用于固相合成含有2'- 0

本报告的总体目标是说明通过固相合成获得 RNA 寡核苷酸的程序。RNA 的十二聚体将被合成为模型，并且还将展示它们的纯化和表征。通过其视觉组件，该出版物将拓宽各个领域研究人员使用的方法和设施的范围。

提供视觉辅助工具以及一些协议将使研究人员能够使用这些技术。这种技术的一个优点是它适用于广泛的修改。随着当今的应用程序要求越来越高，拥有标准协议非常重要。

亚磷酰胺化学由于该方法的稳定性及其获得用于治疗应用的寡核苷酸的潜力而正在复兴。虽然购买寡核苷酸很有吸引力，但修饰的价格和可用性将兴趣转移到内部制备这些寡聚体，因此使该程序变得至关重要。要开始此过程，将每种亚磷酰胺称量到烘箱干燥的 10 毫升琥珀色瓶中，并用先前用 20 号针头穿孔的隔膜盖住每个瓶子。

使用含有干燥剂的干燥器立即将瓶子置于真空下。用干氩气填充干燥器后，取出每个瓶子并立即加入无水乙腈，然后固定到固相肽合成器上。接下来，从每个瓶子中取出隔垫，并通过换瓶功能放在合成器上。

要设置固相合成，请选择软件图标。选择 synthesizer 名称，然后单击 OK。然后，通过选择 File 和 New Synthesis Order 来创建新的综合。然后，使用提示窗口输入运行日期、客户和运行 ID。选择仪器、序列名称和序列。

在 Cycle 选项卡下，分配之前创建的方法。然后，选择"结束程序"手册，使寡核苷酸与 CPG 填料结合。选择 DMT Off。

通过选择 File （文件） 和 Save As（另存为）来保存文件，然后，为实验提供一个名称，然后单击 Save（保存）。接下来，通过选择 Order 和 Send Order to Synthesizer 来发送文件以开始合成。在提示窗口中，选择列位置，然后单击 OK。在 Synthesizer 窗口中，选择 Trityl Monitor。

点击 选择功能，然后通过键入 1 每一步进行 Trityl 监控。通过选择 Synthesizer 和 Prepare to Start 开始合成。将具有所需三引物端的色谱柱放在仪器上指示的位置。

然后，单击仪器上的开始和否。合成完成后，从仪器中取出色谱柱并将其放入圆底烧瓶中。减压干燥色谱柱约 0.5 小时。

将白色树脂从色谱柱转移到 1.6 mL 离心管中，并加入 0.5 mL 甲胺和氨水溶液。用封口膜固定离心管盖，将内容物加热至 60 摄氏度 1 个半小时。在试管顶部放置一个重物，以确保浓度保持恒定。

冷却至室温后，短暂离心样品以降低内容物。然后，将上清液转移到新的离心管中。将试管置于干冰乙醇浴中 5 分钟，将试管冷却至 70 摄氏度，然后使用 speed vac 浓缩器浓缩至干燥。

现在，将固体重悬于 0.4 mL 胺三氢氟化物溶液中，然后用实验室胶片固定盖子。将溶液加热至 60 摄氏度一个半小时。在试管顶部放置重物以确保恒定浓度。

将溶液冷却至室温后，加入 0.04 毫升乙酸钠溶液，然后用移液器吸头轻轻混合。加入 1 毫升乙醇，用干冰乙醇浴将溶液冷却至约 70 摄氏度 15 分钟。然后，在 4 摄氏度下以 15， 000 RPM 的速度离心溶液 10 分钟。

使用移液管提取上清液并在减压下干燥所得沉淀。干燥后，重悬获得的固体和上样缓冲液，并混合至溶液均匀。然后，将悬浮液上样到先前制备的聚丙烯酰胺凝胶上。

在凝胶中施加电流，直到溴化甲基醇蓝色标记物位于凝胶下方的二分之一到三分之二之间。从支架上取下凝胶后，将凝胶内容物从玻璃杯转移到保鲜膜上，并放在覆盖有二氧化硅的薄层色谱板上，以使用紫外灯观察条带。用记号笔划定上带所在的位置，然后用剃须刀片切割。

将含有 RNA 的凝胶放入 50 毫升锥形管中，并使用玻璃棒将其粉碎成小块。现在，将凝胶残留物悬浮到氯化钠水溶液中，并在 37 摄氏度下摇动悬浮液 12 小时。将悬浮液转移到 15 毫升试管中，然后以 3400 RPM 离心 10 分钟。

要使用反相 C18 小柱对样品进行脱盐，首先用乙腈、水、氯化铵水和 RNA 溶液清洗小柱，留下凝胶残留物。用水洗涤后，使用 3 毫升 60% 甲醇水溶液将 RNA 从色谱柱中洗脱到三个不同的试管中。在干冰浴中将试管冷却至 70 摄氏度 5 分钟，然后使用 speed vac 浓缩器将内容物浓缩至干燥。

在减压下浓缩洗脱液后，将残留物重新溶解在 0.3 mL 不含 RNase 的水中。稀释溶液后，在紫外可见分光光度计上沉积 1 微升，以测量 200 至 450 纳米之间的紫外可见分光光度。对于 MALDI-TOF 分析，首先用 50% 乙腈清洗 C18 移液器吸头。

用 0.1% 三氟乙酸平衡移液器吸头。然后，在移液器吸头中加入含有 100 至 150 皮摩尔样品的溶液。用 0.1% TFA 和水清洗移液器吸头后，将样品洗脱到含有所需基质的溶液中。

将 0.9 μL 溶液沉积在 MALDI 板上，让样品干燥。对于 RNA 结构分析，将含有 RNA 的样品转移到微量比色皿中，并放置在圆二色谱仪的进样器中。打开氮气罐，提供一个流量，将仪器上的空气浮子移动到大约 40。

然后，打开冷却器。现在，打开仪器。单击 Spectrum Manager 图标打开软件，然后单击 Spectrum Measurement 打开 Acquisition 窗口。

用氮气吹扫仪器后，通过选择 Measure 和 Parameters 获取圆二色光谱。在"常规"选项卡下，选择 200-350 纳米进行扫描，选择"CD 和 HT"作为通道，选择"0.1 纳米"作为数据间距，选择"每分钟 100 纳米"作为扫描速度，选择"1 纳米/分钟"作为带宽，选择"5"作为累积次数。在 Cell Unit （单元格单位） 选项卡下，选择 20 摄氏度。

在 Control 选项卡下，选择 Shutter is opened and closed automatically。在 Information 选项卡下，输入样品名称、作员、浓度和溶剂。在 Data 选项卡下，浏览到所需的文件夹，然后单击 OK。通过单击 Measure 和 Sample Measurement 获取光谱。

最后，确定样品进样器 1 到 6 中比色皿的位置，然后单击 OK（确定）。通过固相合成获得四条 RNA 链，纯化后产生 300 至 700 纳摩尔的每种寡核苷酸。寡核苷酸的 MALDI-TOF 色谱图如下所示。无论是比较单链样品还是双链结构，通过比较 260 nm 处的谱带与经典和修饰的寡核苷酸，均未观察到归一化紫外可见分光光谱的重大差异。

然而，在测量它们的圆二色光谱时观察到微小的变化。此外，三个双链结构的 Tm 测量值显示出一个明显的值，该值表明由两个主要 othyo phenylmethyl 修饰掺入其中一条链上诱导的不稳定。重要的是要记住，固相合成的产量取决于试剂的纯度。

水分会对每个步骤产生负面影响，因为必须始终使用试剂。报告的方法旨在作为科学家的通用资源。该技术可能因所需的修改、可用的检测或时间限制而异。

本文采用的化学类型代表了一种非常强大的方法，该方法自 1980 年代以来一直在使用，并且仍然在学术和工业环境中大量使用。观看本视频后，您应该能够对自己的 RNA 或 DNA 修饰或经典寡核苷酸进行合成、纯化和表征。不要忘记，使用必要的试剂可能很危险，并且应始终佩戴护目镜、手套和实验室外套等防护设备。

应小心处理所有试剂，并在适当时放入通风橱内。