的修饰或标准寡核苷酸的合成、纯化及表征。请注意，操作所需试剂可能存在危险性，务必全程佩戴防护设备，如护目镜、手套和实验服。所有试剂均应小心操作，必要时应在通风橱内进行。

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