含2'-O-苯硫甲基修饰的RNA寡聚物的固相合成方案及圆二色性表征

本报告的总体目标是展示通过固相合成法获得RNA寡核苷酸的实验步骤。将以RNA十二聚体作为模型进行合成，并演示其纯化与表征方法。通过其可视化内容，本出版物将拓展相关方法学和技术平台的应用范围，为各个领域的研究人员提供参考。

提供可视化辅助工具并辅以简要的实验方案，将有助于研究人员应用这些技术。该技术的一个优势在于其易于进行多种改进。随着当今应用需求日益提高，建立标准实验方案显得尤为重要。

由于该方法具有高度的稳定性，并且能够获得用于治疗应用的寡核苷酸，磷酸亚胺酯化学正经历复兴。尽管购买寡核苷酸具有吸引力，但修饰核苷酸的价格和可获得性促使研究人员将兴趣转向在实验室内部自行制备这些寡聚物，从而使该方法变得极为重要。开始该操作时，将每种磷酸亚胺酯称量至已烘干的10毫升棕色瓶中，并用已用20号针头预先穿孔的隔垫密封每个瓶子。

使用含有干燥剂的干燥器立即将瓶子置于真空下。在干燥器中充满干燥氩气后，取出每个瓶子，并立即加入无水乙腈，然后将其连接到固相多肽合成仪上。接着，取下每个瓶子的隔垫，通过仪器的换瓶功能将瓶子放置到合成仪上。

要设置固相合成，请选择软件图标。选择合成仪名称，然后单击“确定”。接着，通过选择“文件”和“新建合成任务”来创建新的合成。随后，在弹出窗口中输入运行日期、客户信息和运行编号。选择仪器、序列名称和序列。

在“循环”选项卡下，指定先前创建的方法。然后选择“手动结束程序”，此程序将使寡核苷酸保留在 CPG 树脂上。选择“DMT 关闭”。

通过选择“文件”和“另存为”来保存文件。然后，为实验提供一个名称并点击“保存”。接下来，通过选择“订单”和“发送订单至合成仪”来发送文件以开始合成。在提示窗口中，选择一个柱位置并点击“确定”。在合成仪窗口中，选择“三苯甲基监测”。

单击“选择功能”，然后通过输入 1 来每步启动三苯甲基监测。选择“合成仪”并准备开始，以启动合成。将带有目标 3' 端的柱子放置在仪器上指定的位置。

然后，在仪器上点击“开始”和“否”。合成完成后，从仪器上取下柱子并放入圆底烧瓶中。在减压条件下干燥柱子约0.5小时。

将白色树脂从柱子转移至1.6毫升离心管中，加入0.5毫升甲胺和氨水溶液。用封口膜封紧离心管盖子，将内容物加热至60摄氏度，持续一个半小时。在管子上方放置重物，以确保浓度保持恒定。

冷却至室温后，短暂离心样品以使管壁上的液体沉降至管底。然后，将上清液转移至新的离心管中。将离心管置于干冰-乙醇浴中5分钟，冷却至70摄氏度，随后使用真空离心浓缩仪浓缩至干燥。

现在，将沉淀物重悬于 0.4 毫升胺三氢氟化物溶液中，然后用实验室封口膜封紧管盖。将溶液在 60 摄氏度加热一个半小时。在管子上方放置重物，以确保浓度恒定。

将溶液冷却至室温后，加入 0.04 毫升醋酸钠溶液，并用移液器枪头轻轻混匀。加入 1 毫升乙醇，然后将溶液置于干冰-乙醇浴中冷却至约 70 摄氏度，持续 15 分钟。随后，在 4 摄氏度条件下以 15,000 转/分钟离心 10 分钟。

使用移液器吸取上清液，并在减压条件下干燥所得沉淀。干燥后，将获得的固体重新悬浮于上样缓冲液中，混匀至溶液均匀。然后，将该悬浮液上样至预先制备好的聚丙烯酰胺凝胶中。

电泳至溴百里酚蓝标记迁移至凝胶下端约二分之一至三分之二处。将凝胶从电泳装置中取出后，将玻璃板中的凝胶内容物转移至塑料膜上，置于覆盖有硅胶的薄层色谱板上，用紫外灯观察条带。用记号笔标出上层条带的位置，并用剃刀片将其切下。

将含有 RNA 的凝胶放入一个 50 毫升的锥形管中，用玻璃棒将其碾碎成小块。接着，将凝胶残渣悬浮于氯化钠水溶液中，在 37 摄氏度下振荡悬浮液 12 小时。将悬浮液转移至 15 毫升离心管中，然后在 3400 转/分钟下离心 10 分钟。

使用反相C18柱对样品进行脱盐时，首先用乙腈、水、氯化铵水溶液和RNA溶液依次洗涤柱子，使凝胶残留物留在柱上。用水洗涤后，用三毫升60%的甲醇水溶液分三次洗脱RNA至三个不同的离心管中。将离心管置于干冰浴中冷却至-70摄氏度，持续五分钟，然后使用真空离心浓缩仪将溶液浓缩至干燥。

在减压条件下浓缩洗脱液后，将残留物重新溶解于0.3毫升无RNase的水中。稀释溶液后，取1微升样品加入紫外-可见光谱仪，测定200至450纳米范围内的紫外-可见吸收光谱。进行MALDI-TOF分析前，先用50%乙腈清洗C18移液枪头。

用0.1%三氟乙酸平衡移液枪头。然后，将含有100至150皮摩尔样品的溶液加入移液枪头中。用0.1%三氟乙酸和水清洗移液枪头后，将样品洗脱至含有目标基质的溶液中。

将0.9微升溶液点样至MALDI靶板上，并让样品自然干燥。进行RNA结构分析时，将含有RNA的样品转移至微量比色皿中，并置于圆二色光谱仪的样品架上。打开氮气罐，调节气流使仪器上的空气浮子位置升至约40。

然后，打开冷却器。现在，启动仪器。单击 Spectrum Manager 图标打开软件，再单击 Spectrum Measurement 打开采集窗口。

用氮气吹扫仪器后，选择“测量”和“参数”以获取圆二色光谱。在“常规”选项卡下，设置扫描范围为200-350纳米，通道选择CD和HT，数据间距为0.1纳米，扫描速度为100纳米/分钟，带宽为1纳米，累加次数为5次。在“样品池单元”选项卡下，选择20摄氏度。

在“控制”选项卡下，选择“快门自动开启和关闭”。在“信息”选项卡下，输入样品名称、操作者、浓度和溶剂。在“数据”选项卡下，浏览至目标文件夹，然后点击“确定”。通过点击“测量”和“样品测量”来采集光谱。

最后，确认样品架中从一到六比色皿的位置，然后点击“确定”。这四条RNA链通过固相合成获得，纯化后每种寡核苷酸的产量在300至700纳摩尔之间。此处展示了这些寡核苷酸的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）图谱。在260纳米处的吸收峰，无论是单链样品还是双链结构，修饰与未修饰寡核苷酸之间的归一化紫外-可见光谱均未观察到显著差异。

然而，在测定其圆二色光谱时可观察到微小变化。此外，三种双链结构的 Tm 值测量结果显示了不同的数值，表明在其中一条链上引入2'-正丙基苯甲基修饰会导致稳定性降低。需要牢记的是，固相合成的产率依赖于试剂的纯度。

水分会对每一步骤产生负面影响，因此必须始终确保所存在的水量为试剂级。本报道的方法旨在为科研人员提供一种通用资源。该技术可能因所需的修饰方式、可用的仪器设备或时间限制而有所不同。

本文所采用的化学方法是一种非常可靠的成熟技术，自20世纪80年代以来一直被广泛使用，目前在学术界和工业界仍被大量应用。观看本视频后，您应能够独立完成RNA或DNA的修饰或天然寡核苷酸的合成、纯化及表征。请注意，操作所需试剂可能存在危险性，务必全程佩戴防护装备，如护目镜、手套和实验服。

所有试剂均应小心操作，必要时应在通风橱内进行。