Name: RGB 和光谱根成像植物表型和生理研究: 实验装置和成像协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学习RGB与高光谱成像技术用于植物根系表型分析的方法。该技术结合根盒培养系统，可获取根系结构动态与功能信息，为作物抗逆育种研究提供重要数据支持。

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作者感谢奥地利科学基金 FWF 通过项目编号 P 25190-B16（干旱抗性的根源）提供的资助。高光谱成像基础设施的建立得到了下奥地利州联邦政府（Land Niederösterreich）通过项目 K3-F-282/001-2012 的资金支持。甜菜实验的额外资金由 AGRANA Research 提供 &amp;#38; 创新中心有限公司（ARIC）。作者感谢Craig Jackson在实验期间提供的技术支持以及对稿件的英文校对。我们还感谢Markus Freudhofmaier在建立RGB成像系统方面所做的贡献，以及Josef Schodl在构建根盒支架方面的帮助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

该方案提供了两种互补的方法用于土壤中根系系统的成像。获得可靠实验结果的关键步骤是根箱（rhizobox）的填装，必须确保前端玻璃表面的基质层均匀且一致，以在观察窗口处实现根系与土壤的紧密接触，并避免产生气隙。因此通常使用粒径小于&#60; 2 mm 的细筛土壤，主要原因在于：较大的土粒会增加观察窗口处的表面形貌不均，颗粒之间形成空隙。这不仅增加了根尖脱水的风险，还要求采用更复杂的图像处理技术来进行水分分布的映射31。
因此，本方案的改进主要集中在提高根盒填充效率并缩短填充时间。目前每个根盒的填充时间约为30分钟。此外，正在测试使用带有双面玻璃窗的根盒以实现双侧成像，并对光照系统进行改进以优化光照均匀性，从而获得更高质量的RGB图像。未来的硬件扩展还可能考虑将平面光极32以及电容成像技术33整合到根盒系统中。但这些内容已超出当前的升级计划。
软件改进主要集中在自动图像配准，以融合顶部和底部的RGB图像34。对于高光谱成像，测试了先进的无监督特征提取方法28，以及更灵敏的有监督目标检测方法（如支持向量机SVMs35）。由此，高光谱数据有望用于评估多种土壤、根际和根系特性36。此外，计划基于改进版的根系分析系统Root System Analyzer37，开发一套（半）自动化的根箱根系图像分析软件，用于量化形态学参数（如长度、直径、表面积）以及构型特征（如分枝频率、分枝角度）。
与三维成像方法相比，该实验方案的主要局限性在于仅能观察到可见的根系表面及其根际特性。然而已有研究表明，可见根系性状可作为整个根系系统的可靠代理指标21。根盒技术可轻松结合传统的破坏性取样（洗涤法），在动态生长成像结束后对可见性状与整体根系性状之间的关系进行验证。由于该关系可能因物种而异21，因此建议在针对不同作物物种开展新的表型分析系列实验时，进行破坏性取样以确保由可见性状推断出的结果具有可靠性。
本方案的关键优势在于结合了真实的生长条件（土壤）、相对较高的时间分辨RGB成像通量，以及通过高光谱成像获得的化学计量学根系与根际数据对根系功能（如水分吸收）进行推断。因此，该方法克服了高通量幼苗及非土壤条件下根系成像方法在功能推断方面的局限性14，同时相较于复杂的三维成像方法，能够在实验复杂度较低且通量较高的条件下，部分实现对功能过程的深度表型解析15。
在接下来的实验中，该方案将用于研究菌根对豆科植物根系发育及其功能的影响，以及与土壤结构、氮素和碳循环相关的覆盖作物物种根系特征的表型分析。

根为植物提供多种重要功能，例如同化物的储存、陆生植物在土壤中的固着，以及水分和养分的吸收与运输1。从进化角度看，根轴的形成被认为是陆生植物起源的基本前提之一2。尽管根具有如此重要的作用，但在历史上，根在生物学研究中仅处于边缘地位。然而近年来，科学界对植物根系的兴趣日益增加，如图1所示。
<img alt="根系研究趋势图，1960年代至今植物研究中根系研究呈指数增长。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：根系研究在植物科学中的重要性。 
近几十年来，在SCI期刊发表的所有植物研究中，与根系相关的研究数量所占的百分比。数据来源于Scopus数据库，检索关键词为“plant”和“plant AND root”。 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
可以推测，近年来根系研究取得进展主要有两个原因。首先，由于全球变化的影响，陆地植被正面临更频繁的环境胁迫3。在农作物生产背景下，据估计，全球约有30%的农业用地受到水分和磷素的限制4,5。作物产量因胁迫而降低是导致全球雨养农业生态系统实际产量与潜在生产力之间存在显著产量差的主要原因，该产量差估计可达潜在生产力的50%以下6。除了资源可用性低之外，这还与资源利用效率低下有关，即植物开发利用可用资源的能力不足7。这会导致硝酸盐等移动性资源的流失，进而对其他生态系统产生负面影响。例如，当前全球氮素利用效率估计仅为47%8。因此，通过改进管理方法和培育优良品种以提高资源利用效率，对于持续增加农业产出以及实现环境可持续性均具有重要意义。在此背景下，植物根系被认为是改良作物和种植系统的关键目标9,10。
近期人们对植物根系产生兴趣的第二个重要背景是测量方法的技术进步。长期以来，根系研究方法受到两个关键挑战的限制：对于在土壤中生长的植物根系，为了进行定量分析，必须将其分离出来，主要通过水洗法11，但这一过程会破坏根轴的构型结构。In-situ 根系观测虽可采用挖掘方法，从而保留根系在土壤中的自然位置，并已用于植物学描述12，但该方法耗时极长，因此无法满足比较性根系结构-功能分析的高通量需求。另一方面，根系构型的高通量测量大多在人工培养基上进行，且主要针对幼苗期植物13，其结果外推至植物自然生长环境的可靠性尚存疑问14。
根系研究的近期繁荣与成像技术的进步密切相关15。根系研究中的成像方法大致可分为三类。第一类是高分辨率三维成像技术，如CT和MRI16。这些方法最适合用于研究植物根系与土壤之间的相互作用过程，例如干旱诱导的木质部栓塞17。通常应用于相对较小的样品，可在其中实现详细的观察。文献18提供了针对不同尺寸花盆和细根成像的CT与MRI方法比较。第二类是高通量成像方法19,20。这类方法主要基于对在人工培养基（如凝胶、发芽纸）上生长的根系进行常规二维RGB成像，由于对比度较高，可相对简便地将根系与背景分离。该方法适用于在标准化的人工生长条件下，对不同作物基因型幼苗的根系性状进行高通量比较13。介于上述两类之间的是根际盒（rhizobox）方法：该方法利用二维成像技术对在土壤中长期生长的根系进行观测，具有中等通量21,22。当前（二维）根系成像面临的一个新挑战是，除了描述根系结构外，还需同时捕捉反映根系功能的指标23。
本文介绍了利用（i）一种廉价且简单的自制RGB成像装置，以及（ii）一种更为复杂的近红外（NIR）成像装置，对在根盒（rhizobox）中生长的根系进行成像的实验方案。文中展示了由这两种装置获得的示例结果，并结合植物表型分析与植物生理学研究对结果进行了讨论。

<table><tbody><tr><td>根箱</td><td>Technisches B&amp;uuml;ro f&amp;uuml;r Bodenkultur</td><td>实验装置制作者</td><td></td></tr><tr><td>LED 植物生长灯 ATUM HORTI 600</td><td>Klutronic</td><td>AHI10600F</td><td></td></tr><tr><td>荧光灯管 HiLite T5 日光型</td><td>Juwel Aquarium</td><td>86324</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯管 Eurolite 45 cm 细管 15 W</td><td>Conrad</td><td>593384 - 62</td><td></td></tr><tr><td>佳能 EOS 6D 相机</td><td>Canon Austria GmbH</td><td>8035B024</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 扩展版 12.0 x 32</td><td>Adobe Systems Software Ireland Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinRhizo Pro v. 2013</td><td>Regent Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xeva-1.7-320 短波红外相机</td><td>Xenics</td><td>XEN-000105</td><td></td></tr><tr><td>光谱仪 Imspector N25E</td><td>Specim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高光谱成像扫描仪</td><td>Carinthian Tech Research AG</td><td>实验装置制作者</td><td>高光谱成像扫描仪及其软件的设计与组装</td></tr><tr><td>Matlab R2016a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>包含图像处理、信号处理以及统计与机器学习工具箱</td></tr><tr><td>AP4 气孔计</td><td>Delta-T-Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-3100C 叶面积测量仪</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BASF Styradur 聚苯乙烯板</td><td>Obi Baumarkt</td><td>9706318</td><td>可使用不同类型聚苯乙烯板或其他材料，以分隔不同湿度的土壤</td></tr></tbody></table>

用于植物表型分析与生理学研究的rgb与光谱根系成像：实验设置与成像方案

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

深入了解植物根系动态对于提高农业系统的资源利用效率以及增强作物品种对环境胁迫的抗性至关重要。本文介绍了一种用于根系系统RGB成像和高光谱成像的实验方案。该方法采用根箱（rhizobox）系统，使植物在自然土壤中长期生长，以观察其充分发育的根系结构。实验设置以水分胁迫条件下根箱中植物的评估及根系功能研究为例进行说明。文中描述了一种基于RGB成像的低成本、快速量化根系随时间发育情况的技术方案。相比基于RGB颜色阈值分割的方法，高光谱成像可显著提升根系与土壤背景之间的分割精度。高光谱成像的独特优势在于能够获取根-土系统的化学计量信息，从而实现对系统功能的深入理解。本文通过高分辨率土壤含水量分布图对此进行了验证。然而，与RGB成像相比，高光谱成像在图像采集、处理与分析方面更为复杂。结合两种方法可优化对根系系统的全面评估。文中还提供了整合根系与地上部分性状的应用实例，适用于植物表型分析和植物生理学研究领域。为进一步提升根系成像效果，可通过采用不同光源优化照明条件以提高RGB图像质量，并扩展图像分析方法，从光谱数据中推断根区特性。

展示了基于RGB和高光谱成像的根系分割示例结果。对于光谱成像，提供了高分辨率水分分布图的示例。最后展示了基于图像的根系数据在科学研究背景中的应用结果。
基于 RGB 的根系测量
图8展示了甜菜品种Ferrara的根系RGB图像时间序列。这些图像显示出由于根盒光照不均匀而产生的一些伪影，在根盒左侧区域亮度较高，且上下两幅图像重叠区域的亮度存在差异。
<img alt="RGB根系生长研究，甜菜品种‘Ferrara’，播种后第20至35天，延时分析，生长图示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：基于RGB成像的根系生长时间序列。 
图片显示了甜菜品种Ferrara在播种后不同天数（DAS）的生长情况。图像中存在一些伪影，由图像左侧光照不均以及上下图像之间的光照差异所致。比例尺为2 cm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图9展示了在播种后第35天（DAS）对Ferrara品种基于颜色阈值的根系分割细节。作为参考（图9A），使用了一幅通过绘图板手动追踪所有根系的二值图像。手动追踪整个完全发育且密集的甜菜根系系统所需时间约为四小时。图9B放大显示了图像顶部一个选定区域，该区域存在较老的侧根。在此处，部分根轴未被颜色阈值法正确分类。相反，在图像底部（图9C），白色的新根占主导地位，基于颜色的分割方法能够准确分类所有根轴。二值化后的根系图像（图9D）在左侧显示出因光照伪影造成的黑色区域，该区域在进行定量分析前已被定义为排除区域。图9E显示了在播种后第35天Ferrara品种RGB图像红通道中所选特征（根系与土壤）对应的像素直方图。根系像素（蓝色）明显呈现三个峰值，分别对应明亮的新侧根、深色的老侧根以及主根。老侧根与土壤背景之间的重叠非常显著，导致部分根轴未能被分类（参见 图9B）。
<img alt="基于RGB颜色的根系分割示意图，包含根系类型和土壤差异的直方图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 9"> 
图9：利用颜色阈值进行根系分割。 
(A) 使用图形数位板手动分割的根系系统，(B) 图像上部为旧根轴分割效果较差的区域，(C) 图像下部为正确分割的幼根轴，以及 (D) 基于颜色阈值分割获得的二值图像。(E) RGB图像所选特征的像素直方图。蓝色条形代表根系，并标注了不同根系类型；红色条形代表土壤。A和D中的比例尺为2 cm；B和C中的比例尺为1 cm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
手动分割参考图像所量化的总可见根长为 1534.1 cm，而基于颜色的自动化分割得到的总根长为 1427.6 cm。
在此所示的情况下，紫外光照射获得的灰度图像并未表现出优势，与彩色阈值法相比效果较差（根长：1679.7 cm）。由于紫外灯的光照强度较低，老根无法被有效分割，且图像中噪声更多。然而，对于具有较强自发荧光的幼根以及背景基质较亮的情况，紫外光照射仍可能是一种可行的选择，如另一项实验中以沙子作为背景基质所获得的图像所示（图10）。
<img alt="荧光显微镜；根系结构；左侧为蓝色调共聚焦图像，右侧为明场图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图10"> 
图10：利用紫外光照在明亮背景下观察根系。 
示例为生长在装有石英砂的根盒中的硬粒小麦根系。根盒在（A）紫外光和（B）荧光（日光）照射下成像。比例尺为2 cm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
基于 HSI 的根系测量
图11展示了三个根部感兴趣区域（老侧根、嫩侧根、主根）和两个土壤感兴趣区域（根箱顶部和底部）的平均光谱。
<img alt="根系光谱分析图，归一化反射率与波长关系，土壤与根系比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图11"> 
图11：根系与土壤的平均光谱。 
来自根系区域（三种根类型）和土壤区域（根箱顶部和底部）感兴趣区域（ROIs）的光谱。选择这些感兴趣区域旨在确定根系与土壤之间最佳的分割标准。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
显然，主根和幼嫩侧根在大多数光谱波段的强度上与背景存在显著差异，而老化的侧根与背景的强度差异则小得多。可通过视觉推断的一个特征是，在水吸收区域（1450 nm）附近光谱斜率的不同。在此区域，根系光谱的斜率高于土壤光谱。此外，可在主根和幼嫩侧根光谱中观察到在约1100 nm区域发生的变化，而该变化在老化的侧根中并不存在。
图12A展示了搜索算法识别出的具有最强前景-背景对比度的光谱比值结果。1476 nm与1076 nm处光谱的比值可实现根系与土壤之间最佳的分离效果。图12B显示了根系前景和土壤背景像素的相应直方图。尽管存在部分重叠，大多数像素仍可明显地与土壤背景区分开来。通过对直方图拟合双峰高斯曲线并采用巴塔恰里亚距离（Bhattacharyya distance）进行量化，得到数值为7.80。当该值高于3.0时，表明图像对比度强，可实现可靠的分离28。
<img alt="波长强度分析的光谱热图与直方图；光学发射数据的分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图12"> 
图12：不同光谱波段比值下根部前景与土壤背景之间的反射率差异，以及用于分割的光谱比值下的像素直方图。 
(A) 明亮颜色（黄色）表示前景与背景之间具有高对比度，深色（蓝色）表示低对比度。前15个波段因噪声干扰已被剔除。红线标示出对比度最高的波段比值。 (B) 在用于分割的光谱比值下，根部（蓝色）与土壤（红色）的像素直方图。蓝色条代表根部，红色条代表土壤。强度值对应于第160光谱波段与第49光谱波段的比值。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过应用全局强度阈值对识别出的光谱比值进行处理，得到二值图像（图13），该阈值为根据直方图距离计算出的1.00827。对该图像的根长进行分析，得到总长度为1557.3 cm，与手动追踪获得的参考图像相比，误差仅为1.5%。
<img alt="神经网络结构示意图；树突树；显微图像；神经元连接可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig13.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图13"> 
图13：甜菜品种Ferrara根系的二值图像。 
该图像是通过应用全局光谱阈值获得的。比例尺（左下角），2 cm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
尽管与基于颜色的信息相比，利用光谱信息已改善了根系分割效果，但高光谱成像的主要目的仍是化学计量图像特性的分析。这可通过绘制根箱图像中水分含量的分布图来加以说明。
图14A 显示了校准根盒中各隔室的平均光谱（参见 图7），这些隔室填充了不同含水量的土壤。各隔室之间的光谱形状相似，因此在此情况下，光谱比值并不一定提供更稳定的分类依据。因此，选择在单一光谱波段（1680 nm）处的强度作为最佳区分指标，该波段处相邻含水量之间的平均差异最大。该光谱波长对应的像素直方图如图14B所示。
<img alt="光谱分析图；(A) 吸收光谱，(B) 湿-干状态的强度分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig14.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图14"> 
图14：用于水分含量校准的光谱特征。 
(A) 校准根箱中九个不同含水量水区的平均光谱；(B) 在波段216处水区的像素直方图，该波段处相邻水区之间的平均距离最大。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
平均像素强度在1680 nm处与测得的含水量之间的关系如图15所示。
<img alt="土壤含水量图表；指数拟合、线性拟合。含水量与反射率关系；田间持水量、萎蔫点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig15.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 15"> 
图15：光谱反射率与体积含水量的关系。 
该图显示了实测含水量与光谱反射率的数据对，以及基于数据拟合的经验曲线（线性和指数曲线），拟合时排除了最高含水量数据（红色三角形）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig15large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
通过光谱强度区分较高的含水量变得困难。在含水量达到约 0.30 cm3 cm-3 时，可拟合出具有高 R2 值的显著回归关系（线性或指数型）。但土壤含水量更高时，无法可靠地通过强度值进行预测。其他研究也发现了反射率与含水量之间呈指数关系的类似现象，当含水量高于 0.30 cm3 cm-3 时，响应逐渐减弱30。
显示细尺度水分含量分布的根盒图像如图所示 图16有四个方面需要说明。第一，根箱中根系分布区域的含水量较低。第二，水分消耗最严重的区域集中在单条根轴附近。第三，即使在土壤表面未观察到根轴的位置，也出现了水分消耗区，表明这些区域存在隐藏于土壤内部的根系。第四，由于土壤呈团聚态，未经进一步图像处理的水分成像结果呈现斑块状分布。这种现象可能反映团聚体尺度上水分含量分布的不均一性，也可能受到土壤表面形貌对图像质量的影响。化学计量图像处理技术可用于消除光谱图像中的此类形貌干扰。31，但目前尚未在本文所使用的 Matlab 脚本中实现。
<img alt="神经元结构示意图；神经网络分析中树突分支的细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig16.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图16"> 
图16：根盒中的含水量分布图。 
深蓝色区域表示含水量高的区域，绿色至红色区域表示含水量低的区域。植物根系以黑色叠加在图像上。比例尺（左下角），2 cm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig16large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
应用示例
图17 将图像分析得到的定量根系性状与地上部分测量结果相关联。
<img alt="植物生长数据分析；根长、表面积比、干物质、气孔导度的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig17.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图17"> 
图17：根系数据的典型应用示例。 
(A) 和 (B) 展示了在表型分析背景下用于地上-地下植物特征描述的根系信息。(A) 表示甜菜品种Ferrara的根系生长情况，(B) 使用叶面积与根面积比（单次重复数据）比较了六种在根盒中生长的甜菜品种。(C) 和 (D) 为植物生理学研究中发现的性状之间的功能关系。(C) 显示叶面积与根面积比对干物质生产的影响力，(D) 显示根系表面积与气孔导度之间的关系。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig17large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
图17A 和 17B 与表型分析相关，重点关注地上部和地下部植物的全面表征。图17A 显示了甜菜品种Ferrara的根系生长情况（根系图像参见cf. 图8）。根系的扩展表明该品种在特定生育期内探索土壤体积的能力。图17B 显示了六个甜菜品种的叶面积与根面积比值，该指标可用于描述植物供应器官（根）与需求器官（叶）之间的平衡状态。
图17C 和 17D 给出了生理学研究中感兴趣的函数关系示例。图17C 显示了叶面积与根表面积之比与实验期间形成的干物质之间的关系，表明同化表面积作为干物质积累限制因素的主导作用。尽管R2值相对较高，但由于所用成对数据数量较少（n=6），该关系未达到显著性水平。图17D 表明，在整个实验过程中，根表面积较大（吸收能力更强）的品种平均具有更高的气孔导度。显然，较大的根表面积能够维持水分吸收，从而延长气孔开放时间。

本文介绍了一种利用RGB成像和高光谱成像评估土壤中生长的植物根系的实验方案。将RGB图像的时间序列与高光谱扫描的化学计量信息相结合，可优化对植物根系动态的深入理解。

用于植物表型分析与生理学研究的RGB与光谱根系成像：实验设置与成像方案

深入了解植物根系动态对于提高农业系统资源利用效率及增强作物抗性至关重要……

本实验的总体目标是通过结合不同的成像方法，获取在装有土壤的根盒中生长的植物根系的全面信息。该方法有助于回答植物表型分析与育种领域中的关键问题，例如不同根系构型对提高非生物胁迫抗性的贡献。该方法的主要优势在于，它将用于根系结构分析的RGB成像与用于根系功能分析的高光谱成像相结合。利用高光谱成像技术研究根系的潜力可拓展至多种根际参数，因为光谱信息能够揭示植物根系引起的微尺度理化变化。该方法的可视化演示至关重要，因为根箱填充步骤必须谨慎操作，否则将对根系生长和根系可见性产生不利影响。按照文本方案中的详细说明，首先准备根箱以填充基质。通过向 3,705 克干土中加入 400 克水，将干土预湿至重量含水量为 0.108 克/克。轻轻混合土壤和水，以获得均匀的水分分布。手动打碎较大的团聚体，使颗粒大小小于或等于两毫米。必须在气体观察窗附近形成均匀的土壤层，避免出现空气间隙。植物根尖若伸入空气间隙会迅速脱水。此外，水分布的光谱成像质量也会受到负面影响。将预湿润的土壤填充至开放的根盒中，并使用聚苯乙烯板轻轻压实，以覆盖盒体内部空间，从而获得1.3克/立方厘米的均一容重。通过喷雾瓶将剩余水量喷洒至土壤表面，以达到0.31立方厘米/立方厘米的目标含水量。确保液滴尺寸较小，以避免表面结构降解，并实现均匀润湿。喷雾过程中将盒子置于天平上，以监测实际添加到基底上的水量。让水重新分布10分钟，然后将玻璃压在表面，并用侧面的金属导轨固定。湿润基质的根盒平均终末重量为 17,818 ± 68 克。在气候室中配备八盏 LED 灯，提供光合光子通量密度为 450 微摩尔每平方米每秒、光谱峰值位于 440 和 660 纳米的均匀光照，以促进植物最佳生长。根据植物种类和实验需求设定环境参数后，用木板遮盖玻璃窗，使根区保持黑暗，避免光线透过玻璃表面引发藻类生长。然后使用合适的金属框架将根盒倾斜至45度角。这会因向重力性而最大限度促进根系向玻璃表面生长。进行RGB根系成像时，使用四个24瓦的荧光灯管，从距离根盒80厘米处进行照射。此外，在距离根盒20厘米处安装四个15瓦的紫外灯管，利用根系自发荧光，以应对根系与亮色基质背景之间对比度较低的情况。打开紫外灯，然后将待成像的根盒安装到成像箱的支架上。接下来，拍摄两张图像以覆盖根盒的上半部分和下半部分，重叠区域约为3厘米。按照文本方案中所述的方法获取并处理RGB图像。最后，对获取的根系RGB图像进行分析，并检查是否存在不匹配的区域。如果存在此类区域，应定义一个排除区域，然后重新启动分析。对于未分类的根系，添加额外的颜色类别并重新启动分析。对于被错误分类为根系的元素，启用或增强杂质和粗糙边缘的过滤选项。通过相机软件首先确定根盒扫描和白板标准的相机积分时间，以进行图像采集。为此，请打开成像图形用户界面，将相机移动至根盒中存在根系的区域。调整相机的积分时间，使软件显示的直方图中，相机全动态范围的大约85%被一个明亮物体所占据。针对不同基质和根系组织正确设置积分时间，对于充分利用红外相机的动态范围至关重要，可避免因超出其范围而导致信息丢失。在关闭相机软件之前，将相机定位系统移至对准白色标准板的位置，重复上述操作以获取白色标准图像。随后打开Matlab成像图形用户界面（GUI），输入当前根盒扫描的所有设置参数。每天每次成像运行前，均需采集一次暗标准和白色标准图像。暗标准代表相机噪声，而白标准提供最大反射率。这些数据在预处理过程中的图像归一化步骤中必需。确定是扫描整个根箱，还是仅扫描其部分区域。在当前情况下，需对整个根箱进行成像，然后开始扫描。对于基于光谱的含水量测量，需要使用校准根箱。使用聚苯乙烯板将根箱划分为5厘米的区室，并填充不同含水量的土壤。采用与种植根箱相同的设置对校准根箱进行扫描。例如，为结合根系与地上部分性状，可获取叶面湿度计以测量气孔导度。在气候室中将设备平衡至环境条件至少一小时。每株植物至少取三片叶片进行测量。此处展示的是基于RGB成像的甜菜品种Ferrara的代表性根系生长图像。播种后35天，植物根系已伸长至根盒底部。根盒顶部的一些根轴无法从RGB图像中分割出来。较老的基部根系因衰老而变为棕色。因此，基于颜色阈值的分割方法无法有效区分这些根系与土壤背景。采用高光谱成像技术，可根据根系前景与土壤背景的不同光谱特征进行分割，从而提升分割效果。测量得到的根长与人工追踪参考图像之间的差异仅为1.5%。此外，光谱成像可实现根系周围水分含量的精细定位，从而推断水分吸收情况。图中根系骨架以黑色显示，较亮区域表示靠近根轴处水分耗竭较高的区域。较深的蓝色区域代表根系无法触及的区域中土壤含水量较高的部分。观看本视频后，您应充分了解如何正确填充根际盒，以确保根系良好生长和清晰可见。这是后续成像及获得代表性根系表型结果的基础。完成此操作后，可进一步采用其他光谱分类方法（如K-means聚类或支持向量机），以获取关于根系及根际特性的深入信息，例如根系衰老与分解过程。该技术建立后，即可全面表征根系系统及其对非生物胁迫的响应。一组10个品种可在总实验周期少于三个月的时间内完成表征。

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